一种眼镜科蛇毒素和蝰科蛇毒素的检测方法及应用与流程

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体地说是一种眼镜科蛇毒素和蝰科蛇毒素的 检测方法及应用。


背景技术：

2.我国有210多种蛇，隶9科66属，其中毒蛇60余种，剧毒类10余种(2018 年中国蛇伤救治专家共识，中国蛇伤救治专家共识专家组)。我国常见的毒蛇：
⑴
眼 镜蛇科：眼镜蛇(naja atra简写n.atra)、眼镜王蛇(ophiophagus hannah)、金环 蛇(bungarus fasciatus，简写b.fasciatus)、银环蛇(bungarus multicinctus，简写b. multicinctus)；
⑵
蝰蛇科：蝰蛇(daboia russelii siamensis，简写：d.siamensis)、 尖吻蝮(deinagkistrodon)、烙铁头(trimeresurus mucrosquamatus，简写：t. mucrosquamatus)、蝮蛇(agkistrodon halys)、竹叶青(trimeresurus stejnegeri简写 t.stejnegeri)。
⑶
海蛇科：青环海蛇(hydrophis cyanocinctus)等16种(中国毒 蛇及蛇伤救治，2008蓝海)。
3.毒蛇咬伤是一种急性伤害，咬伤之后发病快、病情转变快。有的蛇毒会在2-3 小时内致人死亡，患者缺乏抢救时间。即使不致人死亡，也会引发并发症，蛇毒可 以造成脏器功能严重损坏，这使得被毒蛇伤害的患者治疗上存在很更多困难。
4.目前，临床上蛇伤诊断与鉴别，包括如下三个主要方面：(1)毒蛇与无毒蛇咬 伤鉴别依靠牙印形状和伤口情况。(2)各种毒蛇蛇伤鉴别依靠医生的经验凭借局部 和全身性症状来判断；(3)蛇伤严重程度依靠蛇伤临床严重度简易评估表或蛇咬伤 严重度评分量表来判断(2018年中国蛇伤救治专家共识，中国蛇伤救治专家共识专 家组)。在田地里面干活的农民或者野外工作者，在蛇咬伤后，由于没有简便的检测 手段，无法分辨出具体的蛇种，无法判断是否被常见毒蛇咬伤。同样，在医院内也 无特异性蛇毒检测方法，只可以进行实验室常规性检查，包括凝血酶、血细胞和神 经肽等检测。这些检测不但花费时间比较长，容易错过最佳治疗窗口期，而且也不 能鉴定蛇伤由何科和何种的蛇毒引起，因此，蛇伤诊断与鉴别严重依靠医生个人经 验和技能。基层医生可能缺乏诊断经验而导致患者死亡。因此，急需开发一种可以 快速检测方法以供野外和临床上使用，以鉴定是否受到毒蛇咬伤甚至何种毒蛇咬伤。
5.目前蛇毒检测的方法主要分为以下三类(李章勇等，体内蛇毒检测研究进展， 2015)。
⑴
酶联免疫(elisa)法。elisa蛇毒及其抗体检测方法最早由theakston 等人于1983年最先提出使用，可以精确的检测到1-5ng/ml以内的蛇毒抗原(anntrop med parasitol，1983，77(3)；311-314)，经过多年研究结果表明：elisa法 准确、灵敏、特异性高等优点，对体内蛇毒的检测比较适合。其缺点在于不适用于 野外作业时即时检测；
⑵
化学发光检测法。其灵敏度比酶联免疫(elisa)法高， 其缺点是需要在实验室里面执行，且需要专门的仪器设备。(3)胶体金检测卡。这 一方法由于适用于野外作业时即时性和筛查需求，可以和elisa法在医院使用的场 景相互补充使用。由于蛇毒是由多种有一定亲缘关系的毒素组成，用这些天然的蛇 毒免疫所得抗体作为检测试剂，产生一定程度的交叉反应难以避免。
如labrousse等 曾采用elisa方法检测感染兔血清样本中的蝰蛇毒。该方法一般用时在20min左 右，需血量200ul左右。但其特异性较差，并且交叉反应较多。又比如chandler等 提取了澳大利亚地区毒性很强的6种蛇毒的抗血清，将它们联结到6段玻璃管上， 然后将玻璃管与一个注射器相接，制成一种免疫诊断的试剂盒。这种试剂盒在30min 内便可对能蛇伤做出诊断，虽然灵敏度较高，但非特异性反应干扰大。
6.随着蛋白质组学发展，对各种毒蛇的蛇毒进行了分离纯化及成份测定。，眼镜科 毒蛇蛇毒中都独特地含有三指蛋白(three-finger toxin，3ft)，而蝰科毒蛇蛇毒中都 独特地含有(snake venom serine proteases，svsp)、ctl/snaclec(c-type lectinsand c-type lectin like)和disintegrin。眼镜科蛇毒主要含有蛇毒金属酶(snake venom metalloprotease，svmp)、磷酸二酯酶(phospholipase a2，pla2)和三指毒素蛋白 (3ft)等，然而眼镜科的毒蛇中，各类蛇毒的含量也是有差异，如银环蛇蛇毒中 有16％pla2、4％svmp、75％3ft及其它蛋白；眼镜蛇蛇毒中有12％pla2、1.6％ svmp、84％3ft及其它蛋白；而眼镜王蛇蛇毒中有2.8％pla2、11.9％svmp、64.5％ 3ft及其它蛋白(a review and database of snake venom proteomes，2017，theotasoulis and geoffrey k.isbister)。


技术实现要素：

7.本发明为克服现有技术的不足，提供一种眼镜科蛇毒素和蝰科蛇毒素的检测方 法及应用，从寻找蝰科蛇毒和眼镜科蛇毒复杂蛋白家族成员中寻找差异蛋白，对其 线性抗原表位预测，去除相同和高度相似的线性抗原表位，将其串联重组表达，然 后获得特异性抗原，具有鉴定蝰科蛇毒和眼镜科蛇毒的作用。
8.为实现上述目的，设计一种眼镜科蛇毒素和蝰科蛇毒素的检测方法，其特征在 于：
9.(1)利用svsp嵌合体和disintegrin嵌合体的混合物、3ft嵌合体的两种抗原 免疫所得的抗体，可以有效鉴定眼镜科蛇毒素和蝰科蛇毒素；
10.(2)利用multicinctus 3ft嵌合体、atra 3ft嵌合体的两种抗原免疫所得的抗体， 可以有效鉴定眼镜科蛇毒素和银环蛇蛇毒素；
11.(3)运用阳离子交换层析法富集样本中的蛇毒，提高了血液、组织液中待测蛇 毒的灵敏度；
12.(4)首次建立了眼镜蛇和银环蛇蛇毒标准品。
13.所述的检测方法适用于elisa法、胶体金检测卡法、化学发光法和荧光法。
14.所述的svsp嵌合体、disintegrin嵌合体、3ft嵌合体、multicinctus 3ft嵌合 体及atra 3ft嵌合体的制备方法，具体流程如下：
15.s1，根据四种蝰科毒蛇蛇毒和四种眼镜科蛇蛇毒进行进化树及线性表位预测，获 得重组抗原；
16.s2，将重组抗原，通过与多肽串联、基因合成并转入大肠杆菌bl
21
(de)3中， 制备获得svsp嵌合体、disintegrin嵌合体、3ft嵌合体、multicinctus 3ft嵌合 体、atra 3ft嵌合体；
17.s3，将步骤s2中的5种嵌合体，制备成4种抗体。
18.所述的步骤s1的具体流程如下：
19.s1-1，四种蝰科毒蛇蛇毒在uniprotkb库中以svsp作为关键词，获得若干蛋白 序列；
20.s1-2，将s1-1的序列利用uniprotkb网站上的进化树工具分析；
21.s1-3，从中选取8条序列，在ideb数据库中进行抗原预测，选取阈值大于0.5 者且长度大于5aa者，为入选的svsp序列及预测线性抗原表位；
22.s1-4，将s1-3中的线性抗原表位中，去除相同或者高相似序列，得到预测线性 抗原表位汇总，获得氨基酸序列如seq id no:1～seq id no:38所示；
23.s1-5，四种蝰科毒蛇蛇毒在uniprotkb库中以disintegrin作为关键词，获得若干 蛋白序列；
24.s1-6，重复步骤s1-2～s1-4，获得氨基酸序列如seq id no:39～seq id no:93所 示；
25.s1-7，四种眼镜科蛇蛇毒在uniprotkb库中以three-finger toxin作为关键词，获 得若干蛋白序列；
26.s1-8，重复步骤s1-2～s1-4，获得氨基酸序列如seq id no:94～seq id no:135 所示。
27.所述的步骤s2的具体流程如下：
28.s2-1，将序列seq id no：1-38使用gg、ggg、gggs、kk进行串联，获得 序列seq id no：136，其核苷酸优化后的序列为seq id no：137；
29.s2-2，将序列seq id no：136和多肽使用gg、ggg、gggs、kk串联，获得 序列seq id no：138，其核苷酸优化后的序列为seq id no：139；并将序列 seq id no：138定义为svsp嵌合体；
30.s2-3，将序列seq id no：39-93和多肽使用gg、ggg、gggs、kk串联，获 得序列seq id no：140，其核苷酸优化后的序列为seq id no：141；
31.s2-4，将序列seq id no：140进行基因合成并转入大肠杆菌bl21(de)3中， 获得disintegrin嵌合体；
32.s2-5，将序列seq id no：94-135和多肽使用gg、ggg、gggs、kk串联， 获得序列seq id no：142，其核苷酸优化后的序列为seq id no：143；
33.s2-6，将序列seq id no：142进行基因合成并转入大肠杆菌bl21(de)3中， 获得3ft嵌合体；
34.s2-7，将序列seq id no：94、seq id no：96和seq id no：97使用gg串 联，获得序列seq id no：144；序列seq id no：144的多肽序列命名为 multicinctus 3ft嵌合体；
35.s2-8，将序列seq id no：98-101、seq id no：103-105和多肽使用gg、gggs 串联，获得序列seq id no：145，其核苷酸优化后的序列为seq id no：146； s2-9，将序列seq id no：145进行基因合成并转入大肠杆菌bl
21
(de)3中， 获得atra 3ft嵌合体。
36.所述的多肽为上破伤风的cd4+t的hla-dr限制性表位。
37.所述的步骤s3的具体流程如下：
38.s3-1，选择12只新西兰大耳白兔，随机分为四组；
39.s3-2，分别免疫：(1)svsp嵌合体+disintegrin嵌合体，两者按照浓度1：1混 合；
用，从寻找蝰科蛇毒和眼镜科蛇毒复杂蛋白家族成员中寻找差异蛋白，对其线性抗 原表位预测，去除相同和高度相似的线性抗原表位，将其串联重组表达，然后获得 特异性抗原，具有鉴定蝰科蛇毒和眼镜科蛇毒的作用。
56.这种方法即比较全面覆盖两个蛇科中的差异蛋白，也能够减少表达蛋白的大小。 同理，在眼镜科的四种毒蛇中，比较了眼睛蛇蛇毒和银环蛇蛇毒中高丰度3ft蛋白 的差异性线性抗原表位，制备的抗体可以将它们四种眼镜科蛇毒相区别。
附图说明
57.图1为四种蝰科毒蛇中svsp蛋白进化树。
58.图2为四种蝰科毒蛇中disintegrin蛋白进化树。
59.图3为四种眼镜科毒蛇中3ft蛋白进化树。
60.图4为重组蛋白表达sds-page检测。其中，1为atra 3ft；2为3ft嵌合体； 3为disintegrin嵌合体；4为svsp嵌合体；5为seq id no：136表达产物；m为 蛋白标记(marker，购自伯乐#161-0377)，从上至下分子量为：250、150、100、75、 50、37、25和10kd。
61.图5为马抗眼镜蛇抗血清纯化hplc。图中，(1)为protein g纯化；(2)为将 诶辛酸沉淀法。
62.图6为及阳离子层析法纯化眼镜蛇蛇毒层析图。图中1和2分别代表缓冲液ph 值和电导；a、b、c为od280检测时蛋白出峰，a为上样流穿液，b为线性洗脱 时第一个出峰(nacl浓度180—250mm)；c为线性洗脱时第二个出峰(nacl浓 度280—350mm)。
63.图7为眼镜蛇和银环蛇蛇毒的标准品sds-page。其中，1为眼镜蛇(10ug)； 2为及银环蛇(10ug)；3为眼镜蛇(20ug)；4为银环蛇(20ug)；5为眼镜蛇(40 ug)；6为银环蛇(40ug)；m为蛋白标记(marker，购自伯乐#161-0377)，从上至 下分子量为：250、150、100、75、50、37、25、15和10kd。
64.图8为胶体金检测卡检测银环蛇蛇毒和眼镜蛇蛇毒：(a)马抗眼镜蛇抗血清检 测；(b)马抗银环蛇抗血清检测；(c)atra 3ft及multicinctus 3ft抗体检测；(d) atra 3ft及multicinctus 3ft抗体检测特异性。
具体实施方式
65.下面根据附图对本发明做进一步的说明。
66.1.免疫抗原筛选。
67.1.1眼镜蛇和银环蛇天然蛇毒灭活及马匹免疫：
68.将眼镜蛇和银环蛇蛇毒灭活，并免疫马匹获得血浆，该两种血浆作为原料。
69.1.2重组抗原制备：
70.1.2.1四种蝰科毒蛇蛇毒中独有蛋白的线性表位表达：
71.1.2.1.1四种蝰科毒蛇毒中svsp进化树及线性表位预测：
72.在uniprotkb库中(www.uniprot.org)，以关键词“svsp siamensis and reviewed： yes”得到6条蛋白序列，以“svsp deinagkistrodon and reviewed：yes”得到6条蛋 白序列，以“svsp mucrosquamatus and reviewed：yes”得到7条序列，以“svspstejnegeri and reviewed：yes”得到25条蛋白序列，将这些序列利用uniprotkb网 站上的
进化树工具分析，进化树分析的结果见图1所示。
73.图1表明：在进化树中，a和b支为蝰蛇，c和d支主要为烙铁头，e支为蝮 蛇，g、h和i支为竹叶青，j、k、m和n中的序列四种蛇都有的。
74.从其中选取8条序列，在ideb数据库(http：//tools.immuneepitope.org/bcell/) 中进行抗原预测，选取阈值大于0.5者且长度大于5aa者，为入选的svsp序列及预 测线性抗原表位，如表1所示。将表1中这些预测线性表位去除相同或者高相似序 列，得到预测线性抗原表位汇总，如表2所示。
75.表1
[0076][0077]
表2
[0078]
序号氨基酸序列序号氨基酸序列seq id no：1skkvlnedeqtrnseq id no：20sstkdilpdvpseq id no：2knnnevldkseq id no：21ecvapypseq id no：3pvketfpseq id no：22ggidtchqdsgseq id no：4ggkdtcggdsseq id no：23ypcaqprseq id no：5hscgqgpseq id no：24aqrtselseq id no：6tdwiqrnseq id no：25svefdyeetryseq id no：7havcqseq id no：26sknytkwdseq id no：8ecdinseq id no：27spnetfpdseq id no：9kyvkfddeqgreseq id no：28tcarprseq id no：10yfyncsnnlttrdseq id no：29kkllnedeqirnseq id no：11psrdvlpdseq id no：30pievtypseq id no：12pcaqpnmseq id no：31pcgqslkseq id no：13aqksselseq id no：32qkspelvseq id no：14kkvlnedeqtrnseq id no：33ptkvtypseq id no：15pvketfpdseq id no：34lkvlnkdalrrfpkekyfclnirndtiwdseq id no：16ypellaseq id no：35spnatlp
seq id no：17hpcgqgpseq id no：36yavcqaseq id no：18siqfddeqrseq id no：37npcaqprkpseq id no：19yyrcdekltkweseq id no：38ytdwiqsiisgntda
[0079]
1.2.1.2四种蝰科毒素的disintegrin进化树及线性抗原表位预测：
[0080]
将是1.2.1.1中检索关键词svsp换为disintegrin，进行相同的操作(包括进化 树、线性表位预测及去除相同或高度相似的预测线性表位)，一共查得13条蛋白序 列，进化树分析结果，如图2所示，从进化树看，每种蛇毒中的disintegrin蛋白基 本上独立成为一支，亲缘关系较远。因此四种毒蛇各选一个成员进行线性表位预测， 为入选的disintegrin序列及预测线性抗原表位，如图表3所示，去除相同或高度相 似序列，得到去除相同或者高度相似的预测线性抗原表位汇总，如表4所示。
[0081]
表3
[0082][0083]
表4
[0084]
序号氨基酸序列序号氨基酸序列seq id no：39ssiilesgnvndye；seq id no：67snddehkgmvlpgtkcadseq id no：40kvtalpkgavqqpeqkyed；seq id no：68ssiilesgnvddy；seq id no：41yypdgreittnppve；seq id no：69prrvsalpkgavqpkyed；seq id no：42plklsnsea；seq id no：70yspdgreittypsved；seq id no：43eniekedeipkmcgvtqtnwesdkpikkasqlvstsaqfnk；seq id no：71plklpdsea；seq id no：44kkcnsta；seq id no：72iydinlcrydysangmvaqgtkcaseq id no：45cdrdlinvtss；seq id no：73yikynrdsnki；seq id no：46ewrasdlmtrks；seq id no：74sqndlitvqpassit；seq id no：47myhdgkncic；seq id no：75gnwrktvllnqqnh；
seq id no：48lsdqpskl；seq id no：76dedknekkck；seq id no：49ihdyqryltrykpkcifnpplrkdivsppvcgneiweegeecdcgspancqn；seq id no：77sdppaqlfsdc；seq id no：50cdaatcklkpgae；seq id no：78lnaplrtdtvstpvsgnefleageecdcgspenpcc；seq id no：51ccyqckiktagtvcrrardecdvpehctgqsaecprdqlqqngkpcqn；seq id no：79aatcklrpgaqca；seq id no：52dcpimrnqcislfgsranvakdscfqenlkgsyygycrkengrkipcap；seq id no：80qcrfkkkrticrrargdnpddrctgqsadcprngseq id no：53nsprnknpc；seq id no：81rkvtavpkgavqqkyed；seq id no：54scmdqhkgmvdpgtkcedgkvcnnkrqcv；seq id no：82yspdgreittypsved；seq id no：55vntayqsttgseq id no：83lklpdsea；seq id no：56spdgreitinppved；seq id no：84yenvekeeeapkmcgvtetnwksdepikkasqlvvtaeqqrfpr；seq id no：57epmklsdsea；seq id no：85ytkhkknl；seq id no：58envekedeapkmcgvtqkwksyepikkisqlnlpeqqiydp；seq id no：86wkkndkitaqsasn；seq id no：59kyngdld；seq id no：87nwretvllkrkr；seq id no：60edkitvkpd；seq id no：88dhdgnqcn；seq id no：61ewrktyllaekk；seq id no：89innppserfsgcsmg；seq id no：62spepsk；seq id no：90ltaynpqcilnalskrdiitppvcgnelleegeecdcgspencqyqccna；seq id no：63dfimnhnpecidneplgtdiispplcgnellevgeecdcgtpencqneccdaatcklksgsqc；seq id no：91tcklhswvece；seq id no：64cceqckfrtsgtecrasmsecdpaehctgqssecpadvfhkngepcld；seq id no：92ecceqcrfkkagavcraartecdipenctdqsadcptdsfhrngqpcly；seq id no：65ncpimyhqcyalfgadiyeaedscfesnkkgnyygycrkengkkipcasedv；seq id no：93cpvmhyqcyglfgpnatvgqdgcfdandrgdeyfycrkenekyipcaqedv；seq id no：66kddspgqnn；
ꢀꢀ
[0085]
1.2.1.3串联表达svsp蛋白序列预测线性抗原表位：
[0086]
将表2中seq id no：1-38使用gg、ggg、gggs、kk等串联起来，形成嵌 合体seq id no：136，其核苷酸优化后的序列为seq id no：137。
[0087]
为了增强其诱导抗体表达能力，在seq id no：136串联上破伤风的cd4+t的hla-dr限制性表位，即多肽(pitinnfrysdpvnndtiim和 yckgldiyykafkit)，因此形成序列seq id no：138，其核苷酸优化后的序列 为seq id no：139。
[0088]
将序列seq id no：137和seq id no：139送上海生物工程有限公司或者上 海捷瑞生物工程有限公司进行基因合成(以下简称基因合成)，并转入大肠杆菌bl
21 (de)3中制备
蛋白。其表达蛋白用sds-page检测，如图4所示。
[0089]
1.2.1.4将seq id no：138和seq id no：136的表达产物免疫小鼠：
[0090]
将6只成年balb/c鼠随机分为2组，分别注射seq id no：136和seq id no： 138所表达的嵌合体。首次免疫蛋白均为20μg/只嵌合体，与适量弗氏佐剂混合，利 用无菌注射器进行乳化后注射；间隔2周后进行再次免疫，用不完全弗氏佐剂替代 完全弗氏佐剂，嵌合体蛋白剂量仍分别为20μg/只，重复再次免疫4次(每次间隔2 周)，即1次首次免疫、4次再次免疫。然后采取静脉取血，将每组3只小鼠的血清 按照等体积混合，用于下面的elisa法比较两种嵌合体的免疫性。
[0091]
1.2.1.5利用elisa法比较seq id no：138和seq id no：136免疫小鼠的效 果：
[0092]
在96孔板的每孔中分别加入100μl含的5ug未灭活蝮蛇蛇毒的0.05mol/l ph 9.6碳酸盐缓冲液，4℃包被过夜；用250μl封闭液[2％bsa(0.05％tween-20和 5％乳糖)]37℃封闭2h；阳性血清以ph 7.4的磷酸盐缓冲液稀释100、200、400、 800、1600倍，阴性血清(未进行抗原免疫小鼠血清)按阳性血清同倍稀释，每孔 中加入100μl，每个稀释度重复3孔，检测取平均值，选择阳性血清与阴性血清a450 比值(p/n值)最大的反应组，即为最好的抗原。
[0093]
结果：将血清按照800倍稀释后，seq id no：138和seq id no：136的od450 读数依次为1.6和0.9，显然，seq id no：138嵌合体具有较高免疫性。因此，多 肽(pitinnfrysdpvnndtiim和yckgldiyykafkit)用于其他抗原的融合表 达，用于免疫和制备抗体。seq id no：138的表达产物命名为svsp嵌合体。
[0094]
1.2.1.6disintegrin嵌合体表达：
[0095]
采取与1.2.1.3相同的策略和方法，将表4中的seq id no：39-93和多肽 (pitinnfrysdpvnndtiim和yckgldiyykafkit)，使用gg、ggg、gggs、 kk等串联起来得到seq id no：140，其核苷酸优化后的序列为seq id no：141。 基因合成并转入大肠杆菌bl21(de)3中，最终获得表达产物，如图4所示。seqid no：140表达产物命名为disintegrin嵌合体。
[0096]
1.2.2四种眼镜科毒蛇蛇毒中特异性蛋白：
[0097]
1.2.2.1四种眼镜蛇蛇毒中高丰度蛇毒蛋白的确定：
[0098]
在pubmed(http：//pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)中，以语句“((naja naja) [title/abstract]or(bungarus multicinctus)[title/abstract]or(bungarus fasciatus) [title/abstract])and(proteomics[title/abstract]or proteomic[title/abstract])
”ꢀ
检索，截至2021年6月30日，一共有59篇文章，通过进一步分析，有3篇文章是 研究中国的眼镜蛇、银环蛇和金环蛇的蛇毒蛋白质组，其中两篇有3ft的丰度数据， 为眼镜蛇和银环蛇蛇毒中丰度大于1％的3ft及序列，如表5所示。
[0099]
表5
[0100][0101]
从表5可见，p60615和p60616的含量占到银环蛇整体蛇毒含量47％，而q9ptt0、 q9w6w9和q9deq3三个蛋白的含量占到眼睛蛇整体蛇毒含量的30％，它们为其 中的主要成份，可以考虑将它们分别作为检测对象。
[0102]
1.2.2.2 3ft进化树分析与线性抗原表位预测：
[0103]
在uniprotkb库中(www.uniprot.org)，以关键词“"three-finger toxin""bungarusfasciatus"and reviewed：yes”、“"three-finger toxin""bungarus multicinctus"andreviewed：yes”、“"three-finger toxin""naja atra"and reviewed：yes”和"three-fingertoxin""ophiophagus hannah"and reviewed：yes”检索，一共得到122条蛋白序列， 进化树分析的结果，如图3所示。
[0104]
从图3进化树看，每种毒蛇的3ft分别聚类，亲缘关系较远。为了确保检测到 每种毒蛇中3ft，眼镜蛇和银环蛇蛇毒中选取高丰度3ft，而金环蛇和眼镜王蛇则 在每一个进化枝上各选取一个成员，在进行线性抗原表位预测，为入选的3ft蛋白 序列及其预测线性抗原表位，如表6所示。
[0105]
表6
[0106][0107]
表7
[0108]
序号氨基酸序列序号氨基酸序列seq id no:94tatspisavtseq id no:115pqpkkewseq id no:95yrkmwcdvfcssrgkvseq id no:116ktgdriiseacppgqdlseq id no:96pskkpyeseq id no:117twcdvfcgtrgrviseq id no:97cnphpkqseq id no:118ptvkpheqseq id no:98chnqqssqtptttgcsggetncykkrwrdhrgyrtseq id no:119ncnphpkseq id no:99psvkngieseq id no:120dvtsqtcpdgseq id no:100rkcnklvplfyktcpaseq id no:121twcdawcgsrgkrvseq id no:101nlcykmfmvsnltvpv；seq id no:122pkvnpgvseq id no:102dvcpkssllvkseq id no:123dncnpfpseq id no:103ynhlsrtpetteicpdsseq id no:124cpkvkpgvdseq id no:104ladgndvriseq id no:125lntplpliyktcpigseq id no:105cpelrptgkseq id no:126kmtikklpskydvseq id no:106ysssmnkdsktcqkwetseq id no:127dicpkssadseq id no:107qeafkphssgmiiseq id no:128lkqepfqpettttseq id no:108kaqfpnietqckseq id no:129nlfwsdhseikseq id no:109qrdvkphpsseq id no:130chrvhglqtcepdqkfcfrkttmffpnhpvseq id no:110sscgkgamcngpsseq id no:131eeyckrihtcrdgenseq id no:111lnqqssepqttetcpngseq id no:132kgfyegkqlgkqfrseq id no:112ynktwnthrgsrtseq id no:133pegkpneseq id no:113kvkpgiseq id no:134heslffettetcsdgqnlcyakwfavfpgarrseq id no:114cltkysqdnessktcpsgqklcfkkwetgkllgtseq id no:135pdkvple
[0109]
1.2.2.3 3ft嵌合体重组表达：
[0110]
采取与1.2.1.5相同的策略和方法，将表7(去除高度相似或相同的预测线性抗 原表位汇总)中的seq id no：94-135和多肽(pitinnfrysdpvnndtiim和 yckgldiyykafkit)，使用gg、ggg、gggs、kk等串联起来得到seq id no： 142，其核苷酸优化后的序列为seq id no：143。基因合成并转入大肠杆菌bl
21 (de)3中，最终获得表达产物，如图4所示。seq id no：142的表达产物命名为 3ft嵌合体。
[0111]
1.3眼镜蛇和银环蛇差异性免疫原：
[0112]
表6中表明眼镜蛇的p60615和p60616的预测线性抗原表位基本上相同，由四 条序列seq id no：94-97组成，而眼镜蛇的预测线性抗原表位seq id no：102 与银环蛇的seq id no：95基本相同，如果采用它们，会有交叉反应，因此，去掉 seq id no：102和seq id no：95。
[0113]
银环蛇选中了seq id no：94、seq id no：96和seq id no：97，使用gg 串联起来得到序列seq id no：144，序列seq id no：144的多肽序列为： tatspisavtgg pskkpyegg cnphpkq，该序列命名为multicinctus 3ft嵌合体， 将该序列送吉尔生化合成，并将其使用血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin，klh) 连接。由于seq id no：144分子量很小，不容易产生较好免疫效果，一般会采取 和一个大分子如bsa、klh等藕联，以增强免疫效果。
[0114]
眼镜蛇选中seq id no：98-101和seq id no：103-105，和多肽 (pitinnfrysdpvnndtiim和yckgldiyykafkit)使用gg、gggs连接起 来，再串联一份拷贝，得到序列seq id no：145，其核苷酸优化后的序列为seqid no：146。基因合成并转入大肠杆菌bl21(de)3中，最终获得表达产物，如 图4所示。seq id no：145的表达产物命名为atra 3ft嵌合体。
[0115]
2.抗体的制备。
[0116]
2.1马抗眼镜蛇多抗的纯化：
[0117]
2.1.1 protein g纯化马抗眼镜蛇多抗：
[0118]
1、装柱及柱平衡：将100ml protein g(购自博格隆(上海)生物技术有限公 司的，货号：aa104307)装入26x40mm规格的层析柱(购自ge healthcare公司)； 使用3cv平衡缓冲液20mm pb(ph7.3
±
0.1)平衡柱子。
[0119]
2、将血浆8000rpm/min离心20min，留上清。过滤离心后血浆使用pb (ph7.3
±
0.1)缓冲液1：2稀释。
[0120]
3、上样：待基线平衡按照每2毫升填料上样1ml血浆，100ml填料上样150ml 血浆稀释液。重复上样2-3次。
[0121]
4、洗涤，使用3cv缓冲液20mm pb(ph7.3
±
0.1)洗涤。
[0122]
5、洗脱：gly-盐酸缓冲液(ph2.8
±
0.2)洗脱3-5cv，收集出峰样品。洗脱液 立即调节ph到中性。
[0123]
6、使用缓冲液20mm pb(ph7.3
±
0.1)冲洗柱子到ph中性，然后使用20％乙 醇保存柱子。
[0124]
7、按照实施例6.2执行hplc，检测收集产物。
[0125]
2.1.2辛酸沉淀法纯化：
[0126]
1、取血浆原液50ml，加入超纯水100ml，缓慢滴加正辛酸原液，使终浓度为 5％，并调节ph值保持在5-6之间，在室温下搅拌均匀后静置1小时。
[0127]
2、上清液用4℃，20分钟，12000rpm/min条件进行离心取上清。
[0128]
3、串联超滤：将过滤的蛋白液上清，先用100kd的超滤膜包超滤3次，收集 滤出液；然后再将滤出液用30kd的超滤膜包浓缩，收集浓缩液，同时替换成pbs 缓冲液。将纯化后的浓缩液使用hplc检测。
[0129]
2.1.3 protein g和辛酸沉淀法的纯化效果比较：
[0130]
2.1.3.1 hplc检测：
[0131]
从图5可见，protein g比辛酸沉淀纯化马多抗，其纯度偏低，辛酸沉淀法制备 了纯度高达95％多抗。可以用于后续产品研发。事实上，血浆中也有其他的蛋白可 以和protein g非特异性结合。
[0132]
2.1.3.2 elisa检测法比较纯化效果：
[0133]
参照1.2.1.5的elisa法，主要是差异之处如下：
[0134]
1、在96孔板的每孔中分别加入100μl含的10ug/ml未灭活的眼镜蛇蛇毒的0.05 mol/l ph 9.6碳酸盐缓冲液，4℃包被过夜。
[0135]
2、将protein g纯化和辛酸沉淀所得多抗，测定其蛋白浓度和依据hplc测定 的纯度，将其调整为igg起始量一致(igg含量1mg/ml)，以ph 7.4的磷酸盐缓冲 液稀释2000、4000、8000、16000、32000、64000和128000倍，作为一抗。
[0136]
3、以hrp标记的兔抗马igg(fc特异性，购自sigma，货号：sab3700145-2mg) 按照1：4000稀释后作为二抗，当od450读数位于1.0-1.5之间时，认为两者比例 合适。
[0137]
结果：当protein g纯化所得洗脱液稀释64000倍后，od450约为1.0，而辛酸 沉淀结合超滤所得的多抗稀释128000倍后，od450约为1.4.因此，protein g比辛 酸沉淀纯化马多抗的结合力低，可能与protein g极端洗脱条件(ph2.8)和protein g 与马的不同igg亚型结合力差异，导致部分igg丢失或者活性丧失有关。同样地， 将蛇毒偶联到介质上，采取免疫亲和层析纯化也有同样的问题，因此，本发明专利 采用辛酸沉淀法纯化马抗眼镜蛇和银环蛇的抗血清，获得多抗用于后续实验。
[0138]
2.2兔多抗制备：
[0139]
2.2.1兔多抗免疫：
[0140]
选择12只新西兰大耳白兔，随机分为四组。分别免疫：(1)svsp嵌合体 +disintegrin嵌合体(两者按照浓度1：1混合)；(2)3ft嵌合体；(3)multicinctus 3ft和(4)atra 3ft。第一次免疫采用弗氏完全佐剂0.5ml+0.5ml抗原(2mg/ml)， 皮下免疫3
‑‑
5个点，每隔21天进行一次加强免疫，免疫采用弗氏不完全佐剂 0.5ml+0.5ml抗原(2mg/ml)，皮下免疫3
‑‑
5个点，一共加强免疫5次，然后取血。
[0141]
2.2.2辛酸沉淀法纯化兔多抗：
[0142]
按照2.1.2的方法，制备2.2.1中的四种兔多抗。
[0143]
3.阳离子层析法富集样本。
[0144]
3.1阳离子层析法纯化眼镜蛇蛇毒：
[0145]
3.1.1 sp柱梯度纯化眼镜蛇蛇毒：
[0146]
1、装柱及柱平衡：将20ml sp sepharose 4ff装入16x20mm规格的层析柱(购 自ge healthcare公司)；使用3cv缓冲液20mm pb(ph6.8
±
0.1)平衡柱子。
[0147]
2、上样：眼镜蛇蛇毒在20mm pb(ph6.8
±
0.1)配成5mg/ml，以2ml/min上 样20ml，
2.5倍，显然有利于提高检测的患者蛇伤时的蛇毒含量。
[0169]
4.elisa检测法使用场景。
[0170]
4.1间接elisa确定抗体的特异性：
[0171]
参照1.2.1.5的elisa法，主要是差异之处如下：
[0172]
1、在96孔板的每孔中分别加入100μl含的10ug未灭活蛇毒的0.05mol/l ph 9.6 碳酸盐缓冲液，4℃包被过夜。包被的蛇毒包括四种眼镜科毒蛇(眼镜蛇、眼镜王 蛇、金环蛇和银环蛇)和五种蝰蛇科毒蛇(蝰蛇、尖吻蝮、烙铁头、蝮蛇和竹叶青)， 用于鉴定辛酸沉淀所得的马抗眼睛蛇和银环蛇抗血清、2.2.2所得的四种抗体。
[0173]
2、将2.1.2中用辛酸纯化后的马抗眼镜蛇和银环蛇蛇毒的多抗、2.2.2中获得四 种兔多抗调整为igg起始量一致(igg含量1mg/ml)，以ph 7.4的磷酸盐缓冲液稀 释2000、4000、8000、16000、32000、64000和128000倍，作为一抗。
[0174]
3、以hrp标记的鼠抗兔igg按照1：4000稀释后作为二抗，如果有显色反应， 当od450读数位于1.0-1.5之间时，就认为两者比例合适。
[0175]
结果：从表8(六种抗体组合检测9种蛇毒)可见：(1)即使过量包被(10ug/ml)， 四种兔多抗稀释16000倍仍无明显颜色反应，因此体现了抗体无交叉反应，这四个 分子免疫兔子后多产生的多抗，具有显著的特异性。(2)马抗银环蛇和眼镜蛇和其 他蛇毒均有交叉反应，因此，后续没有对这两种抗体继续研究。
[0176]
表8
[0177][0178]
说明：“x”代表没有颜色变化；“√”代表有明显的颜色变化。
[0179]
4.2 multicinctus 3ft和atra 3ft的兔多抗检测极限确定：
[0180]
4.2.1过碘酸钠法hrp标记multicinctus 3ft和atra 3ft的兔多抗：
[0181]
1、称取30mg hrp溶解于6ml蒸馏水中，加入1.2ml新配的0.1m naio 4溶 液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对1mm ph4.4的醋酸钠 缓冲液透析，4℃过夜。
[0182]
2、加120μl 0.2m ph9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化hrp的ph升高到9.0～9.5， 然后立即加入60mg igg(抗体)在6ml 0.01m碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌 2小时。
[0183]
3、加0.6ml新配的4mg/ml nabh 4液，混匀，再置4℃2小时。将上述液装入 透析袋中，对0.15m ph7.4 pbs透析，4℃过夜。
[0184]
4、在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃1小时。
[0185]
5、3000rpm离心半小时，弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物 溶于少量0.15m ph7.4的pbs中。
[0186]
6、将上述溶液装入透析袋中，对0.15m ph7.4的pb缓冲盐水透析，去除铵离 子后(用萘氏试剂检测)，10000rpm离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶结合物， 分装后，冰冻保
存。
[0187]
4.2.2双夹心elisa评估抗体检测限：
[0188]
参照1.2.1.5的elisa法，主要是差异之处如下：
[0189]
1、包被：在96孔板的每孔中分别加入100μl含10ug/ml hrp未标记的兔多抗 multicinctus 3ft或atra 3ft的0.05mol/l ph 9.6碳酸盐缓冲液，4℃包被过夜。
[0190]
2、在封闭并洗涤之后，加入梯度稀释(1μg-o.1ng)的银环蛇或眼镜蛇粗毒， 37℃孵育90min。其中选3孔不加任何蛇毒作为阴性对照。
[0191]
3、一抗：加入100ul hrp稀释度为1：2000的标记multicinctus 3ft和atra 3ft 的兔多抗(1mg/ml)常温孵育45分钟。
[0192]
4、洗涤之后，加入显色液和终止液，检测每孔450nm下的光吸收值。
[0193]
结果显示：以od450大于阴性对照读数2倍，认为是阳性和可以检测到该含 量，atra 3ft的兔多抗检测眼镜蛇的最低可到1ng/ml，而multicinctus 3ft检测银环 蛇的最低可到2ng/ml。
[0194]
4.3标准品制备：
[0195]
称取未灭活的眼镜蛇蛇毒冻干粉15g，溶解于1l纯化水，震荡混匀后，高速离 心(10000rpm，10min)，取上清液按每瓶500ul分装于西林瓶中进行冻干。冻干后 放置-80度冰箱储存。取10瓶冻干后蛇毒，分别用500ul水进行复溶，待溶解完全 后进行蛋白含量测定。使用紫外可见光光度计，紫外波长设置为280nm。取10瓶蛇 毒蛋白含量的平均值作为标准品蛋白的靶值。蛇毒成分分析采用sds-page电泳分 析，蛋白分离胶选择15％。
[0196]
按照同样的步骤制备银环蛇蛇毒标准冻干品，并进行蛋白含量和成分分析。
[0197]
结果显示：眼镜蛇毒标准品的蛋白浓度为12.5mg/ml，银环蛇毒标准品的蛋白 浓度为13.2mg/ml，且瓶间cv均小于3％。通过观察眼镜蛇毒与银环蛇毒的 sds-page电泳图，其特征条带3ft(分子量约10kd)可见，表明制备成功，如 图7所示。
[0198]
5.胶体金检测卡。
[0199]
5.1制备方法：
[0200]
5.1.1制备胶体金标记抗眼镜蛇毒/抗银环蛇毒特异性抗体的金标探针：
[0201]
将100ml 0.01％的氯金酸水溶液加热煮沸，搅动下加入1.6ml 1％的柠檬酸三钠 水溶液，直到液体颜色稳定成葡萄酒红色，得到胶体金溶液，调节ph至9.0，加 入终浓度为30-40μg/ml的抗体，搅拌20分钟，加入5ml 10％bsa，搅拌20分钟， 再加入1ml 10％peg2000，搅拌20分钟。5000rpm离心10分钟，吸取上清，将上 清在15000rpm再离心30分钟，弃上清，将沉淀保存于10ml 0.3％四硼酸钠溶液 中，得到标记的胶体金探针溶液。
[0202]
5.1.2组装眼镜蛇毒/银环蛇毒免疫层析检测试纸条：
[0203]
该试纸条由支撑板，样品垫，金标垫，检测膜和吸水垫构成，金标垫为吸附胶 体金标记抗体的玻璃纤维，检测膜为印迹眼镜蛇毒检测线t和质控线c的硝酸纤维 素膜，检测线t为抗体印迹(抗体包被浓度为4mg/ml)，质控线c为羊抗马igg二 抗印迹(二抗包被浓度为4mg/ml)。
[0204]
5.2特异性检测：
[0205]
分别配置不同浓度的眼镜蛇毒、银环蛇毒溶液(浓度为100ug/ml、50ug/ml、 10ug/ml、1ug/ml、100ng/ml等)，将上述不同浓度的溶液用5.1.1中制备的试纸条 进行检测。
[0206]
结果表明，所述眼镜蛇毒免疫层析试纸条检测银环蛇毒以及银环蛇毒免疫层析 试纸条检测眼镜蛇毒时，不论毒素浓度高低均只显示质控线c一条红色条带(图 8d)。而用马抗银环蛇和眼镜蛇检测，它们之间有交叉反应(如图8a、8b所示)。
[0207]
5.3灵敏度检测：
[0208]
将眼镜蛇蛇毒/银环蛇毒标准品(4.3中制备的蛇毒标准品)用pbs缓冲液(20mmpb，150mm nacl，ph 7.2)系列稀释(稀释后的浓度分别为10ng/ml，50ng/ml， 100ng/ml，1ug/ml和10ug/ml)，用5.1.1制备的试纸条进行检测。
[0209]
检测结果表明，银环蛇毒浓度高于50ng/ml时显现检测线t和质控线c两条红 色条带，银环蛇毒浓度低于50ng/ml则只显示质控线c一条红色条带。眼镜蛇毒浓 度高于10ng/ml时显现检测线t和质控线c两条红色条带，眼镜蛇毒浓度低于 10ng/ml则只显示质控线c一条红色条带(如图8c所示)。
[0210]
本发明的有益效果在于：首先，用串联重组表达眼镜科和蝰科各四种毒蛇的特 异性抗原表位，不但克服了天然来源的蛇毒毒性，也克服了来源于不同地区、蛇龄 甚至不同季节的蛇毒成份的差异，保证了免疫抗原的稳定性；而且免疫后所产生的 抗体可以有效鉴定毒蛇蛇伤的科的特性。其次，利用眼镜蛇和银环蛇蛇毒的特异性 抗原表位，免疫后所产生的抗体可以有效地鉴别眼镜蛇和银环蛇蛇毒。这些抗体适 用于elisa、化学发光法、荧光法和胶体金检验卡检测。最后，对样本中毒素进行 富集，提高了灵敏度，使检测方法具有临床实用价值。
[0211]
序列信息：
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216]
[0217]
[0218]
[0219]
[0220]
[0221]
[0222]
[0223]
[0224]
[0225]
[0226]
[0227]
[0228]
[0229]
[0230]
[0231]