飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法及装置

1.本发明涉及一种飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法及装置，特别是可实现多尺度连续观测细胞加工过程的实时反馈方法及装置，属于细胞加工观测领域。


背景技术：

2.利用超快激光加工细胞可实现高精度细胞刺激、穿孔等无损及微创细胞加工过程，可广泛应用于干细胞培育、基因治疗研究等生物医疗领域。飞秒激光加工细胞的过程是一个非平衡的非线性的动态过程，加工作用过程与机理还有待进一步深入研究与讨论。在不同时间尺度下，飞秒激光与细胞相互作用过程的电子动态演化过程是不同的，另外，诸如激光通量、频率等参数对细胞加工的动态调控过程，对细胞的损伤、后续存活、生长或变异的影响起到关键作用。对这些不同时间尺度内激光与细胞的作用过程进行观测，将有利于阐释加工机理，提高加工效率。并且生物细胞特异性决定了加工过程的不可重复性，因此需要进行超快时间内的连续观测，才能精准捕获加工过程中的关键信息。但目前的激光加工细胞过程通常只可以利用激光共聚焦成像或超声检测等方法进行加工后的观测，无法对飞秒激光加工细胞过程进行实时连续观测，因此严重制约着对细胞加工过程的精准调控。


技术实现要素：

3.本发明的目的是为了解决飞秒激光加工细胞过程中的难以精确调控以及快速检测的问题，提供一种飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法及装置，基于超快脉冲序列的超快连续成像系统，时间分辨率可达到飞秒量级，能够连续实时观测具有生物特异性的细胞调控加工过程，同时采集细胞尺寸形态，利用细胞图像处理提取细胞尺寸数值，通过协同控制器与时域展宽方法耦合，获取细胞加工过程中的纳秒至毫秒量级时间尺度内的探测图像信息，得到多尺度观测系统，建立细胞调控加工-检测的反馈机制，实现对加工过程的快速检测以及精准调控，利用个体细胞的具体图像指导飞秒激光加工细胞的技术优化，实现高精度、高效率、低损伤、可控性好的超快激光调控加工细胞应用。
4.本发明是通过下述技术方案实现的：
5.本发明公开的飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法，包括如下步骤：
6.步骤一、由超短脉冲激光器产生的超快激光经过多频脉冲序列产生器后变为具有飞秒量级时间延时的脉冲序列，通过分束的方法被分成两束，其中一束通过物镜进行聚焦，作用在微流控器件所控制细胞流速的细胞样本上，进行细胞的多频脉冲飞秒激光无损或微创调控加工；另一束激光脉冲序列通过样本后，携带有超快信息，由ccd接收，生成超快连续图像并储存于电脑中；
7.步骤二、提取步骤一中ccd相机拍摄到的约束于微流芯片中的细胞图像，每张图像中包含一个或多个细胞，经过细胞图像处理方法计算出细胞等效直径数值d，输出至协同控制器中。计算出时域展宽探测图像的时间分辨率t为激光重复频率f的倒数，即f＝1/t。根据所需探测图像的时间跨度t以及细胞等效直径d与细胞流速v的匹配关系式：计算出
细胞流速v，设置微流控器件的参数，实现对探测过程的反馈调节；
8.步骤三、协同控制器触发时域展宽脉冲发生器，产生步骤二计算所得的重复频率为f的脉冲激光，经过时域展宽产生具有纳秒至毫秒量级范围内任意时间延时的激光脉冲，作用于样品后由图像探测器与信号发生器收集到细胞在该时间分辨率下的时域展宽探测图像，存储于电脑中，结合ccd相机接收到的超快连续图像，得到多尺度细胞连续观测信息，观测细胞生物反应过程，指导飞秒激光细胞加工的优化。所述细胞生物反应过程包括细胞形态、细胞流动、细胞膜穿孔、愈合。
9.所述步骤二中细胞图像处理方法的具体实现方法为：
10.(1)将步骤一中的包含细胞形貌的超快连续图像转换成灰度图片，绘制出图像的灰度直方图；
11.(2)从直方图的波谷选择一个阈值做二值切分，将图片处理成二值化图像；
12.(3)将二值化图像中的孔洞填充，将细胞之间的连接线删除，实现分割细胞粘连目的；
13.(4)进行形态学开运算，提高图像视觉圆滑效果；
14.(5)计算出每个细胞覆盖面积的大小，排除面积太小或太大的块轮廓；
15.(6)然后求连通域重心以及在重心坐标点描绘数字，最终生成细胞计数标记图像；
16.(7)输出细胞等效直径d。
17.本发明公开的一种飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈装置，用于实现所述本发明公开的一种飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法，所述多尺度连续观测反馈装置，包括超短脉冲激光器、多频脉冲序列产生器、加工物镜、用于控制细胞样本流动速度的微流控器件、协同控制器、时域展宽脉冲产生器、空间分光器、空间光合束器、图像探测器、若干分束镜、ccd相机和计算机。由超短脉冲激光器产生的超快脉冲激光经过多频脉冲序列产生器转化为由具有时间延时的若干多频脉冲组成的脉冲序列，经过分束镜被分成两束，其中一束通过加工物镜用于对细胞进行激光加工过程，另一束经过样本后，采集细胞加工过程的飞秒时间尺度内的细胞信号，携带有成像信息的不同频率脉冲激光通过若干分束镜分离，进入ccd相机采集信号，生成超快连续图像存储于计算机中。上述图像经过细胞图像处理方法识别出细胞等效直径至协同控制器中，随后，根据步骤二中的重复频率计算方法计算时域展宽脉冲产生器的激光脉冲重复频率，与所需细胞流速，调节微流控器件的参数以调节细胞流速，利用协同控制器触发时域展宽脉冲产生器后使其产生具有纳秒至毫秒量级时间延时的不同频率的脉冲激光，利用空间分光器将不同频率的脉冲分离并作用在样本上，收集到细胞加工过程的纳秒至毫秒内任一时间尺度的信号，利用空间光合束器汇聚不同时刻脉冲激光携带的成像信息于相同空间位置，依次通过图像探测器接收信号，形成时域展宽探测图像并存储于计算机中。经计算机处理后，得到多尺度细胞加工成像信息，观测到细胞加工过程中的光刺激、烧蚀过程，反馈细胞加工过程及结果。所述多尺度包括飞秒、纳秒、微秒或毫秒。
18.所述超短脉冲激光器为能够产生单一波长且脉冲宽度为飞秒量级激光的超快激光器。
19.所述多频脉冲序列产生器包括色散装置、延时装置、分束镜、反射镜、物镜；所述色散装置为非线性晶体或光纤；所述延时装置为石英薄片或光栅。
20.所述协同控制器利用步骤二中的重复频率计算方法，通过计算细胞等效直径、时域展宽脉冲发生器的激光重复频率以及细胞流速关系，设置时域展宽脉冲产生器的激光重复频率，控制时域展宽脉冲作用在细胞上的频率，使时域展宽探测图像的时间分辨率达到纳秒或毫秒量级。
21.所述时域展宽脉冲发生器为能够产生预定中心波长的高重频脉冲激光器与棱镜的组合，产生展宽的激光脉冲。
22.所述图像探测器根据时间分辨率的不同为高速摄像机，或者是光电探测器与示波器的组合。
23.有益效果：
24.1、本发明公开的飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法，通过将飞秒激光超快连续成像与时域展宽图像探测方法耦合至飞秒激光细胞加工过程中，配合细胞图像与激光频率的协同控制，获取飞秒激光细胞加工过程在纳秒、微秒甚至毫秒时间尺度范围内的信息，实现对飞秒激光加工细胞过程的实时多尺度连续观测。
25.2、本发明公开的飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法，通过观测不同时刻飞秒激光与细胞的超快动力学作用过程，弥补对不可重复的细胞加工过程进行飞秒时间尺度的连续摄像的空白。
26.3、本发明公开的飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法，通过精确控制成像信息分辨力，实时获得每个细胞的强度图和高分辨状态图像，通过获得的所述细胞数据信息结合图像处理方法，建立细胞调控加工-检测的反馈机制实时反馈加工效果，能够深入研究激光调控细胞加工方法，及时调整加工参数，最终实现高精度、高效率、低损伤、可控生物影响的超快激光调控加工细胞应用。
附图说明
27.图1为本发明的飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法流程示意图。
28.其中：1—超短脉冲激光器、2—多频脉冲序列产生器、3—分束镜、4—物镜、5—受微流控器件约束的细胞样本、6-9—反射镜、10—ccd相机、11—计算机、12—协同控制器、13—时域展宽脉冲产生器、14—空间分光器、15—空间光合束器、16—图像探测器。
具体实施方式
29.为了更好的说明本发明的目的和优点，下面结合附图和实例对发明内容做进一步说明。
30.实施例1
31.为实现对飞秒激光加工细胞过程中不同时间细胞状态以及超快动力学特征进行观测，利用本实施例公开的一种飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法，包括如下步骤：
32.步骤一、由超短脉冲激光器产生的超快激光经过多频脉冲序列产生器后变为具有飞秒量级时间延时的脉冲序列，通过分束的方法被分成两束，其中一束通过物镜进行聚焦，作用在微流控器件所控制细胞流速的细胞样本上，进行细胞的多频脉冲飞秒激光无损或微创调控加工；另一束激光脉冲序列通过样本后，将携带有超快信息的光由ccd接收，生成超
快连续图像并储存于电脑中；
33.步骤二、提取步骤一中ccd相机拍摄到的约束于微流芯片中的细胞图像，每张图像中包含一个或多个细胞。利用细胞图像处理算法首先将包含细胞的图像转换成灰度图片，绘制出图像的灰度直方图，然后从直方图的波谷选一个阈值做二值切分，将图片处理成二值化图像，调用孔洞填充函数将二值化图像中的孔洞填充，并将细胞之间的连接线删除，从而有效分割细胞粘连，再进行形态学开运算，提高图像视觉圆滑效果，计算出每个细胞覆盖面积的大小，排除面积太小或太大的块轮廓，然后求连通域重心以及在重心坐标点描绘数字，最终生成细胞计数标记图像，完成整个图像处理过程并输出细胞等效直径。将上述细胞图像处理方法计算出细胞等效直径数值d输出至协同控制器中；计算出时域展宽探测图像的时间分辨率t为激光重复频率f的倒数。根据所需探测图像的时间跨度t以及细胞等效直径d与细胞流速v的匹配关系式计算出细胞流速v，设置微流控器件的参数，实现对探测过程的反馈调节；
34.步骤三、协同控制器触发时域展宽脉冲发生器，产生步骤二计算所得的重复频率为f的脉冲激光，经过时域展宽产生具有纳秒时间延时的激光脉冲，经空间和时间分离后作用于流动的样品上，每一束激光脉冲均携带一部分样品成像信息，经空间合束后由图像探测器与信号发生器收集到细胞在该时间分辨率下的时域展宽探测图像，存储于电脑中。结合ccd相机接收到的超快连续图像，得到多尺度细胞连续探测信息，可直接观测到细胞形态、细胞流动、细胞膜穿孔、愈合等生物反应过程，通过图像的方式直观揭示细胞被飞秒激光辐照后产生的形态变化，可分析出飞秒激光与细胞膜、细胞器作用的超短时间内的连续演化过程。
35.本实施例公开的一种飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈装置，用于实现所述本实施例公开的一种飞秒激光加工细胞的多尺度连续观测反馈方法，所述多尺度连续观测反馈装置及装置工作方法为：由超短脉冲激光器1产生的超快脉冲激光经过多频脉冲序列产生器2转化为由具有一定时间延时的若干多频脉冲组成的脉冲序列，经过分束镜3被分成两束，其中一束通过加工物镜4用于对细胞进行激光加工过程，另一束经过样本5后，采集细胞加工过程的飞秒时间尺度内的细胞信号，携带有成像信息的不同频率脉冲激光通过若干分束镜6-9分离，进入ccd相机10采集信号，并将超快连续图像存储于计算机11中。利用细胞图像处理方法将上述包含细胞形貌的超快连续图像转换成灰度图片，绘制出图像的灰度直方图，接着将图片处理成二值化图像，进一步地分割细胞粘连并提高图像视觉圆滑效果，接着计算出每个细胞覆盖面积的大小，生成细胞计数标记图像最后输出细胞等效直径。根据步骤二中的计算方法，计算出调控时域展宽脉冲产生器13的激光脉冲频率以及细胞流速，由协同控制器12触发使时域展宽脉冲产生器13产生具有纳秒量级时间延时的不同频率的脉冲激光，利用空间分光器14将不同频率的脉冲分离并作用在样本5上，收集到细胞加工过程的纳秒时间尺度范围内的信号，利用空间光合束器15汇聚不同时刻脉冲激光携带的成像信息于相同空间位置，依次通过图像探测器16接收信号，形成时域展宽探测图像并存储于计算机11中。经计算机处理后，得到由飞秒至纳秒多尺度细胞加工成像信息，观测到细胞加工过程中的光刺激、烧蚀过程，也可用于观测细胞形态、细胞流动、细胞膜穿孔、愈合等生物反应过程，指导细胞加工技术的优化。
36.本实施例具体实施过程为：
37.由脉冲激光器1产生波长为800nm，脉冲宽度为35fs的超短脉冲激光，超短脉冲经过多脉冲序列产生器2，具体为通过光子晶体光纤，将中心波长为800nm的超短脉冲展宽为覆盖400nm-1100nm波段的超连续谱激光脉冲，经过色散延时介质石英薄片，产生波长分别为400nm、600nm、800nm、1000nm的4个激光脉冲组成的脉冲序列，相邻脉冲间的时间延时为200fs。上述脉冲序列经过第一分束镜3后分为两路，一路经由物镜4聚焦在细胞样本5上，样本5由微流控器件约束并控制流速；另一路激光脉冲序列按照延时顺序作用在样本5上，携带不同加工时刻的细胞成像信息经过4个分束镜6-9后将四束脉冲激光从空间上分离，通过ccd相机10成像，得到细胞在激光加工0fs、200fs、400fs以及600fs时的超快连续图像，储存到计算机11中。
38.利用细胞图像处理方法对上述成像进行处理，利用细胞图像处理算法首先将包含细胞的超快连续图像转换成灰度图片，绘制出图像的灰度直方图，然后从直方图的波谷选一个阈值做二值切分，将图片处理成二值化图像，调用孔洞填充函数将二值化图像中的孔洞填充，并将细胞之间的连接线删除，从而有效分割细胞粘连，再进行形态学开运算，提高图像视觉圆滑效果，计算出每个细胞覆盖面积的大小，排除面积太小或太大的块轮廓，然后求连通域重心以及在重心坐标点描绘数字，输出单个细胞等效直径约为10μm。为得到1ns时间分辨率且探测图像的时间跨度为10ns的细胞加工信息，计算得出此时时域展宽脉冲发生器的重复频率应为109hz，微流控器件的细胞流速应为103m/s，调节微流控器件的细胞流速为上述数值。时域展宽脉冲发生器13为高重频脉冲激光器与棱镜的组合，由协同控制器12控制，产生重复频率为109hz，中心波长为800nm的激光，经过棱镜的色散，波长范围为790nm-810nm的脉冲激光在时间上被分离，经过展宽的脉冲激光通过空间分光器14在空间位置上被分离，此处空间分光器选择为光栅，作用在流动的样本5上，其中810nm的激光最先到达样本处，790nm的激光最后到达样本处，脉冲激光携带样本成像信息，经过必要的反射镜进入空间光合束器15，将不同时刻不同空间位置的脉冲激光汇聚至图像探测器16同一位置上，此时图像探测器16为光电探测器及配套示波器，每一束激光脉冲携带细胞样本一部分信息，经过拼接形成时域展宽探测图像最终存储于计算机11中。结合飞秒尺度超快连续图像中细胞在不同时间延时下受激光刺激形成的形貌变化，观察到细胞膜在激光作用下产生凹陷及改性，根据时域展宽探测图像得到飞秒激光加工细胞的1纳秒后细胞膜产生规则穿孔，反馈了该飞秒激光加工过程对于该细胞的膜穿孔是有效的，可以作为细胞转染等生物过程的预处理方法，实现生物检测等应用。
39.实施例2
40.为了检测不同激光通量对于激光加工细胞后细胞活性的影响，搭建的装置与实施过程如下：由脉冲激光器1产生波长为800nm，脉冲宽度为50fs的超短脉冲激光，超短脉冲经过多脉冲序列产生器2，具体为通过非线性晶体的展宽和光纤的色散，产生波长分别为650nm、800nm、950nm的3个激光脉冲组成的脉冲序列，相邻脉冲间的时间延时为300fs。上述脉冲序列经过第一分束镜3后分为两路，一路经由物镜4聚焦在细胞样本5上，样本5由微流控器件约束并控制流速，此时照射在细胞上的激光通量为0.5mj/cm2；另一路激光脉冲序列按照延时顺序作用在样本5上，携带不同加工时刻的细胞成像信息经过4个分束镜6-9后将四束脉冲激光从空间上分离，通过ccd相机10成像，得到细胞在激光加工0fs、300fs、600fs时的超快连续图像，记录到计算机11中，用以表征细胞的超快动力学过程。接下来，利用细
胞图像处理算法对上述细胞超快连续图像进行处理，进行灰度处理、细胞分割、细胞填充、面积识别计算，最终输出单个细胞等效直径约为20μm，此时微流控器件的细胞流速为10m/s，为得到1μs时间分辨率以及时间跨度为2μs的探测图像，时域展宽脉冲激光的频率为108hz，将微流控器件速度设置为10m/s。时域展宽脉冲发生器13为高重频脉冲激光器与棱镜的组合，由协同控制器12控制，根据上述计算结果，产生重复频率为108hz，中心波长为800nm的激光，经过棱镜的色散，波长范围为790nm-810nm的脉冲激光在时间上被分离，经过展宽的脉冲激光通过空间分光器14在空间位置上被分离，此处空间分光器选择为光栅，作用在流动的样本5上，其中810nm的激光最先到达样本处，790nm的激光最后到达样本处，脉冲激光携带样本成像信息，经过必要的反射镜进入空间光合束器15，将不同时刻不同空间位置的脉冲激光汇聚至图像探测器16同一位置上，图像探测器16为高速摄相机，拍摄到的细胞信息最终输出存储于计算机11中。结合飞秒尺度超快连续成像信息，得到飞秒激光加工细胞过程中飞秒时间尺度内细胞发生受激形态改变，以及2μs后能表明细胞活性的多时间尺度的实时加工结果，根据结果判断该加工参数下细胞已经受损，及时调整参数，减小脉冲激光器1的功率为原来的50％，使得聚焦在样本5上的激光通量为0.25mj/cm2，再次重复上述加工观测过程，从超快连续图像及时域展宽探测图像中分析信息，实现对细胞加工结果的实时反馈和加工参数的优化，得到激光通量对飞秒激光加工细胞的效果影响规律，支撑高精度无损加工细胞的技术发展，并解决该领域相关工程技术问题。
41.以上所述的具体描述，对发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。