一种血管紧张素转化酶2的检测试剂盒的制作方法

1.本发明属于体外诊断试剂技术领域，尤其涉及一种血管紧张素转化酶2的检测试剂盒。


背景技术：

2.血管紧张素转化酶2(ace2)是2000年发现的与ace具有较高同源性的多效单羧肽酶，其主要功能是直接水解血管紧张素ⅱ(angⅱ)生成血管紧张素1-7[ang(1-7)]。ace 2的发现打破了肾素－血管紧张素系统(ras)代谢通路中ace－angⅱ－at1轴起主要生物效应的传统观点。
[0003]
ace2是一种锌离子依赖性的金属蛋白酶，由805个氨基酸组成，分子质量约120ku。其催化结构域与ace大约有42％的同源性，包括4个部分，即n端信号肽、具有催化活性的胞外结构域、跨膜区和c端胞内结构域。ace2与ace的分布一致，在体内广泛地发挥负性调节ras系统的作用。在ace分布的大部分组织均有ace2的分布，如心脏、肾脏、睾丸、胎盘、结肠、小肠，大鼠脑、肺、脂肪、肝脏、胰腺、视网膜等。但与ace相比，ace2的mrna表达却不像ace那样广泛，其具有高度的组织特异性，主要分布于冠状动脉、肾血管内皮和肾小管内皮。
[0004]
ace2是一个极其关键的心脏功能调节因子，研究结果表明血清ace2水平在冠心病(chd)患者中升高，并且随chd患者冠状动脉狭窄严重程度的恶化而升高，但ace2并不是chd独立影响因素。这说明chd在发生发展过程中促进了血清中ace2水平的提高，血清ace2水平可以作为冠心病预后的一个指标，但不能作为冠心病患病与否的判定指标。也有研究表明，ace2对急性肾损伤、肝损伤以及肝代谢中都发挥着重要的作用。
[0005]
对于ace2检测方法的研究刚刚处于起步阶段，现有的ace2的检测技术有酶联免疫吸附测定(elisa)法、pcr法，传统的elisa方法应用较为普遍，但测定过程操作繁琐、操作时间长、自动化程度低、重复性和批间差相对较大，不能适应大体量样本的筛查，且该方法应用时需配备多种专用设备，在一定程度上也增加使用成本。pcr方法操作繁琐、成本及对人员要求较高，现较多应用于实验室阶段。
[0006]
为了解决现有技术中存在的以上问题，我们提出一种血管紧张素转化酶2的检测试剂盒。


技术实现要素：

[0007]
本发明的目的在于提供一种血管紧张素转化酶2的检测试剂盒，其操作简便快捷、检测稳定性和重复性好、可应用于全自动生化仪，实现自动化操作和自动化分析、且使用成本相对降低，从而弥补上述背景技术中的不足。
[0008]
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种血管紧张素转化酶2的检测试剂盒包含试剂r1、试剂r2和血管紧张素转化酶2校准品；其中，
[0009]
所述试剂r1包括以下含量的组分：
[0010][0011]
所述试剂r2包括以下含量的组分：
[0012][0013][0014]
所述试剂r1和试剂r2中缓冲液的ph值为6.0～8.0；
[0015]
所述血管紧张素转化酶2校准品包括以下含量的组分：
[0016][0017]
所述血管紧张素转化酶2校准品中缓冲液的ph值为6.0～8.0。
[0018]
优选的，所述缓冲液选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸(tris-hcl)缓冲液、硼酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、good's缓冲液中的一种或几种。
[0019]
优选的，所述稳定剂选自牛血清白蛋白、甘露糖、甘露醇、海藻糖、明胶、蔗糖中的一种或几种。
[0020]
优选的，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氟化钠中的一种或几种。
[0021]
优选的，所述表面活性剂选自tween-20、tween-40、triton-100中的一种或几种。
[0022]
优选的，所述促凝剂选自聚乙二醇4000、聚乙二醇6000、聚乙二醇8000和聚乙二醇20000中的一种或几种。
[0023]
优选的，所述助悬剂为海藻酸钠。
[0024]
优选的，所述防腐剂选自叠氮钠、proclin300和柠檬酸钠、咪唑烷基脲的一种或几种。
[0025]
优选的，所述抗人血管紧张素转化酶2(ace2)抗体选自羊抗人、鼠抗人、兔抗人抗人血管紧张素转化酶2(ace2)抗体中的一种。
[0026]
优选的，所述抗人血管紧张素转化酶2(ace2)抗体包被胶乳颗粒的粒径为100～220nm，其制备方法包括以下步骤：
[0027]
(1)取1ml～3ml的表面羧基化、直径100～220nm的聚苯乙烯胶乳溶液加入到10ml的pbs缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为1.0％；
[0028]
(2)加入0.1～1mg抗人血管紧张素转化酶2(ace2)抗体以及20mg～40mg活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)，在37℃孵育2～4小时，通过活化的羧基与胶乳颗粒溶液进行化学交联，形成共价抗体胶乳复合物；
[0029]
(3)然后，加入10～20ml的0.1％的bsa溶液在37℃条件下封闭0.5～2小时，封闭胶乳颗粒表面未结合抗体的表面活性基团，再以12000rpm离心20～50分钟，去除上清，所得沉淀加入含0.1％bsa的30mmol/l tris-hcl缓冲液洗涤、分散即得抗人血管紧张素转化酶2(ace2)抗体包被胶乳溶液。
[0030]
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的血管紧张素转化酶2(ace2)检测试剂盒说明简单、易操作，能够直接采用全自动生化分析仪进行样本检测，能满足临床实验室高通量快速检测样本的需求，同时可减少人为误差使检验效率明显提高；试剂盒采用胶乳免疫比浊法，使得试剂灵敏度和准确性有进一步提高，因此在临床上有较大的应用空间，可广泛推广应用大多数临床实验室。
附图说明
[0031]
图1为本发明实施例1与对比试剂盒检测结果相关性图；
[0032]
图2为本发明实施例2与对比试剂盒检测结果相关性图；
[0033]
图3为本发明实施例3与对比试剂盒检测结果相关性图。
具体实施方式
[0034]
除有明确定义外，以下实施例中所用的技术术语与本发明所属领域技术人员普遍理解的含义相同。以下实施例中所用的实验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0035]
下面结合实施例来详细说明本发明。
[0036]
实施例1：
[0037]
试剂r1：ph值为6.5
[0038][0039]
试剂r2：ph为6.5
[0040][0041]
校准品：ph6.5
[0042][0043]
按照需要的校准品浓度将相应量的血管紧张素转化酶2(ace2)抗原添加到上述校准品溶液中，制备得到血管紧张素转化酶2(ace2)校准品。
[0044]
本实施例配制6个不同浓度的校准品，分别为：0ng/l、200ng/l、500ng/l、1000ng/l、2000ng/l、4000ng/l。
[0045]
实际交付时可以带一个高值校准品，客户按说明自己倍比稀释；也可以配制多个不同浓度的校准品直接放在试剂盒里，用校准品这6个点做校准曲线，实例中测值是仪器测试样品在校准曲线上计算得出。
[0046]
实施例2：
[0047]
试剂r1：ph值为7.0
[0048][0049]
试剂r2：ph值为7.0
[0050][0051]
校准品：ph值为7.0
[0052][0053]
按照需要的校准品浓度将相应量的血管紧张素转化酶2(ace2)抗原添加到上述校准品溶液中，制备得到血管紧张素转化酶2(ace2)校准品。
[0054]
本实施例配制6个不同浓度的校准品，分别为：0ng/l、200ng/l、500ng/l、1000ng/l、2000ng/l、4000ng/l。
[0055]
实施例3：
[0056]
试剂r1：ph值为6.5
[0057][0058]
试剂r2：ph值为6.5
[0059][0060]
校准品：ph值为6.5
[0061][0062][0063]
按照需要的校准品浓度将相应量的血管紧张素转化酶2(ace2)抗原添加到上述校准品溶液中，制备得到血管紧张素转化酶2(ace2)校准品。
[0064]
本实施例配制6个不同浓度的校准品，分别为：0ng/l、200ng/l、500ng/l、1000ng/l、2000ng/l、4000ng/l。
[0065]
上述各实施例中，所述包被抗人血管紧张素转化酶2(ace2)抗体胶乳颗粒的粒径为100～220nm。制备方法包括以下步骤：
[0066]
(1)取适量的表面羧基化、直径100～220nm的聚苯乙烯胶乳溶液加入到10ml的pbs缓冲液中，使胶乳颗粒终浓度为1.0％；
[0067]
(2)加入适量抗人血管紧张素转化酶2(ace2)抗体以及活化剂1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(edc)，在37℃孵育3小时左右，通过活化的羧基与胶乳颗粒溶液进行化学交联，形成共价抗体胶乳复合物；
[0068]
(3)然后，加入适量的0.1％的bsa溶液在37℃条件下封闭1小时，封闭胶乳颗粒表面未结合抗体的表面活性基团，再以12000rpm离心40分钟，去除上清，所得沉淀加入含0.1％bsa的30mmol/l tris-hcl缓冲液洗涤、分散即得抗人血管紧张素转化酶2(ace2)抗体包被胶乳溶液。
[0069]
1、检测方法：
[0070]
上述实施例1-3使用日立labospect 006全自动生化分析仪，利用终点法进行检测，检测波长570nm，上机参数如表1。检测样本前使用纯化水做试剂空白。
[0071]
表1试剂检测参数
[0072][0073]
结果计算：
[0074]
ace2含量(ng/l)＝(δa样本/δa校准品)
×
校准品浓度。
[0075]
2、重复性试验
[0076]
以各实施例的校准品和标示值为932ng/l的人血清作为样本，对各实例中的试剂盒进行重复性考察，按要求测定方法分别重复测定10次，分别计算测定平均值x、标准偏差sd及变异系数cv，以对各实施例中的试剂盒进行重复性进行考察，测定结果见表2。
[0077]
表2重复性试验结果
[0078][0079][0080]
根据表2结果可以看出，实施例1、实施例2、实施例3的cv均＜5％，其中实例1的重复性结果最理想。
[0081]
3、准确度试验
[0082]
以各实施例的试剂盒和校准品与对照试剂盒(市售某厂家的酶联免疫法ace2检测试剂盒，简称“elisa试剂盒”)同时测试检测40个人血清样本，统计检测结果，计算两者的相关系数，并进行线性回归，对检测结果进行相关性分析，以对各实例中的试剂盒进行准确度考察，测定结果见表3。
[0083]
表3准确度试验结果(ng/l)
[0084]
[0085]
[0086][0087]
根据表3结果可以看出，实施例1、实施例2、实施例3的相关系数均小于0.975，说明本发明各实施例的试剂盒具有较高的准确性，其中实施例1的相关性为0.9979，实施例1试剂盒检测结果与elisa试剂盒相关性最好。相关性拟合曲线见附图1-3。
[0088]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。