一种使用LCMS同时分析白酒中氨基甲酸乙酯和甜味剂的方法与流程

一种使用lcms同时分析白酒中氨基甲酸乙酯和甜味剂的方法
技术领域
1.本发明涉及领域，特别涉及一种使用lcms同时分析白酒中氨基甲酸乙酯和甜味剂的方法。


背景技术：

2.氨基甲酸乙酯，是食品发酵过程中自然形成的一种有害健康的物质，该物质会随着白酒储存时间的增加而发生变化；而甜味剂是白酒中明确不能添加的物质。按现有的国标方法开展氨基甲酸乙酯和各类甜味剂的分析需要采用多种分析方法、分析设备、耗材和药品进行分析。对于一个样品需要经历多次分析方法切换，多种前处理方法，不同设备的分析，整个样品分析耗时较长，占用大量的分析资源。


技术实现要素：

3.本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种使用lcms(液质联用仪)同时分析白酒中氨基甲酸乙酯和甜味剂的方法，将样品进行简单前处理，氨基甲酸乙酯和八种甜味剂(安赛蜜、糖精钠、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜、甜菊糖苷、甜蜜素、阿力甜)同时进样开展快速分析，以提高分析工作效率，节省分析资源，采用该方法可以减少设备方法的频繁切换，并同时减少了大量药品、试剂、耗材的使用，将单个样品的前处理和分析时间缩短至半小时内，克服了现有检测技术所存在的不足。
4.本发明采用的技术方案如下：一种使用lcms同时分析白酒中氨基甲酸乙酯和甜味剂的方法，包括以下步骤：
5.a、分别称取各甜味剂标准品，用超纯水溶解定容后，得到各甜味剂标准溶液，然后取适量的各甜味剂标准溶液于容量瓶中混合，加入超纯水定容，得到甜味剂混合标准溶液；
6.b、称取氨基甲酸乙酯，用甲醇溶解并定容，得到ec储备液，吸取一定量的ec储备液，用甲醇稀释定容后，得到一定浓度的ec中间液；
7.c、吸取一定量的甜味剂混合标准溶液和ec中间液于容量瓶中混合，用超纯水定容，得到一定浓度的甜味剂/ec混合标准工作溶液，取一定量的该甜味剂/ec混合标准工作溶液，用超纯水稀释定容，得到多个浓度不同的甜味剂/ec混合标准工作溶液；
8.d、取不含氨基甲酸乙酯和甜味剂的空白酒样，将空白酒样与超纯水按一定体积比混合得到酒样稀释剂，然后按照上述步骤a－c的方法，将超纯水替换为酒样稀释剂，配制得到多个浓度不同的甜味剂/ec混合空白加标样品工作溶液；
9.e、取待检酒样，将待检酒样与空白酒样按照一定的体积比混合得到样品稀释剂，然后按照上述步骤a－c的方法，将超纯水替换为样品稀释剂，配制得到多个浓度不同的甜味剂/ec混合样品工作溶液；
10.f、运行液质联用仪，设定好色谱检测条件和质谱检测条件，按照常规进样方法，先进甜味剂/ec混合标准工作溶液，然后再进空白酒样和待测试样，通过仪器上配套的软件分别得到样品氨基甲酸乙酯和甜味剂的定性和定量分析结果。
11.进一步，所述甜味剂包括安赛蜜、糖精钠、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜、甜菊糖苷、甜蜜素、阿力甜中的一种或多种。
12.进一步，在步骤a中，甜味剂标准溶液中甜味剂的浓度为0.4
±
0.1g/l。
13.进一步，所述色谱条件为：
14.色谱柱：shim－pack gist c18 2.1mm
×
100mm 2μm；
15.流动相a：0.1％甲酸溶液；流动相b：甲醇；
16.流速：0.4ml/min；进样体积：10μl；
17.进样方式：自动进样；柱箱温度：40℃。
18.进一步，所述色谱梯度洗脱条件如下表所示：
19.时间min流速(ml/min)％a％b0.50.40080.020.03.00.40010.090.04.00.40010.090.04.100.40080.020.0
20.。
21.上述梯度洗脱条件的含义为：保持流速为0.4ml/min，在开始的0.5min内，流动相a(0.1％甲酸溶液)占流动相体积分数的80.0％，流动相b(甲醇)占流动相的体积分数20.0％；在接下来的3.0min内，逐渐减少流动相a的体积分数至10.0％，逐渐增加流动相b的体积分数至90.0％；接着在后续的4.0min内，维持流动相a和流动相b的体积分数进行洗脱；在最后的4.10min内，逐渐增加流动相a的体积分数至80％，逐渐减少流动相b的体积分数至20.0％。
22.进一步，所述质谱条件为：
23.离子源：电喷雾离子源；
24.扫描方式：ec和asp正离子模式，其余负离子模式；
25.检测方式：多反应监测mrm；离子源温度：300℃；
26.dl温度：250℃；加热块温度：400℃；
27.雾化气流量：3.0l/min；干燥气流量：10.0l/min；加热气流量：10.0l/min；
28.ec：m/z＝90([m+h]
+
)，分子量：89.09；
[0029]
stv：m/z＝803([m－h]
－
)，分子量：804.88；
[0030]
sl：m/z＝395([m－h]
－
)，分子量：397.63；
[0031]
ak：m/z＝162([m－k]
－
)，分子量：201.24；
[0032]
asp：m/z＝295([m+h]
+
)，分子量：294.31；
[0033]
sa：m/z＝182([m－na]
－
)，分子量：204.98；
[0034]
sc：m/z＝178([m－na]
－
)，分子量：201.22；
[0035]
ntm：m/z＝377([m－h]
－
)，分子量：378.46；
[0036]
alt：m/z＝330([m－h]
－
)，分子量：331.43；
[0037]
上述各组分的定量离子对如下：ec90/62、stv803/641、ak162/82、sa182/42、sc178/80、sl395/359、asp295/120、ntm377/200、alt330/312。
[0038]
进一步，氨基甲酸乙酯与甜味剂的定量离子对分别如下：ec90/62、stv803/641、
ak162/82、sa182/42、sc178/80、sl395/359、asp295/120、ntm377/200、alt330/312。
[0039]
进一步，所述空白酒样为含乙醇体积分数为30－60％的酒样。
[0040]
进一步，所述空白酒样与超纯水的体积比为1：1；空白酒样与待检酒样的体积比为1：1。在本发明中，空白酒样与超纯水以及待检酒样的体积比的关系比较重要，其直接影响基质效应的结果，如果得到的基质效应的绝对值超过10％，则说明基质(即溶剂)对组分检测有较大影响，需要对基质影响进行校正处理，增加了检测难度。发明人通过试验发现，当空白酒样与超纯水的体积比为1：1，空白酒样与待检酒样的体积比为1：1时，基质效应比较小，可以不用校正，降低了检测难度。
[0041]
进一步，在进行定性分析时，若甜味剂/ec混合样品工作溶液中待测物质的保留时间与甜味剂/ec混合空白加标样品工作溶液中对应的保留时间偏差在
±
2.5％之内，且相对离子丰度的偏差在规定的最大允许偏差范围之内时，则可以确定甜味剂/ec混合样品工作溶液中含有该待测物质。
[0042]
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：本发明提供的一种使用lcms(液质联用仪)同时分析白酒中氨基甲酸乙酯和甜味剂的方法，将样品进行简单前处理，氨基甲酸乙酯和八种甜味剂能够同时进样开展快速分析，提高了分析工作效率，节省了分析资源，采用本发明的方法可以减少设备方法的频繁切换，并同时减少大量药品、试剂、耗材的使用，将单个样品的前处理和分析时间缩短至半小时内，克服了现有检测技术所存在的不足。
具体实施方式
[0043]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0044]
实施例
[0045]
1、溶液配制
[0046]
1.1、配制0.1％甲酸溶液，移取质谱纯甲酸1ml，用超纯水定容至1000ml，得到浓度为0.1％的甲酸溶液；
[0047]
1.2、甜味剂标准溶液配制，用烧杯分别称取8种甜味剂标准品(安赛蜜、糖精钠、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜、甜菊糖苷、甜蜜素、阿力甜)各0.02g(均称至0.0001g，称取量在标识值左右)，用超纯水溶解后分别倒入50ml容量瓶中，用适量超纯水洗涤烧杯内壁多次，洗液并入容量瓶中，最后用超纯水定容至刻度，充分混匀，分别得到浓度大致为0.4g/l浓度的各甜味剂标准溶液(浓度以计算为准)；
[0048]
1.3、甜味剂混合标准溶液配制，在10ml容量瓶中加入适量超纯水，用移液枪吸取上述甜味剂标准溶液各10μl于其中，轻摇，然后用超纯水定容至刻度，并充分混匀，经过计算，得到一定浓度的甜味剂混合标准溶液；
[0049]
1.4、ec储备液配制，准确称取0.05g(精确到0.1mg)ec标准品，用甲醇溶解并定容至50ml棕色容量瓶中，得到浓度为1.00mg/ml的ec储备液，于0－4℃下保存；
[0050]
1.5、ec中间液配制，准确吸取ec储备液50μl，用甲醇定容至50ml，得到浓度为1.00μg/ml的ec中间液，于0－4℃下保存；
[0051]
1.6、甜味剂/ec混合标准工作溶液1配制，准确吸取上述甜味剂混合标准溶液5ml，ec中间液2ml于10ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度，并充分混匀，经过计算，得到一定浓度的甜味剂/ec混合标准工作溶液1；
[0052]
1.7、甜味剂/ec混合标准工作溶液2配制，准确吸取上述5ml混合标准工作溶液1于10ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度，并充分混匀，经过计算，得到一定浓度的甜味剂/ec混合标准工作溶液2；
[0053]
1.8、甜味剂/ec混合标准工作溶液3配制，准确吸取上述5ml混合标准工作溶液2于10ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度，并充分混匀，经过计算，得到一定浓度的甜味剂/ec混合标准工作溶液3；
[0054]
1.9、甜味剂/ec混合标准工作溶液4配制，准确吸取上述5ml混合标准工作溶液3于10ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度，并充分混匀，经过计算，得到一定浓度的甜味剂/ec混合标准工作溶液4；
[0055]
1.10、甜味剂/ec混合标准工作溶液5配制，准确吸取上述5ml混合标准工作溶液4于10ml容量瓶中，用超纯水定容至刻度，并充分混匀，经过计算，得到一定浓度的甜味剂/ec混合标准工作溶液5；
[0056]
1.11、取乙醇体积分数为40％的、不含ec和甜味剂的空白酒样作为酒样稀释剂，然后按照上述步骤1.2－1.10的方式，将超纯水替换为酒样稀释剂，配制得到对应浓度的甜味剂/ec混合空白加标样品工作溶液1－5(为了更简洁、方便地展示本发明，用空白加标样品工作溶液作为样品模拟物来代表待测酒样，进而省略了采用待检酒样与酒样稀释剂按一定比例混合后作为待测试样等步骤)。
[0057]
2、检测方式
[0058]
2.1、方法验证：运行液质联用仪，设定好色谱检测条件和质谱检测条件，按照常规进样方法，先进样甜味剂/ec混合标准工作溶液，然后再进样甜味剂/ec混合空白加标样品工作溶液(实际应用时，进样空白加标样品工作溶液后，还需进样待测样品工作溶液)，通过仪器上配套的软件分别得到相关检测数据，然后再通过软件对比计算两种工作溶液检测数据的差异，依据计算结果验证误差，误差符合要求，则进行下一步；
[0059]
2.2、在相同条件下，按照常规进样方法，进样待测试样，得到相关检测数据，对比甜味剂/ec混合标准工作溶液的检测数据，得到样品氨基甲酸乙酯和甜味剂的定性和定量分析结果。
[0060]
3、色谱检测条件
[0061]
色谱柱：shim－pack gist c18 2.1mm
×
100mm 2μm(或性能相当者)；
[0062]
流动相a：0.1％甲酸溶液；流动相b：甲醇；
[0063]
流速：0.4ml/min；进样体积：10μl；
[0064]
进样方式：自动进样；柱箱温度：40℃；
[0065]
梯度条件如下表：
[0066]
时间min流速(ml/min)％a％b0.50.40080.020.03.00.40010.090.04.00.40010.090.0
4.100.40080.020.0
[0067]
4、质谱检测条件
[0068]
离子源：电喷雾离子源；
[0069]
扫描方式：ec和asp正离子模式，其余负离子模式；
[0070]
检测方式：多反应监测mrm；
[0071]
离子源温度：300℃；dl温度：250℃；加热块温度：400℃；
[0072]
雾化气流量：3.0l/min；干燥气流量：10.0l/min；加热气流量：10.0l/min
[0073]
ec(氨基甲酸乙酯)：m/z＝90([m+h]
+
)，分子量：89.09；
[0074]
stv(甜菊糖苷)：m/z＝803([m－h]
－
)，分子量：804.88；
[0075]
sl(三氯蔗糖)：m/z＝395([m－h]
－
)，分子量：397.63；
[0076]
ak(安赛蜜)：m/z＝162([m－k]
－
)，分子量：201.24；
[0077]
asp(阿斯巴甜)：m/z＝295([m+h]
+
)，分子量：294.31；
[0078]
sa(糖精钠)：m/z＝182([m－na]
－
)，分子量：204.98；
[0079]
sc(甜蜜素)：m/z＝178([m－na]
－
)，分子量：201.22；
[0080]
ntm(纽甜)：m/z＝377([m－h]
－
)，分子量：378.46；
[0081]
alt(阿力甜)：m/z＝330([m－h]
－
)，分子量：331.43；
[0082]
各组分的定量离子对如下：ec90/62、stv803/641、ak162/82、sa182/42、sc178/80、sl395/359、asp295/120、ntm377/200、alt330/312。
[0083]
5、标准曲线的绘制
[0084]
s1、各组分的定量离子对如下：ec 90/62、stv 803/641、ak 162/82、sa 182/42、sc 178/80、sl 395/359、asp 295/120、ntm 377/200、alt 330/312；
[0085]
s2、按照确定的液相色谱－质谱联用条件，待仪器处于稳定状态后，分别对以上各浓度的甜味剂/ec混合标准工作溶液取10ul进样检测分析，以各组分的浓度为横坐标，对应的离子流的强度为纵坐标，绘制标准曲线(或回归方程)。
[0086]
6、定性确证
[0087]
s1、按照标准曲线绘制时的液相色谱－质谱联用条件，对样液检测分析，得到液相色谱－质谱联用选择离子色谱图，从色谱图中分别得出甜味剂和ec色谱峰的保留时间，从甜味剂和ec色谱峰中又得到各对应物质质谱图；
[0088]
s2、将样液液相色谱－质谱联用选择离子色谱图与甜味剂/ec混合标准工作溶液选择离子色谱图进行比较，若保留时间大致相同，再根据产生的两组离子对之间的丰度比(离子对的选择m/z：ec 90/62、stv 803/641、ak 162/82、sa 182/42、sc 178/80、sl 395/359、asp 295/120、ntm 377/200、alt 330/312)，按照下表要求对甜味剂和ec进行定性确证；
[0089]
s3、在相同实验条件下，样液中待测物质的保留时间与标准工作溶液中对应的保留时间偏差在
±
2.5％之内，且试样谱图中各组分定性离子的相对丰度与标准工作溶液中定性离子的相对丰度，其允许偏差不超过下表1规定的范围时，则可确定为样品中存在这种待测物。
[0090]
表1定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
[0091]
相对离子丰度(％)＞50＞20－50＞10－20≤10
允许最大偏差(％)
±
20
±
25
±
30
±
50
[0092]
7、定量测定
[0093]
吸取待检酒样(实际应用时，待检酒样与空白酒样按1：1的比例混合，由于本实施例将空白加标酒样作为待检酒样，因此无需该步骤)，用针式过滤器滤入样品瓶中，放在自动进样器样品盘上，按照标准曲线绘制时的液相色谱－质谱联用条件自动进样分析，或将待测酒样除去醇类等干扰物质后定容分析。
[0094]
7、结果计算与表述
[0095]
由色谱数据处理机自动计算结果乘以2直接得出样品中甜味剂含量，计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留整数。试样中ec含量按下式计算：
[0096][0097]
式中：c——样品中ec含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
[0098]
x——测定液中ec含量，单位为微克每升(μg/l)；
[0099]
ρ——样品密度，单位为克每毫升或克每立方厘米(g/ml)；
[0100]
1000——换算系数。
[0101]
8、方法验证
[0102]
方法验证结果如表2所示：
[0103]
表2方法验证结果
[0104]
[0105][0106]
表3选择性确认数据和结果
[0107][0108]
由表3可以得到，通过对比甜味剂/ec混合标准工作溶液和甜味剂/ec混合空白加标样品工作溶液的保留时间得到，其偏差不超过0.1min，由此说明，空白酒样(空白基质)在各组分保留时间无干扰峰，不会影响最终结果。
[0109]
表4标准溶液线性确认结果
[0110]
[0111][0112]
由表4可以得到，相关系数均大于0.997，线性良好，说明空白酒样(空白基质)在各组分保留时间无干扰峰，不会影响最终结果。
[0113]
表5基质效应确认数据和结果
[0114][0115]
由表5可以得到，基质效应的绝对值小于10％，说明基质效应比较小，可以不用校正。
[0116]
表6检出限、定量确认数据和结果
[0117][0118]
由表6可以得到，试样＜2ml，ec检出限1μg/kg，定量限4μg/kg，能满足分析要求。
[0119]
表7－1方法精密度确认数据和结果
[0120]
[0121][0122]
表7－2方法精密度确认数据和结果
[0123]
[0124][0125]
表7－3方法精密度确认数据和结果
[0126]
[0127][0128]
表8－1中间精密度确认数据和结果
[0129]
[0130][0131]
表8－2中间精密度确认数据和结果
[0132]
[0133]
[0134][0135]
表8－3中间精密度确认数据和结果
[0136]
[0137][0138]
由表7和表8可以得到，使用三个不同浓度各组分溶液做方法精密度测试，三个不同检测人员在不同浓度组分溶液的检测做中间精密度试验，两者rsd＜15％，精密度符合要求。
[0139]
表9回收率测试结果
[0140]
[0141]
[0142][0143]
由表9可以得到，各组分的回收率在69％－120％之间，回收率满足本标准要求。
[0144]
表10空白加标样品测定结果
[0145]
[0146][0147]
表11相关不确定度来源表
[0148][0149]
表12含量重复性测定不确定度分量计算表
[0150]
ecstvslakaspsascntmalts
｀x
1.92211.49183.59341.40901.20260.34451.55931.82331.2824u
(｀x)
0.0080.0140.040.010.0110.0040.0140.0190.016
[0151]
表13密度重复性测定不确定度分量计算表
[0152][0153]
表14标准曲线拟合不确定度分量计算表
[0154][0155]
表15标准物质引入不确定度计算表
[0156][0157]
表16合成不确定度和扩展不确定度表
[0158]
ecstvslakaspsascntmaltuc0.120.110.120.110.120.10.110.110.11uc0.30.290.30.280.290.280.280.290.28
[0159]
由表10－16可以得到，经过在实验条件下的不确定度评估，各组分评价不确定度为29％，结果满足标准要求。
[0160]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。