一种含肉样品中多环芳烃的提纯方法、一种含肉样品中多环芳烃的检测方法

1.本发明涉及食品中有害物质检测技术领域，尤其涉及一种含肉样品中多环芳烃的提纯方法、一种含肉样品中多环芳烃的检测方法。


背景技术：

2.多环芳烃(pahs)是指含两个或两个以上苯环的芳烃。它们主要有两种组合方式，一种是非稠环型，其中包括联苯及联多苯和多苯代脂肪；另一种是稠环型，即两个碳原子为两个苯环所共有烃，具体包括荼、蔥、菲、芘等150余种化合物。pahs由于具有毒性、遗传毒性、突变性和致癌性，对人体可造成多种危害，如对呼吸系统、循环系统、神经系统损伤，对肝脏、肾脏造成损害，因此被认定为一类影响人类健康的主要有机污染物。
3.对于非职业工人和非吸烟者，70％以上的多环芳烃接触源自于饮食，尤其是肉制品。在相同质量的食物中，各类肉制品中pahs的含量显著高于其它非肉类食品。因此，鉴于肉制品在日常生活中的重要性，检测其中pahs的含量对保障肉制品安全具有十分重要的意义。
4.现用于多环芳烃分析测定的方法有纸色谱、薄层色谱、填充柱气相色谱、毛细管柱气相色谱、气相色谱-质谱、高效液相色谱-荧光检测法等方法。纸色谱、薄层色谱、填充柱气相色谱等方法能进行定量分析，但分离效能和分析速度比较差。气相色谱-质谱法(gc/ms)和高效液相色谱-荧光检测法(hplc-fld)具有很高的分离度，灵敏度高，线性范围宽，定量准确度好，是最常用的终端检测技术。
5.针对肉类制品中pahs的含量的测定，在进行pahs的含量的测定之前，需要对肉类制品进行前处理，去除肉制品中的杂质，得到的纯化的待检测pahs样品，已获得准确的检测结果。
6.pahs的提取纯化方法有以下几种方法：索氏提取法、超声萃取法、微波萃取法、加速溶剂萃取法、超临界流体萃取法和协同提取技术。由于肉及肉制品基质的高度复杂性，通常需要繁琐的提取净化程序以破坏其脂质组分并促进目标分析物的提取，因此它们的前处理比其他非脂肪食品样品的预处理更加困难，开发简便、快速、高效的前处理方法是肉制品中多环芳烃的分析技术的发展方向。
7.分子印迹聚合柱(mispe)因其具有选择性而被应用于去除杂质，近年来也被开发与超声萃取(ue)联用应用于肉制品的pahs前处理中。“气相色谱-同位素稀释质谱法测定肉中多环芳烃含量”(彭姚珊，李永利，陈鹰，李杰.食品科学,2019,10(12):321～325)一文中公开了采用正己烷-二氯甲烷超声提取和分子印迹柱净化，得到的净化产品进行gc/ms检测。但在重复上述文章中的检测方法时，发现其前期的净化处理方法仍存在处理的肉制品特别是高脂肉样进行检测时极易因基质效应造成柱效下降、检测灵敏度迅速降低。


技术实现要素：

8.有鉴于此，本发明提供了一种含肉样品中多环芳烃的提纯方法、一种含肉样品中多环芳烃的检测方法，本发明提供的提纯方法得到的pahs样品杂质含量低且方法简单，进行gc/ms检测或hplc-fld检测时，基质效应小，检测的定量限低。
9.为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
10.本发明提供了一种含肉样品中多环芳烃的提纯方法，包括以下步骤：
11.将含肉样品和色谱纯硅藻土混合研磨，得到研磨物料，所述含肉样品包括肉和/或肉制品；
12.将所述研磨物料和有机萃取溶剂混合萃取，萃取有机相为多环芳烃粗品，所述有机萃取溶剂包括二氯甲烷或二氯甲烷和正己烷的混合溶剂；
13.采用多环芳烃分子印迹柱纯化所述多环芳烃粗品，所述纯化的洗脱剂包括二氯甲烷。
14.优选的，所述含肉样品和色谱纯硅藻土的质量比≤1:1。
15.优选的，所述混合研磨的原料还包括固体干燥剂，所述固体干燥剂和所述硅藻土的质量比优选为1:1。
16.优选的，所述二氯甲烷和正己烷的混合溶剂中二氯甲烷和正己烷的体积比≥0.5:1。
17.优选的，所述混合萃取的次数为2～3次，每次混合萃取时，所述研磨物料的质量和有机萃取溶剂的体积比为5g:20ml。
18.优选的，所述混合萃取在漩涡震荡的条件下进行，每次混合萃取时，所述漩涡震荡的时间为30s。
19.优选的，每次所述混合萃取后得到萃取悬浊液，所述混合萃取后，还包括将所述萃取悬浊液依次进行固液分离得到萃取有机相，萃取有机相合并后浓缩得到所述多环芳烃粗品，所述固液分离为离心，所述离心的转速为4500r/min，所述离心的时间为10min，所述离心时，所述萃取悬浊液的温度为-20～常温。
20.优选的，所述浓缩为旋转蒸发干燥，所述浓缩的温度为36～40℃。
21.本发明提供了一种含肉样品中多环芳烃的检测方法，采用气相色谱-质谱法或高效液相色谱-荧光检测法检测提纯后的含肉样品，所述提纯后的含肉样品为经上述技术方案所述提纯方法得到。
22.优选的，所述多环芳烃包括萘、1-甲基萘、2-甲基萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚苯[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽和苯并[g,h,i]苝中的一种或多种。
[0023]
本发明提供了一种含肉样品中多环芳烃的提纯方法，包括以下步骤：将含肉样品和色谱纯硅藻土混合研磨，得到研磨物料，所述含肉样品包括肉和/或肉制品；将所述研磨物料和有机萃取溶剂混合萃取，萃取有机相为多环芳烃粗品，所述有机萃取溶剂包括二氯甲烷或二氯甲烷和正己烷的混合溶剂；采用多环芳烃分子印迹柱纯化所述多环芳烃粗品，所述纯化的洗脱剂包括二氯甲烷。本发明提供的提纯方法首先在研磨过程中，利用硅藻土吸附含肉样品中的多环芳烃，将多环芳烃和含肉样品中的杂质初步分离；然后将研磨物料和有机溶剂混合，采用固相基质分散悬浮液萃取的方式对研磨物料进行萃取，有机萃取溶
剂包括二氯甲烷或二氯甲烷和正己烷的混合溶剂时，多环芳烃能够充分进入有机萃取溶剂中，与含肉样品中的杂质分离率高且萃取回收率高，得到多环芳烃粗品后，采用多环芳烃分子印迹柱配合二氯甲烷作为洗脱剂进行纯化，能够进一步去除多环芳烃粗品中的杂质。本发明提供的提纯方法能够有效将含肉样品中的杂质与多环芳烃分离。且本发明提供的制备方法简单，易于操作。
[0024]
本发明提供了一种含肉样品中多环芳烃的检测方法，采用气相色谱-质谱法或高效液相色谱-荧光检测法检测提纯后的含肉样品，所述提纯后的含肉样品为经上述技术方案所述提纯方法得到。本发明采用上述技术方案提纯方法的提纯化的含肉样品进行检测，待测样品中杂质含量小，进行gc/ms检测或hplc-fld检测时，基质效应小，不易受杂质干扰，可靠性强，检测的定量限低，能够同时检测肉制品中18种多环芳烃的含量。
附图说明
[0025]
图1为本发明实施例采用gc/ms检测含肉样品中多环芳烃的含量(加标1μg/kg)的图谱；
[0026]
其中，1为萘、2为1-甲基萘、3为2-甲基萘、4为苊烯、5为苊、6为芴、7为菲、8为蒽、9为荧蒽、10为芘、11为苯并[a]蒽、12为13为苯并[b]荧蒽、14为苯并[k]荧蒽、15为苯并[a]芘、16为茚苯[1,2,3-cd]芘、17为二苯并[a,h]蒽、18为苯并[g,h,i]苝；
[0027]
图2为本发明实施例与文献“气相色谱-同位素稀释质谱法测定肉中多环芳烃含量”(彭姚珊，李永利，陈鹰，李杰.食品科学,2019,10(12):321～325)所述方法检测腊肉中多环芳烃时残留干扰物质的对比图。
具体实施方式
[0028]
本发明提供了一种含肉样品中多环芳烃的提纯方法，包括以下步骤：
[0029]
将含肉样品和色谱纯硅藻土混合研磨，得到研磨物料，所述含肉样品包括肉和/或肉制品；
[0030]
将所述研磨物料和有机萃取溶剂混合萃取，萃取有机相为多环芳烃粗品，所述有机萃取溶剂包括二氯甲烷或二氯甲烷和正己烷的混合溶剂；
[0031]
采用多环芳烃分子印迹柱纯化所述多环芳烃粗品，所述纯化的洗脱剂包括二氯甲烷。
[0032]
在本发明中，如无特殊说明，所用原料均为本领域技术人员熟知的市售产品。
[0033]
本发明将含肉样品和色谱纯硅藻土混合研磨，得到研磨物料，所述含肉样品包括肉和/或肉制品。
[0034]
在本发明中，所述含肉样品包括肉和/或肉制品，优选包括肉或肉制品。
[0035]
本发明优选对所述含肉样品进行前处理。在本发明中，所述前处理优选为搅碎，在本发明中，所述含肉样品为冷冻样品时，进行所述搅碎之前，优选将所述含肉样品解冻。本发明对所述搅碎的具体实施过程没有特殊要求，将所述含肉样品搅碎成肉末即可。
[0036]
在本发明的具体实施例中，所述硅藻土优选为色谱纯的弗罗里硅土(lc-florisil硅藻土)。
[0037]
在本发明中，所述含肉样品和硅藻土的质量比优选≤1:1，更优选为1:1。
[0038]
在本发明中，所述混合研磨的原料优选还包括固体干燥剂。
[0039]
在本发明中，所述固体干燥剂优选为分析纯试剂或色谱纯试剂。
[0040]
在本发明的具体实施例中，所述固体干燥剂具体优选为无水硫酸钠。
[0041]
在本发明中，所述固体干燥剂和所述硅藻土的质量比优选为1:1。
[0042]
在本发明的具体实施例中，所述混合研磨优选在研钵中手动研磨。
[0043]
在本发明中，所述混合研磨的时间优选为10min。
[0044]
在本发明中，所述混合研磨的温度优选为0℃～常温。
[0045]
得到研磨物料后，本发明将所述研磨物料和有机萃取溶剂混合萃取，得到多环芳烃粗品，所述有机萃取溶剂包括二氯甲烷或二氯甲烷和正己烷的混合溶剂。
[0046]
在本发明中，所述有机萃取溶剂包括二氯甲烷或二氯甲烷和正己烷的混合溶剂，优选为二氯甲烷和正己烷的混合溶剂。
[0047]
在本发明中，所述二氯甲烷和正己烷的混合溶剂中二氯甲烷和正己烷的体积优选比优选≥0.5:1，更优选为为1:1。
[0048]
在本发明中，所述混合萃取的次数优选为2～3次，更优选为2次。
[0049]
在本发明中，每次混合萃取时，所述研磨物料的质量和有机萃取溶剂的体积比优选为5g:20ml。
[0050]
在本发明中，所述混合萃取优选在漩涡震荡的条件下进行，每次混合萃取时，所述漩涡震荡的时间优选为30s。
[0051]
在本发明中，所述混合萃取后得到萃取悬浊液，本发明优选还包括将所述萃取悬浊液依次进行固液分离得到萃取有机相，萃取有机相合并后浓缩得到所述多环芳烃粗品。
[0052]
在本发明中，所述固液分离优选为离心，所述离心的转速优选为4500r/min，所述离心的时间优选为10min，所述离心时，所述萃取悬浊液的温度优选为-20～常温，更优选为-20～4℃，最优选为-4℃。
[0053]
在本发明中，所述固液分离后得到萃取有机相和萃取渣。
[0054]
所述萃取渣用于进行下一次的萃取或废弃。
[0055]
本发明合并每次固液分离得到的萃取有机相后进行浓缩。
[0056]
在本发明中，所述浓缩优选为旋转蒸发干燥，所述浓缩的温度优选为36～40℃，更优选为38℃。
[0057]
得到多环芳烃粗品后，本发明采用多环芳烃分子印迹柱纯化所述多环芳烃粗品，所述纯化的洗脱剂包括二氯甲烷。
[0058]
在本发明中，所述多环芳烃分子印迹柱为cnw poly-sery多环芳烃分子印迹柱，规格优选为500mg/6ml。
[0059]
本发明优选对所述多环芳烃分子印迹柱进行前处理，所述前处理优选包括：依次对所述多环芳烃分子印迹柱进行活化处理和平衡处理。在本发明中，所述活化处理的活化溶剂优选为正己烷，本发明对所述混合处理的具体实施过程没有特殊要求，在本发明中，所述平衡处理的溶剂优选为二氯甲烷，本发明对所述平衡处理的具体实施过程没有特殊要求。
[0060]
进柱之前，本发明优选将所述多环芳烃粗品和所述有机溶剂混合得到多环芳烃粗品溶液。所述多环芳烃粗品溶液中的有机溶剂优选为正己烷。在本本发明中，所述洗脱剂优
选为二氯甲烷，所述洗脱剂所述多环芳烃粗品溶液的体积比优选为1:2。
[0061]
本发明提供了一种含肉样品中多环芳烃的检测方法，采用气相色谱-质谱法或高效液相色谱-荧光检测法检测提纯后的含肉样品，所述提纯后的含肉样品为经上述技术方案所述提纯方法得到。
[0062]
在本发明中，所述检测优选为定量检测时，本发明优选采用内标法进行。
[0063]
采用内标法进行检测时，本发明优选对上述技术方案所述提纯方法得到的提纯后的含肉样品在保护气氛中浓缩后，加入内标物后定容，得到待检测样品。
[0064]
在本发明中，所述保护气氛优选为氮气。
[0065]
本发明对所述浓缩的具体实施过程没有特殊要求。
[0066]
在本发明中，所述待检测样品的体积优选为0.5ml。
[0067]
本发明对所述气相色谱-质谱法或高效液相色谱-荧光检测法的具体实施过程没有特殊要求。
[0068]
在本发明的具体实施例中，采用气相色谱-质谱法时，本发明优选采用气相色谱-质谱联仪对所述待测样品进行检测。
[0069]
在本发明中，所述气相色谱-质谱联仪的参数优选包括：柱箱温度80℃，进样口温度280℃，不分流进样。温度梯度：初温80℃，保持1min，20℃/min升温至220℃，5℃/min升温至300℃，保持5min。
[0070]
在本发明中，所述多环芳烃优选包括萘、1-甲基萘、2-甲基萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽、芘、苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚苯[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽和苯并[g,h,i]苝中的一种或多种。
[0071]
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0072]
实施例1
[0073]
取猪里脊精肉功能与猪脂肪混合(w:w＝8:2)制成肉饼电烤制12min，每2min翻面一次制成空白肉样，用于苯并[a]蒽、苯并[b]荧蒽、苯并[k]荧蒽、苯并[a]芘、茚苯[1,2,3-cd]芘、二苯并[a,h]蒽和苯并[g,h,i]苝的标定。
[0074]
将上述空白肉样用正己烷超声萃取后得到纯化空白肉样，用于萘、1-甲基萘、2-甲基萘、苊烯、苊、芴、菲、蒽、荧蒽和芘的标定。
[0075]
将18种多环芳烃混合标准溶液加入空白肉样中，然后搅碎成肉末，称取5g肉末加入到研钵中，然后加入5g无水硫酸钠和5g lc-florisil硅藻土，充分研磨后倒入50ml聚四氟乙烯离心管中加入20ml体积比为1:1的正己烷和二氯甲烷混合溶剂，涡旋30s后将离心管置于离心机中在-4℃以4500r/min的转速离心10min，取上清液；滤渣再次加入20ml体积比为1:1的正己烷和二氯甲烷的混合溶剂同样条件提取并离心过滤，合并两次过滤后的上清液，置于旋转蒸发仪中在38℃条件下旋转蒸发浓缩至近干，然后加入5ml正己烷重新溶解得到待净化液；
[0076]
将多环芳烃分子印迹柱用5ml正己烷进行活化，然后再用5ml二氯甲烷平衡，流净后取5ml待净化液上样，加入多环芳烃分子印迹柱中，然后用10ml的二氯甲烷作为洗脱剂洗
脱得到洗脱液并收集。将洗脱液置于氮气浓缩仪中浓缩定容至0.5ml，得到待测样；
[0077]
气相色谱-质谱联用仪的分析参数设置为：
[0078]
柱箱温度80℃，进样口温度280℃，不分流进样。
[0079]
温度梯度:初温80℃，保持1min，20℃/min升温至220℃，5℃/min升温至300℃，保持5min。
[0080]
将待测样按照上述色谱条件进行气相色谱-质谱分析，以信噪比(s/n)＝10时的浓度确定为方法定量限，得到的18种多环芳烃的线性浓度范围和定量限，如表1所示。由表1、图1和图2可以得出，采用本发明提供的提纯方法制备得到的含肉样品进行气相色谱-质谱法进行检测时，由于待测样品中杂质含量小，进行gc/ms检测时，基质效应小，不易受杂质干扰，可靠性强，检测的定量限低，能够同时检测肉制品中18种多环芳烃的含量。
[0081]
表1实施例1得到的18种多环芳烃的线性浓度范围和定量限
[0082]
[0083][0084]
实施例2
[0085]
将腊肉制品搅碎成肉末，称取5g肉末加入到研钵中，然后加入5g无水硫酸钠和5g lc-florisil硅藻土，充分研磨后倒入50ml聚四氟乙烯离心管中加入20ml体积比为1:1的正己烷和二氯甲烷混合溶剂，涡旋30s后将离心管置于离心机中在-4℃以4500r/min的转速离心10min，取上清液；滤渣再次加入20ml体积比为1:1的正己烷和二氯甲烷的混合溶剂同样条件提取并离心过滤，合并两次过滤后的上清液，置于旋转蒸发仪中在38℃条件下旋转蒸发浓缩至近干，然后加入5ml正己烷重新溶解得到待净化液；
[0086]
将多环芳烃分子印迹柱用5ml正己烷进行活化，然后再用5ml二氯甲烷平衡，流净后取5ml待净化液上样，加入多环芳烃分子印迹柱中，然后用10ml的二氯甲烷作为洗脱剂洗脱得到洗脱液并收集。将洗脱液置于氮气浓缩仪中浓缩至小于0.5ml，加入仪器内标后定容至0.5ml，得到待测样品；
[0087]
气相色谱-质谱联用仪的分析参数设置为：
[0088]
柱箱温度80℃，进样口温度280℃，不分流进样。
[0089]
温度梯度:初温80℃，保持1min，20℃/min升温至220℃，5℃/min升温至300℃，保持5min。
[0090]
将待测样品按照上述色谱条件进行气相色谱-质谱分析，通过内标标准曲线法进行定量，得到该腊肉制品中18种多环芳烃的具体含量范围在nq(定量限)～4.04μg/kg之间。
[0091]
实施例3
[0092]
待测样品的制备方法与实施例1相同，检测前将溶剂更换为乙腈；
[0093]
采用液相色谱-荧光检测器进行检测，液相色谱-荧光检测器的分析参数设置为：c18液相色谱柱，流动相：乙腈和水，多环芳烃激发波长和发射波长见表2。
[0094]
以信噪比(s/n)＝10时的浓度确定为方法定量限，得到的15种多环芳烃线性浓度范围和定量限，如表2所示。由表2可以得出，采用本发明提供的提纯方法制备得到的含肉样品进行液相色谱-荧光检测法进行检测时，由于待测样品中杂质含量小，进行hplc-fld检测，基质效应小，不易受杂质干扰，可靠性强，检测的定量限低，能够同时检测肉制品中15种多环芳烃的含量。
[0095]
表2实施例3的15种多环芳烃的激发波长、发射波长和得到的定量限
[0096][0097][0098]
实施例4
[0099]
待测样品的制备方法与实施例2相同，检测前将溶剂更换为乙腈；
[0100]
采用实施例3的检测方法对待测样品进行检测；通过内标标准曲线法进行定量，得到该肉制品中15种多环芳烃的具体含量。
[0101]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。