基于氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门设计及应用研究

1.本发明涉及一种电化学生物传感方法及其应用，尤其是涉及基于氧化锌纳米粒子的电化学传感器制备及其在蔗糖、蔗糖酶及葡萄糖氧化酶相关“二进制”逻辑电路设计的应用研究，属于功能生物材料和生物传感技术领域。


背景技术：

2.糖是食品和饮料的甜味来源，在食品饮料工业中具有相当大的商业价值。过度饮用含糖饮料可能会导致体重过度增加并引发糖尿病，还会增加患慢性健康后果的风险。糖尿病研究和临床实践，国际糖尿病联合强调，全球有4.5亿成年人患有糖尿病，儿童和青年都有较高的发病率。因此，连续、准确、快速的检测血液中葡萄糖的浓度和检测食物中糖的含量对于控制和预防糖尿病十分重要。基于以上原因，众多的科研工作者一直致力于开发和研究高性能的葡萄糖传感器，而对与其相关的蔗糖酶(inv)、葡萄糖氧化酶(go
x
)及其生物信号通路研究十分有限。开发一种新方法实现go
x
和inv介导的生物信号通路研究对临床诊断和药物开发有着十分重要的意义。
3.逻辑门是电子和数字电路的基本组成部分，其逻辑操作的执行是利用一个或多个逻辑输入信号产生一个或多个逻辑输出信号，以两种二进制状态(0，1)表示，是数字世界中不可或缺的组件。超分子、有机分子、核酸、蛋白质和聚合物等都可被用作模拟逻辑操作的输入信号，利用输入输出状态可以设计分子逻辑门的小型开关，将生物传感器作为分子逻辑门用于医学诊断的想法推动了该领域的发展。发展简单且易于编程和操作的分子逻辑系统对inv和go
x
介导的生物信号通路研具有重要意义，有利于生物分子的检测、分子器件的构建以及生物计算技术的发展。
4.dnazyme是通过体外筛选从组合寡核苷酸库中分离出来的核酸，但是性质与蛋白质酶类似，对特定底物具有较高的催化水解裂解活性，而且比酶更稳定，可以多次变性和复性而不会失去对底物的催化活性。本发明针对生物信号通路中所涉及的inv和go
x
设计了许多“二进制”逻辑门，该方法采用氧化锌纳米粒子(zno nps)遇酸降解的性质，而生物信号通路中经历go
x
和inv酶催化反应后溶液会呈现一定酸性，此时zno nps遇酸降解释放出zn
2+
，zn
2+
可作为dnazyme切割扩增反应的因子，基于此构建了系列氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门(yes、no、and、inhibit和and-inhibit)，以期实现蔗糖、go
x
和inv的分析监测，在生物医学领域具有重要意义。至今为止，未见基于氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门设计并将其应用于go
x
和inv相关生物信号通路研究的报导。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门设计及应用研究。
6.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门设计及应用研究，具体步骤如下：
7.(1)氧化锌纳米粒子(zno nps)的制备
8.溶液a：将10～50mg zn(no3)
·
6h2o和50～100mg聚乙二醇(peg)加入10～15ml超纯水中，超声混匀；溶液b：取70～88mg koh加入7～8ml超纯水中形成。控制温度为40～50℃，将溶液b滴加到溶液a中，滴加完成后超声保温10～20min，离心、洗涤、重新分散于1～5ml超纯水中，即可得到zno nps。
9.(2)蔗糖酶及葡萄糖氧化酶反应液的制备
10.酶反应液制备(总体积为50～100μl)：含50～100μm蔗糖、100～600mu/ml蔗糖酶、100～400mu/ml葡萄糖氧化酶、0.1～1mm nacl、适量o2(溶液中o2与空气中o2达到平衡)，将混合溶液置于30～37℃下反应1～2h。
11.(3)电化学生物传感器的制备
12.a.将金电极(au，直径为1～3mm)在麂皮上用粒径0.01～0.05μm的三氧化二铝粉末抛光0.5～5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用超纯水超声清洗1～5min，然后用n2吹干，记为电极1；
13.b.zn-dnazyme溶液制备(总体积为10～100μl)：含0.1～1μm dna1(zn-dnazyme)、0.1～1μm dna2(zn-sub dna)、0.1～1mm三(2-羧乙基)膦溶液(tcep)、10～50mm kcl和1～10mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(hepes)，将该混合溶液置于30～37℃下反应0.1～1h，随后将1～5μl反应液滴到au上于4℃过夜，之后用mch处理电极替换非特异性吸附探针，记为电极2。将(1)中1～5μl zn
2+
溶液滴入电极2表面，于30～37℃下反应0.1～1h，记为电极3。然后，再将dna3滴入电极3表面，于30～37℃下反应0.1～1h，记为电极4。随后，制备信号溶液(总体积为10～100μl)：含0.1～1mm甲基蓝溶液(mb)、0.1～1μm dna4、0.1～1μm dna5、10～50mm kcl和1～10mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(hepes)，将1～5μl混合液滴入电极4表面，于30～37℃下反应1～2h，记为电极5。从电极1到电极5的制备进程中，每完成一个修饰步骤，均需用超纯水缓缓冲洗电极以除去未反应或未接枝完全的试剂。
14.c.为了构建蔗糖酶或是葡萄糖氧化酶电化学生物传感器，将(1)中制备的1～2μl zno nps溶液与(2)中2～18μl酶反应液混合并于30～37℃反应1～2h。在b中电极3制备过程中，取1.5～5μl该反应液滴入电极2上，于30～37℃下反应0.5～1h，其他的实验步骤同b。改变酶反应体系中蔗糖含量(0～1000μm)、蔗糖酶含量(0～1000mu/ml)和葡萄糖氧化酶含量(0～500mu/ml)，其他步骤同上，可以实现蔗糖、葡萄糖氧化酶、蔗糖的定量监测。
15.本专利涉及五条dna(1，2，3，4和5)，其序列为：
[0016][0017]
利用上述基于氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门设计及应用研究，采用方波伏安法对信号单元中mb进行检测，设置电位范围为-0.4～-0.1v，振幅为15hz，由于zn
2+
的生成引导了整个体系的完成，而酶反应溶液又能促进zn
2+
的生成，因此能够获得一系列不同浓度sucrose、inv和go
x
对应的电流大小，建立电流响应与sucrose、inv以及go
x
之间的定量关系，根据两者之间的定量关系，确定待测样品中sucrose、inv以及go
x
的含量。
[0018]
发明原理：本发明是一种基于氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门设计及应用研究，首先采用zno nps遇酸降解的性质，与酶溶液反应释放出的zn
2+
可以作为dnazyme切割扩增反应的因子，构建一种zno nps介导的dnazyme信号扩增策略，修饰到au上，以mb作为信号分子输出，成功制备传感器。由于蔗糖、葡萄糖氧化酶及蔗糖酶反应后溶液呈现酸性，基于此将其与zno nps混合能够释放zn
2+
，因此实现对蔗糖、葡萄糖氧化酶以及蔗糖酶的分析检测，构建了一种简单、快速、高灵敏、高选择性、免标记的电化学逻辑分析方法。
[0019]
与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明构建了基于氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门设计及其对go
x
和inv相关生物信号通路的研究。首先，通过zno nps与酶反应溶液混合释放zn
2+
能够对其dnazyme进行切割；其次，利用hcr反应进行核酸扩增，同时嵌入mb作为信号分子，采用方波伏安法检测传感器对不同浓度sucrose、inv以及go
x
的电化学响应。显然，在整个分析策略中，zno nps、sucrose、inv以及go
x
缺一不可，基于此，构建了yes、and、inhibit和and-and-inhibit逻辑门。其优点在于：
[0020]
(1)高灵敏度。本发明基于氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门设计及其对go
x
和inv相关生物信号通路的研究，分别得到三条线性方程：电流响应对sucrose浓度线性相关方程为y＝0.934lgc
sucrose
+1.721，r2＝0.9995，检测限为0.019μm；电流响应对inv浓度线性相关方程为y＝0.861lgc
inv
+1.35，r2＝0.9950，检测限为0.047mu/ml；电流响应对go
x
浓度线性相关方程为y＝0.680lgc
gox
+1.098，r2＝0.9976，检测限为0.012mu/ml。说明该传感器对sucrose、inv以及go
x
实现了高灵敏度检测。
[0021]
(2)设置zno nps、sucrose、inv或go
x
作为信号输入，mb电流信号作为信号输出，构建了4个yes逻辑门。
[0022]
(3)设置inv和go
x
作为信号输入1和2，mb电流信号作为信号输出，构建了and逻辑门。
[0023]
(4)设置zno nps和edta作为信号输入1和2，mb电流信号作为信号输出，构建了
inhibit逻辑门。
[0024]
(5)制备与检测方法试剂用量少、成本低。本发明只需消耗少量材料和试剂就可实现对sucrose、inv以及go
x
的高灵敏检测。
[0025]
(6)基于sucrose、inv以及go
x
在生物信号通路中相互联系、相互依存的角色，有助于实现sucrose、inv以及go
x
相关生物信号通路的应用研究。
[0026]
综上所述，本发明是基于氧化锌纳米粒子的“二进制”生物逻辑门设计及其对go
x
和inv相关生物信号通路的研究，具有灵敏度高、选择性好、操作简单、分析快速、易于操作等优点，可以实现较低浓度sucrose、inv以及go
x
的检测，具有良好的应用前景。
附图说明
[0027]
图1为本发明传感器对mb的电催化实验图；
[0028]
图2为本发明传感器对sucrose、inv以及go
x
分析检测的校准曲线图；
[0029]
图3为本发明中zno nps“yes”逻辑门的构建；
[0030]
图4为本发明中sucrose“yes”逻辑门的构建；
[0031]
图5为本发明中go
x“yes”逻辑门的构建；
[0032]
图6为本发明中inv“yes”逻辑门的构建；
[0033]
图7为本发明中inv/go
x“and”逻辑门的构建；
[0034]
图8为本发明中zno nps/edta“inhibit”逻辑门的构建；
具体实施方式
[0035]
以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0036]
实施例1 zno nps复合物和传感器的制备
[0037]
(1)氧化锌纳米粒子(zno nps)的制备
[0038]
溶液a：将50mg zn(no3)
·
6h2o和100mg聚乙二醇(peg)加入15ml超纯水中，超声混匀；溶液b：取88mg koh加入8ml超纯水中形成。控制温度为50℃，将溶液b滴加到溶液a中，滴加完成后超声保温20min，离心、洗涤、重新分散于5ml超纯水中，即可得到zno nps。
[0039]
(2)蔗糖酶及葡萄糖氧化酶反应液的制备
[0040]
酶反应液制备(总体积为100μl)：含100μm蔗糖、600mu/ml蔗糖酶、400mu/ml葡萄糖氧化酶、1mm nacl、适量o2(溶液中o2与空气中o2达到平衡)，将混合溶液置于37℃下反应2h。
[0041]
(3)电化学生物传感器的制备
[0042]
a.将金电极(au，直径为3mm)在麂皮上用粒径0.05μm的三氧化二铝粉末抛光5min，抛光后将电极置于超声清洗器中用超纯水超声清洗5min，然后用n2吹干，记为电极1；
[0043]
b.zn-dnazyme溶液制备(总体积为100μl)：含1μm dna1(zn-dnazyme)、1μm dna2(zn-sub dna)、1mm三(2-羧乙基)膦溶液(tcep)、50mm kcl和10mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(hepes)，将该混合溶液置于37℃下反应1h，随后将5μl反应液滴到au上于4℃过夜，之后用mch处理电极替换非特异性吸附探针，记为电极2。将(1)中5μl zn
2+
溶液滴入电极2表面，于37℃下反应1h，记为电极3。然后，再将dna3滴入电极3表面，于37℃下反应1h，记为电极4。随后，制备信号溶液(总体积为100μl)：含1mm甲基蓝溶液(mb)、1μm dna4、1μm dna5、50mm kcl和10mm 4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲溶液(hepes)，将5μl混合液滴入电极4表面，于
37℃下反应2h，记为电极5。从电极1到电极5的制备进程中，每完成一个修饰步骤，均需用超纯水缓缓冲洗电极以除去未反应或未接枝完全的试剂。
[0044]
从图1可以看出，mb随着杂交链反应的进行能够很好地输出电化学信号，说明传感器成功制备。
[0045]
实施例2可行性实验
[0046]
按上述实施例1传感器制备步骤，为了构建蔗糖酶或是葡萄糖氧化酶电化学生物传感器，将实施例1(1)中制备的2μl zno nps溶液与实施例2(2)中18μl酶反应液混合并于37℃反应2h。在b中电极3制备过程中，取5μl该反应液滴入电极2上，于37℃下反应1h，其他的实验步骤同b。改变酶反应体系中蔗糖含量(0、0.1、0.5、1、5、10、30、50、70、90、110、130、150、180、200、400、600、800、1000μm)、蔗糖酶含量(0、0.5、1、5、10、30、50、80、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000mu/ml)和葡萄糖氧化酶含量(0、0.1、0.5、1、5、10、15、20、30、50、70、90、110、150、200、250、300、350、400、450、500mu/ml)，其他步骤同上，可以实现蔗糖、葡萄糖氧化酶、蔗糖的定量监测。结果如图2a、2b和2c，可以看出，传感器对sucrose、inv以及go
x
的电流响应与浓度呈良好的线性关系，传感器的电流响应对sucrose浓度线性相关方程为y＝0.934lgc
sucrose
+1.712，r2＝0.9995，检测限为0.019μm；电流响应对inv浓度线性相关方程为y＝0.861 lgc
inv
+1.35，r2＝0.9950，检测限为0.047mu/ml，电流响应对go
x
浓度线性相关方程为y＝0.680lgc
gox
+1.098，r2＝0.9976，检测限为0.012mu/ml。说明传感器对sucrose、inv以及go
x
实现高灵敏检测。
[0047]
实施例3 zno nps“yes”逻辑门的构建
[0048]
按实施例1的zno nps的制备，对比存在zno nps和不存在zno nps时制得聚合物构建的传感器对mb的电化学响应，构建zno nps的“yes”逻辑门，如下表：
[0049][0050]
结果如图3所示，证明有zno nps存在时，对mb有良好的电化学响应，符合“yes”逻辑门特征。
[0051]
实施例4 sucrose“yes”逻辑门的构建
[0052]
按实施例1的zno nps的制备，对比存在sucrose和不存在sucrose时制得聚合物构建的传感器对mb的电化学响应，构建sucrose的“yes”逻辑门，如下表：
[0053][0054]
结果如图4所示，证明有sucrose存在时，对mb有良好的电化学响应，符合“yes”逻辑门特征。
[0055]
实施例5 inv“yes”逻辑门的构建
[0056]
按实施例1的zno nps的制备，对比存在inv和不存在inv时制得聚合物构建的传感
器对mb的电化学响应，构建inv的“yes”逻辑门，如下表：
[0057][0058]
结果如图5所示，证明有inv存在时，对mb有良好的电化学响应，符合“yes”逻辑门特征。
[0059]
实施例6 go
x“yes”逻辑门的构建
[0060]
按实施例1的zno nps的制备，对比存在go
x
和不存在go
x
时制得聚合物构建的传感器对mb的电化学响应，构建go
x
的“yes”逻辑门，如下表：
[0061][0062][0063]
结果如图6所示，证明有go
x
存在时，对mb有良好的电化学响应，符合“yes”逻辑门特征。
[0064]
实施例7 inv/go
x“and”逻辑门的构建
[0065]
按实施例1的zno nps的制备，对比inv(输入1)和go
x
(输入2)两个输入制得聚合物构建的传感器对mb的电化学响应，构建inv/go
x
的“and”逻辑门，如下表：
[0066][0067]
结果如图7所示，证明有inv和go
x
同时存在时，对mb有良好的电化学响应，符合“and”逻辑门特征。
[0068]
实施例8 zno nps/edta“inhibit”逻辑门的构建
[0069]
按实施例1的zno nps的制备，对比zno nps(输入1)和edta(输入2)两个输入制得聚合物构建的传感器对mb的电化学响应，构建zno nps/edta的“inhibit”逻辑门，如下表：
[0070]
[0071]
结果如图8所示，证明有zno nps，没有edta存在时，对mb有良好的电化学响应，符合“inhibit”逻辑门特征。
[0072]
当然，上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通技术人员在本发明的实质范围内做出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明保护范围。