一种诃子肉中诃黎勒酸制备方法及其含量测定方法

1.本发明涉及中药化学成分的制备和检测领域，具体涉及一种诃子肉中诃黎勒酸制备方法及其含量测定方法。


背景技术：

2.诃子为使君子科植物诃子（terminalia chebula retz.）或绒毛诃子（terminalia chebula retz.var.tomentella kurt.）的干燥成熟果实，具有涩肠止泻，敛肺止咳之功效。现代化学研究表明诃子主要化学成分为鞣质类，包括可水解的没食子鞣质和鞣花鞣质。其中含量较高的成分诃黎勒酸就是由多个没食子酸缩合而成，结构如下：前期研究表明诃黎勒酸具有极强的抗氧化能力和抗炎能力，为诃子的主要药效成分，且在诃子肉中含量可达10%，可作为质量标志物对诃子药材进行质量控制与评价。因此为合理、有效评价诃子药材质量需要制备诃黎勒酸对照品。
3.目前国内外对于诃黎勒酸的分离制备还处于起步阶段，技术尚不够完善。cn102020682a，2011年4月20日公开一种从诃子叶中制备诃黎勒鞣花酸的方法，所得诃黎勒酸产品纯度可达98%以上，但需要用到强碱强酸，且10 kg原料仅得到35 g产品，收率较低；cn104945447a，2015年9月30日公开一种从诃子叶中制备诃黎勒鞣花酸的方法，原料经酶解、超声波提取、陶瓷膜分离、大孔树脂吸附等步骤，步骤繁琐，且产品纯度在90%以下；cn105949252a，2016年9月21日公开一种高速逆流色谱法从诃子药材中制备诃黎勒酸的方法，但其所用设备复杂、昂贵，且其产品得率小于0.004%，纯度也仅大于95%。cn109867704a，2019年6月11日公开一种乙醇温浸法制备诃黎勒酸的方法，cn110724172a，2020年1月24日公开一种乙醇回流法制备诃黎勒酸的方法，这两种方法均采用余甘子为原料，经大孔树脂
柱分离，所得诃黎勒酸产品纯度均在98%以上，但其100 g药材也仅可得到2 g左右诃黎勒酸产品。
4.由已发表文献可见，目前关于诃黎勒酸的制备方法中多以诃子果实、诃子叶或余甘子为原料，其中诃黎勒酸在余甘子中的含量为2~5%，在诃子叶中为约2%，诃子果实包括诃子肉和诃子果核，其中果核占果实重量的15~30%，申请人前期研究发现诃黎勒酸在诃子肉中含量约为10%，而诃子果核中几乎不含有，因此对诃子果实去核取肉，再从诃子肉中制取诃黎勒酸将是一种效率更高的途径。另外，目前制备诃黎勒酸的方法常采用多种柱色谱法联合、高速逆流色谱法及制备液相色谱法等，具有成本高、步骤繁琐等缺点，不适用工业化生产。
5.在现行《中国药典》2020年版一部中，对诃子的质量控制方法仅限于定性鉴别和水分、灰分、水溶性浸出物的检测，尚无含量测定方法的规定，而诃黎勒酸可以作为质量标志物对诃子药材进行质量控制。胡绮萍等于《中药材》发表了一种关于诃子中诃黎勒酸含量测定的方法，所用供试品提取溶剂为甲醇，然而发明人长期对诃子进行研究的经验发现诃黎勒酸在甲醇中极不稳定，且溶剂中甲醇含量越高，其稳定性越差，这一特性对其含量测定的准确性将造成极大的影响。
6.本发明旨在开发一种操作简单、产率高、纯度高的诃黎勒酸对照品制备方法以及建立诃子中诃黎勒酸的准确、可重复的含量测定方法。


技术实现要素：

7.鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法。本发明提供的从诃子肉中制备诃黎勒酸的工艺对诃子肉中诃黎勒酸的提取率可达85%，经乙酸乙酯萃取，再经ods开放柱分离制备，总得率可达60%以上。本发明提供的含量测定方法其专属性、线性及范围、精密度、准确度和溶液稳定性均符合相关指导原则的要求，且操作简单，可对诃子药材进行质量检测。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。
9.本发明提供了一种从诃子肉中提取诃黎勒酸的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤如下：（1）将诃子果实去核，取果肉粉碎，过筛；称取一定量的诃子肉粉末，加70%乙醇水溶液超声提取，提取液以3000 r
·
min-1
的转速离心10 min，取上清液减压回收乙醇；（2）将上述回收乙醇后所得残渣加水稀释，以与水等量的乙酸乙酯萃取多次，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，残渣以一定量的甲醇水复溶，10000 r
·
min-1
的转速离心10 min；（3）取上述离心所得上清液经ods开放柱分离，以甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，4℃放置至有白色固体析出，即得诃黎勒酸。
10.进一步地，步骤（1）中诃子果肉粉碎，过65～120目筛，加入的70%乙醇水溶液为药材量20～30倍量，超声提取2～3次，每次10～30 min。
11.进一步地，步骤（2）中，稀释加水量为初始称取药材量的2～4倍，萃取次数为6～12次；复溶液为20%甲醇水溶液，用量为与生药量1:1，即制得上样液浓度为1.0 g/ml。
12.进一步地，步骤（3）中，ods柱填料的径高比为1:5～1:0.8；上样量为每10 g ods上
样1～2 ml；洗脱溶剂为20%甲醇水溶液，从第4个柱体积开始，共收集16个柱体积，减压回收溶剂，4℃放置至有白色固体析出，即得诃黎勒酸。
13.进一步地，所述方法提取出的诃黎勒酸作为标准品或对照品在诃黎勒酸的质量控制中的应用。
14.本发明还提供一种诃子中诃黎勒酸含量的测定方法，其特征在于，所述方法具体包括以下步骤：（1）制备对照品溶液：取诃黎勒酸对照品加入乙腈溶液溶解，制得混合对照品溶液；（2）制备供试品溶液：取诃子果肉粉碎，过65~120目筛；取样品粉末0.1~0.2g，精密称定，加入乙腈水溶液25~50 ml，称定重量，经超声处理，放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液稀释5~10倍，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取（1）和（2）制备的溶液分别注入高效液相色谱仪进行测定，所述高效液相色谱条件为：色谱柱：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
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m）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸，b相为乙腈，梯度洗脱；柱温：25～30℃；流速：0.8～1.2 ml/min；检测波长为280 nm；理论板数分别按诃黎勒酸峰计算应不低于5000。
15.进一步地，步骤（1）中，混合对照品溶液中诃黎勒酸浓度为0.05～0.1 mg/ml。
16.进一步地，步骤（2）中，提取溶剂为30%～70%乙腈水溶液；所述超声条件：时间为20～40 min，功率为250～300 w，频率为35～40 khz，温度为25～35 ℃。
17.进一步地，步骤（3）中，混合对照品溶液和供试品溶液的进样量为3~7 μl。
18.进一步地，步骤（3）中，流动相a相体积比为90～95：5～10：0.1～0.2的水-甲醇-甲酸，b相为乙腈，洗脱梯度为：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
15%；12～30 min，b为15%；30～35 min，b为15%
→
18%；35～50 min，b为18%；50～55 min，b为18%
→
100%。
19.与现有技术比，本发明的有益效果如下。
20.（1）目前分离制备诃黎勒酸的方法其产品得率及纯度大多较低，本发明采用诃黎勒酸含量较高的诃子肉为原料，将提取液通过乙酸乙酯萃取可除去大极性的杂质，对诃黎勒酸起到富集作用，保证所得产品的纯度。本发明制备的诃黎勒酸对照品纯度可达99%以上，总得率可达60%以上。
21.（2）本发明通过乙醇超声提取诃黎勒酸，再经乙酸乙酯萃取，回收至干，以甲醇水溶液复溶，上ods开放柱，再以20%甲醇水溶液洗脱。所用试剂均可回收循环利用，涉及的ods填料可重复使用多次，有效降低了成本。
22.（3）本发明所建立的开放柱色谱法对设备要求低，可应用于工业化生产，适用于大量诃黎勒酸对照品的制备。
23.（4）本发明所述的诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，诃黎勒酸在0.0475～1.5200
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g范围内呈良好的线性关系，平均回收率为100.02%，rsd为0.71%。精密度、稳定性、重复性的rsd均小于2%。因此，本发明所述的含量测定方法精密、准确，专属性强，操作简单，可用于诃子中诃黎勒酸的含量测定，为建立诃子的质量标准提供了理论基础和实验依据，对促进诃子产业化发展具有重要的意义。
附图说明
24.图1是诃黎勒酸1h-nmr鉴别图。
25.图2是诃黎勒酸
13
c-nmr鉴别图。
26.图3是诃黎勒酸产品高效液相色谱图。
27.图4是诃黎勒酸对照品高效液相色谱图。
28.图5为诃黎勒酸全波长扫描光谱图（200～400nm）。
29.图6为本发明实施例2例1中1.1专属性试验的空白溶液hplc色谱图。
30.图7为本发明实施例2例1中1.1专属性试验的混合对照品溶液hplc色谱图。
31.图8为本发明实施例2例1中1.1专属性试验的供试品溶液hplc色谱图。
32.图9为本发明实施例2例1中1.2线性范围及检出限的诃黎勒酸线性图。
33.图10为诃黎勒酸对照品溶解于乙腈中的hplc色谱图。
34.图11为诃黎勒酸对照品溶解于甲醇中的hplc色谱图。
具体实施方式
35.下面结合具体的实施例对本发明的一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法进一步说明，以便本领域的技术人员更加了解本发明，但并不以此限制本发明。
36.实施例一、一种从诃子肉中提取诃黎勒酸的方法。
37.本发明实施例一中所述高效液相色谱检测诃黎勒酸含量的方法如无特殊说明，均为下述方法：供试品溶液制备：精密称取样品0.1g，加入25 ml的70%甲醇，精密称定重量，超声30 min，放冷，以提取溶剂补足损失重量，滤过，取2 ml续滤液定容至10 ml容量瓶中，经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，即得；色谱条件：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
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m）；流动相：a相为甲酸-水（0.1：100 v/v），b相为甲醇，洗脱梯度：0～2 min，b为5%
→
38%；2～12 min，b为38%；12～13 min，b为38%
→
48%；13～20 min，b为48%；20～25 min，b为48%
→
100%；进样量：5 μl；柱温：25 ℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm；本发明实施例一全部实验所用原料均为同一批次，经上述方法测定，诃黎勒酸含量为140.21 mg/g。
38.例1：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法-诃子中诃黎勒酸的提取工艺，包括以下步骤：（1）将诃子果实去核，取果肉粉碎，过65目筛。称取5 g该诃子粉末，加入25倍量的70%乙醇水溶液超声提取2次，每次20 min。提取液以3000 r
·
min-1
的转速离心10 min，取上清液减压回收乙醇至干；（2）取相当于原药材0.1 g的上述干膏制备供试品溶液，hplc法检测诃黎勒酸提取量为97.36 mg/g，提取率为69.44%。
39.例2：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法-诃子中诃黎勒酸的提取工艺，包括以下步骤：（1）将诃子果实去核，取果肉粉碎，过120目筛。称取5 g该诃子粉末，加入25倍量的70%乙醇水溶液超声提取2次，每次20 min。提取液以3000 r
·
min-1
的转速离心10 min，取上
清液减压回收乙醇至干；（2）取相当于原药材0.1 g的上述干膏制备供试品溶液，hplc法检测诃黎勒酸提取量为106.99 mg/g，提取率为76.31%。
40.例3：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法-诃子中诃黎勒酸的提取工艺，包括以下步骤：（1）将诃子果实去核，取果肉粉碎，过120目筛。称取5 g该诃子粉末，加入20倍量的70%乙醇水溶液超声提取2次，每次20 min。提取液以3000 r
·
min-1
的转速离心10 min，取上清液减压回收乙醇至干；（2）取相当于原药材0.1 g的上述干膏制备供试品溶液，hplc法检测诃黎勒酸提取量为102.77 mg/g，提取率为73.30%。
41.例4：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法-诃子中诃黎勒酸的提取工艺，包括以下步骤：（1）将诃子果实去核，取果肉粉碎，过120目筛。称取5 g该诃子粉末，加入30倍量的70%乙醇水溶液超声提取2次，每次20 min。提取液以3000 r
·
min-1
的转速离心10 min，取上清液减压回收乙醇至干；（2）取相当于原药材0.1 g的上述干膏制备供试品溶液，hplc法检测诃黎勒酸提取量为118.86 mg/g，提取率为84.77%。
42.例5：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法-诃子中诃黎勒酸的提取工艺，包括以下步骤：（1）将诃子果实去核，取果肉粉碎，过120目筛。称取5 g该诃子粉末，加入30倍量的70%乙醇水溶液超声提取1次，每次30 min。提取液以3000 r
·
min-1
的转速离心10 min，取上清液减压回收乙醇至干；（2）取相当于原药材0.1 g的上述干膏制备供试品溶液，hplc法检测诃黎勒酸提取量为109.28 mg/g，提取率为77.94%。
43.例6：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法-诃子中诃黎勒酸的提取工艺，包括以下步骤：（1）将诃子果实去核，取果肉粉碎，过120目筛。称取5 g该诃子粉末，加入30倍量的70%乙醇水溶液超声提取3次，每次10 min。提取液以3000 r
·
min-1
的转速离心10 min，取上清液减压回收乙醇至干；（2）取相当于原药材0.1 g的上述干膏制备供试品溶液，hplc法检测诃黎勒酸提取量为121.75 mg/g，提取率为86.83%。
44.例7：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法，包括以下步骤：（1）将诃子果实去核，取果肉粉碎，过120目筛。称取1.0 g诃子粉末，加入30倍量的70%乙醇水溶液超声提取3次，每次10 min。提取液以3000 r
·
min-1
的转速离心10 min，取上清液减压回收乙醇；（2）将上述回收乙醇后所得残渣加2 ml水稀释，以与水等量的乙酸乙酯萃取6次，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，残渣以1 ml的20%甲醇水复溶，10000 r
·
min-1
的转速离心10 min，即上样液浓度为1.0 g/ml；（3）取上述离心所得上清液经ods开放柱（填料重10 g，径高比为1:5）分离，以20%
甲醇水溶液洗脱20个柱体积，通过hplc法检识流出液。收集第4～20个柱体积的洗脱液，减压回收溶剂，4℃放置至有白色固体析出。
45.所得产品共73.40 mg，总得率为52.35%。经1h-nmr和
13
c-nmr波谱鉴别为诃黎勒酸，以hplc检识，按峰面积归一化法计算纯度高于99%，即为诃黎勒酸对照品。
46.例8：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法，包括以下步骤：（1）同例7（1）；（2）将上述回收乙醇后所得残渣加4 ml水稀释，以与水等量的乙酸乙酯萃取12次，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，残渣以1 ml的20%甲醇水复溶，10000 r
·
min-1
的转速离心10 min，即上样液浓度为1.0 g/ml；（3）同例7（3）。
47.所得产品81.71 mg，总得率为58.28%；以hplc检识，按峰面积归一化法计算纯度高于99%。
48.例9：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法，包括以下步骤：（1）同例7（1）；（2）将上述回收乙醇后所得残渣加2 ml水稀释，以与水等量的乙酸乙酯萃取10次，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，残渣以1 ml的20%甲醇水复溶，10000 r
·
min-1
的转速离心10 min，即上样液浓度为1.0 g/ml；（3）同例7（3）。
49.所得产品83.44 mg，总得率为59.51%；以hplc检识，按峰面积归一化法计算纯度高于99%。
50.例10：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法，包括以下步骤：（1）同例7（1）；（2）将上述回收乙醇后所得残渣加4 ml水稀释，以与水等量的乙酸乙酯萃取10次，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，残渣以1 ml的20%甲醇水复溶，10000 r
·
min-1
的转速离心10 min，即上样液浓度为1.0 g/ml；（3）取上述离心所得上清液经ods开放柱（填料重10 g，径高比为1:5）分离，以20%甲醇水溶液洗脱20个柱体积，通过hplc法检识流出液。收集第6～20个柱体积的洗脱液，减压回收溶剂，4℃放置至有白色固体析出。
51.所得产品65.61mg，总得率为46.79%；以hplc检识，按峰面积归一化法计算纯度高于99%。
52.例11：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法，包括以下步骤：（1）将诃子果实去核，取果肉粉碎，过120目筛。称取1.5 g诃子粉末，加入30倍量的70%乙醇水溶液超声提取3次，每次10 min。提取液以3000 r
·
min-1的转速离心10 min，取上清液减压回收乙醇；（2）将上述回收乙醇后所得残渣加3 ml水稀释，以与水等量的乙酸乙酯萃取10次，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，残渣以1.5 ml的20%甲醇水复溶，10000 r
·
min-1的转速离心10 min，即上样液浓度为1.0 g/ml；（3）取上述离心所得上清液经ods开放柱（填料重10 g，径高比为1:5）分离，以20%甲醇水溶液洗脱20个柱体积，通过hplc法检识流出液。收集第5～20个柱体积的洗脱液，减
压回收溶剂，4℃放置至有白色固体析出。
53.所得产品111.23mg，总得率为52.89%；以hplc检识，按峰面积归一化法计算纯度高于99%。
54.例12：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法，包括以下步骤：（1）同例11（1）；（2）将上述回收乙醇后所得残渣加3 ml水稀释，以与水等量的乙酸乙酯萃取10次，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，残渣以1.5 ml的20%甲醇水复溶，10000 r
·
min-1
的转速离心10 min，即上样液浓度为1 g/ml；（3）取上述离心所得上清液经ods开放柱（填料重10 g，径高比为1:1.4）分离，以20%甲醇水溶液洗脱20个柱体积，通过hplc法检识流出液。收集第4～20个柱体积的洗脱液，减压回收溶剂，4℃放置至有白色固体析出。
55.所得产品130.3 mg，总得率为61.95%；以hplc检识，按峰面积归一化法计算纯度高于99%。
56.例13：一种从诃子肉中制备诃黎勒酸对照品的方法，包括以下步骤：（1）同例11（1）；（2）将上述回收乙醇后所得残渣加3 ml水稀释，以与水等量的乙酸乙酯萃取10次，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯，残渣以1.5 ml的20%甲醇水复溶，10000 r
·
min-1的转速离心10 min，即上样液浓度为1.0 g/ml；（3）取上述离心所得上清液经ods开放柱（填料重10 g，径高比为1:0.8）分离，以20%甲醇水溶液洗脱20个柱体积，通过hplc法检识流出液。收集第4～20个柱体积的洗脱液，减压回收溶剂，4℃放置至有白色固体析出。
57.所得产品121.5 mg，总得率为57.77%；以hplc检识，按峰面积归一化法计算纯度高于99%。
58.上述实施例7-13所得产品经核磁共振波谱鉴定分子结构，1h-nmr及
13
c-nmr波谱图见图1、图2，结构解析过程峰归属如下：1h nmr（400 mhz，cd3od）δ：6.50（1h，d，j = 1.3 hz，h-1），5.39（1h，brs，h-2），5.82（1h，brs，h-3），5.22（1h，d，j = 3.5 hz，h-4），4.81（1h，d，j = 5.4 hz，h-5），4.37（1h，dd，j = 10.5，7.6 hz，h-6a），4.92（1h，d，j = 10.2 hz，h-6b），4.82（1h，s，h-2'），5.05（1h，dd，j = 7.2，1.6 hz，h-3'），3.80（1h，ddd，j = 11.6，3.7，1.6 hz，h-4'），2.19（1h，dd，j = 17.1，3.8 hz，h-5'a），2.11（1h，dd，j = 17.0，11.5 hz，h-5'b），7.48（1h，s，h-2''），7.07（2h，s，h-2'''，6'''），6.84（1h，s，h-2''''），6.64（1h，s，h-2'''''），3.80（1h，s）；
13
c nmr（100 mhz，cd3od）δ：92.59（c-1），71.16（c-2），62.47（c-3），67.06（c-4），74.33（c-5），64.79（c-6），170.83（c-1'），66.85（c-2'），41.79（c-3'），40.06（c-4'），30.55（c-5'），175.05（c-6'），174.48（c-7'），116.29（c-1''），119.09（c-2''），117.69（c-3''），147.46（c-4''），140.45（c-5''），141.47（c-6''），166.47（c-7''），120.15（c-1'''），110.98（c-2'''，6'''），146.62（c-3'''，5'''），140.93（c-4'''），166.34（c-7'''），116.03（c-1''''），125.65（c-2''''），108.26（c-3''''），146.22（c-4''''），137.63（c-5''''），145.41（c-6''''），170.20（c-7''''），117.72（c-1'''''），124.59（c-2'''''），110.52（c-3'''''），145.67（c-4'''''），138.74（c-5'''''），145.62（c-6'''''），167.56（c-7'''''）。
59.实验结果表明所得产品为诃黎勒酸，经hplc检测其纯度大于99%，见图3、图4，符合含量测定对照品的纯度要求，因此本技术从诃子肉中制备得到诃黎勒酸对照品。
60.实施例二、一种诃子中诃黎勒酸含量的测定方法。
61.本发明实施例二中所述对照品是按照实施例一中例12的制备方法制备，并用于下述试验。
62.例1：方法学考察试验1.1 专属性试验包括以下步骤：（1）取50%乙腈，经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过制得空白溶液；（2）取诃黎勒酸对照品加入乙腈溶液溶解，制得诃黎勒酸为0.076 mg/ml的对照品
溶液；（3）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（4）取空白溶液、混合对照品溶液和供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录色谱图。所述色谱条件为：安捷伦1100高效液相色谱系统；色谱柱：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
ꢀµ
m）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸（95:5:0.1 v/v/v）；b相为乙腈，洗脱梯度：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
15%；12～30 min，b为15%；30～35 min，b为15%
→
18%；35～50 min，b为18%；50～55 min，b为18%
→
100%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm。
63.结果显示，以上处理方法制备的供试品溶液色谱图中有与诃黎勒酸对照品保留时间一致的色谱峰出现，且与相邻色谱峰达到完全分离。同时空白溶液的色谱图中没有与对照品保留时间一致的色谱峰出现，说明此方法对诃子中诃黎勒酸的含量测定专属性良好，图谱见图6～图8。
64.试验1.2 线性范围及检出限包括以下步骤：（1）取诃黎勒酸对照品加入乙腈溶液溶解，再经乙腈逐级稀释，制成浓度分别为0.3040、0.1520、0.0760、0.0380、0.0190、0.0095 mg/ml的系列对照品溶液；（2）取系列对照品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录峰面积。所述色谱条件同试验1.1；（3）以对照品进样量为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），进行线性回归分析。再将对照品溶液逐级稀释，色谱条件同上，分别注入液相色谱仪分析，以3倍信噪比计算检出限。
65.结果表明诃黎勒酸在0.04750～1.520
ꢀµ
g质量范围内线性范围良好，检出限为0.3800
ꢀµ
g/ml。线性结果见图9。
66.试验1.3 精密度试验包括以下步骤：（1）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（2）取供试品溶液5 μl注入高效液相色谱仪，平行测定6次，记录诃黎勒酸色谱峰面积。所述色谱条件同试验1.1。
67.结果显示诃黎勒酸峰面积rsd为0.74%。表明仪器精密度良好。
68.试验1.4 稳定性试验包括以下步骤：（1）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试
品溶液；（2）取供试品溶液分别于室温下放置0、2、4、8、12、24 h后取5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸色谱峰面积。所述色谱条件同试验1.1。
69.结果显示诃黎勒酸峰面积rsd为0.84%。表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定性良好。
70.试验1.5 重复性试验包括以下步骤：（1）取诃黎勒酸对照品加入乙腈溶液溶解，制得浓度为0.076 mg/ml的对照品溶液；（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液，平行制备6份；（3）取对照品溶液和6份供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸色谱峰面积，计算含量。所述色谱条件同试验1.1。
71.结果显示6份样品中，诃黎勒酸平均含量为140 mg/g，rsd为2.6%。表明该方法重复性良好。
72.试验1.6 加样回收试验包括以下步骤：（1）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.05 g，精密称定，加入相当于样品中诃黎勒酸含量100%的对照品，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液，平行制备6份；（2）取6份供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸峰面积，计算含量；所述色谱条件同试验1.1。
73.结果显示诃黎勒酸平均加样回收率为100.02%，rsd为0.71%，符合要求，结果见表1。
74.表1加样回收结果。
75.例2：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：（1）取诃黎勒酸对照品加入乙腈溶液溶解，制得浓度为0.076 mg/ml的对照品溶液；
（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取对照品溶液和供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸各项参数。所述色谱条件为：安捷伦1100高效液相色谱系统；色谱柱：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
ꢀµ
m）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸（95:5:0.1 v/v/v）；b相为乙腈，洗脱梯度：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
15%；12～30 min，b为15%；30～35 min，b为15%
→
18%；35～50 min，b为18%；50～55 min，b为18%
→
100%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm。
76.例3：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：（1）同例2中（1）；（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入30%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取对照品溶液和供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸各项参数。所述色谱条件为：安捷伦1100高效液相色谱系统；色谱柱：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
ꢀµ
m）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸（95:5:0.1 v/v/v）；b相为乙腈，洗脱梯度：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
15%；12～30 min，b为15%；30～35 min，b为15%
→
18%；35～50 min，b为18%；50～55 min，b为18%
→
100%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm。
77.例4：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：（1）同例2中（1）；（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入70%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取对照品溶液和供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸各项参数。所述色谱条件为：安捷伦1100高效液相色谱系统；色谱柱：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
ꢀµ
m）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸（95:5:0.1 v/v/v）；b相为乙腈，洗脱梯度：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
15%；12～30 min，b为15%；30～35 min，b为15%
→
18%；35～50 min，b为18%；50～55 min，b为18%
→
100%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm。
78.例5：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：（1）同例2中（1）；
（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取对照品溶液和供试品溶液各3 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸各项参数。所述色谱条件为：安捷伦1100高效液相色谱系统；色谱柱：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
ꢀµ
m）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸（95:5:0.1 v/v/v）；b相为乙腈，洗脱梯度：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
15%；12～30 min，b为15%；30～35 min，b为15%
→
18%；35～50 min，b为18%；50～55 min，b为18%
→
100%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm。
79.例6：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：（1）同例2中（1）；（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取对照品溶液和供试品溶液各7 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸各项参数。所述色谱条件为：安捷伦1100高效液相色谱系统；色谱柱：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
ꢀµ
m）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸（95:5:0.1 v/v/v）；b相为乙腈，洗脱梯度：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
15%；12～30 min，b为15%；30～35 min，b为15%
→
18%；35～50 min，b为18%；50～55 min，b为18%
→
100%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm。
80.例7：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：（1）同例2中（1）；（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取对照品溶液和供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸各项参数。所述色谱条件为：安捷伦1100高效液相色谱系统；色谱柱：diamonsil plus c18 色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5 μm）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸（95:5:0.1 v/v/v）；b相为乙腈，洗脱梯度：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
15%；12～30 min，b为15%；30～35 min，b为15%
→
18%；35～50 min，b为18%；50～55 min，b为18%
→
100%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm。
81.例8：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：（1）同例2中（1）；
（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取对照品溶液和供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸及各项参数。所述色谱条件为：安捷伦1100高效液相色谱系统；色谱柱：伊利特sinochrom ods-bp色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5 μm）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸（95:5:0.1 v/v/v）；b相为乙腈，洗脱梯度：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
15%；12～30 min，b为15%；30～35 min，b为15%
→
18%；35～50 min，b为18%；50～55 min，b为18%
→
100%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm。
82.例9：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：（1）同例2中（1）；（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取对照品溶液和供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸各项参数。所述色谱条件为：安捷伦1100高效液相色谱系统；色谱柱：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
ꢀµ
m）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸（90:10:0.2 v/v/v）；b相为乙腈，洗脱梯度：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
15%；12～30 min，b为15%；30～35 min，b为15%
→
18%；35～50 min，b为18%；50～55 min，b为18%
→
100%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm。
83.例10：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：（1）同例2中（1）；（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取对照品溶液和供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸各项参数。所述色谱条件为：安捷伦1100高效液相色谱系统；色谱柱：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
ꢀµ
m）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸（95:5:0.1 v/v/v）；b相为乙腈，洗脱梯度：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
15%；12～30 min，b为15%；30～35 min，b为15%
→
18%；35～50 min，b为18%；50～55 min，b为18%
→
100%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为270 nm。
84.例11：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：（1）同例2中（1）；
（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取对照品溶液和供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸各项参数。所述色谱条件为：安捷伦1100高效液相色谱系统；色谱柱：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
ꢀµ
m）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸（95:5:0.1 v/v/v）；b相为乙腈，洗脱梯度：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
14%；12～30 min，b为14%；30～35 min，b为14%
→
17%；35～50 min，b为17%；50～55 min，b为17%
→
100%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm。
85.例12：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：（1）同例2中（1）；（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入50%乙腈水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取对照品溶液和供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸各项参数。所述色谱条件为：岛津lc-16高效液相色谱系统；色谱柱：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
ꢀµ
m）；流动相：a相为水-甲醇-甲酸（95:5:0.1 v/v/v）；b相为乙腈，洗脱梯度：0～5 min，b为2%
→
5%；5～10 min，b为5%；10～12 min，b为5%
→
15%；12～30 min，b为15%；30～35 min，b为15%
→
18%；35～50 min，b为18%；50～55 min，b为18%
→
100%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm。
86.对比例1：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：（1）取诃黎勒酸对照品加入甲醇溶液溶解，制得诃黎勒酸为0.068 mg/ml的混合对照品溶液；（2）取诃子果肉粉碎，过65目筛。取样品粉末0.1g，精密称定，加入70%甲醇水溶液25 ml，称定重量，超声30 min（功率250 w，频率40 khz，温度30 ℃），放冷，以提取溶剂补足损失的重量，滤过，取续滤液2 ml稀释至10 ml，稀释液经0.45
ꢀµ
m微孔滤膜滤过，制得供试品溶液；（3）取对照品溶液和供试品溶液各5 μl注入高效液相色谱仪，记录诃黎勒酸各项参数。所述色谱条件为：安捷伦1100高效液相色谱系统；色谱柱：dikma platisil色谱柱（250 mm
×
4.6 mm，5
ꢀµ
m）；流动相：a相为水-甲酸（100:0.1 v/v）；b相为甲醇；洗脱梯度：0～8 min，b为5%
→
10%；8～15 min，b为10%
→
25%；15～25 min，b为25%；25～30 min，b为25%
→
30%；30～50min，b为30%
→
45%；50～55 min，b为45%；55～60min，b为45%
→
100%。柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为280 nm；对比例2：一种诃子中诃黎勒酸的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定，包括以下步骤：
min，b为5%
→
13%；2～20 min，b为13%；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；检测波长为278 nm。
90.通过上述实施例2-12及对比例1-5考察结果表明了本发明方法的耐用性范围以及系统适用性考察结果。但通过结果发现诃子中的化学成分在甲醇和乙腈做流动相的体系下出峰顺序不一致，无法直接做对比，因此以诃黎勒酸对照品考察其在甲醇、乙腈中的稳定性。考察条件及结果见表2～4。
91.表2 耐用性考察条件。
92.表3 诃黎勒酸稳定性考察条件。
93.表4 系统适用性结果
。
94.上述实施例2～12诃黎勒酸的测定结果显示，本发明所述含量测定方法样品峰和相邻峰可以达到完全分离，且保留时间、理论塔板数、拖尾因子及分离度均符合要求，对比例1测定方法的拖尾因子和分离度不符合要求，且峰面积与实施例对比出入较大，说明测量结果不准确，通过对比例1～3和实施例2的对比可以看出，在供试品溶液制备时选择甲醇作溶剂对诃黎勒酸含量测定的影响较大，同时选择甲醇做流动相也有一定的影响。
95.以上所述仅为本技术的较佳实施例，并不用以限制本技术，凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。