一种微小组织的石蜡切片的制作方法及其应用

一种微小组织的石蜡切片的制作方法及其应用
1.技术领域
2.本发明涉及微小组织病理切片的包埋和观察方法，属于病理学研究领域。


背景技术：

3.17世纪中叶以来，显微镜开始应用于科学研究，光学显微镜中的体视显微镜由一个共用的低级物镜，利用双通道光路，为左右两眼提供一个具有立体感的图像。因其成像为正立三维像、可观察样品所有层，便于实际操作，在科研观察中得到广泛应用。
4.组织形态学标本制作过程中，一些较小样本的取材，我们选择在体式显微镜下操作，比如斑马鱼心脏、肝脏剥离，胎鼠样本脏器剥离等，因样本放大后有利于在不破坏原有结构的基础上进行分离取材。然而在石蜡标本制作过程中，肉眼观察常常由于微小样本特殊部位看不清导致无法精准包埋，手持放大镜一个人无法独立完成边观察边包埋，体视显微镜也无法放置于包埋机冷台边上进行观察操作。
5.临床外科手术标本，对于微小组织的处理一般会选择滴加伊红进行标记，以防止样本丢失，如纤维支气管镜、电子胃镜、肠镜下钳的样本，或者通过b超引导穿刺的肝、肺、前列腺等组织，这些样本的长径小于0.3cm，被称之为“微小组织”。在科研实验中，使用实验动物作为研究对象，常常会遇到更小的组织或者特定部位检材，比如观察斑马鱼眼球、心脏、胎鼠脏器、细胞球及类器官等。如何制作一张视野全面，形态俱佳的he切片，本文进行了深入的研究并得到一些体会。


技术实现要素：

6.为克服现有技术的缺陷，发明人想到了模拟体视显微镜的方法，将样本放大，实时观察并操作。我们采购的电子放大镜因体积小，支架随意放置，连接手机后还可以通过手机安装app打开并投屏在手机或者pad屏幕上进行实时观察及操作，借助显微放大技术能让我们更清晰的观察到样本的结构，一方面在取材时检材部位暴露更全面，细微结构更清晰，取材时不易被人为破坏；另一方面在包埋时可以一个人独立轻松且精准找到包埋面，解决了特殊部位包埋耗时耗人力且包埋面极容易偏离的难题，同时由于样本过小，在放大镜的观察下，组织不容易遗漏，通过高质量有效的包埋为后续染色提供了基本保障。
7.在样本制作过程中，全程手工操作，采用低浓度到高浓度逐渐过渡的脱水，透明浸蜡随时监控，每一个环节都需要操作者具备极强的责任心，严谨的科学态度，耐心细心，操作过程中要眼观样本，手上操作快、准、稳，这需要大量的操作经验积累。该方法利用电子放大镜的放大功能，有效解决了微小样本不利于观察，容易遗漏丢失的缺憾，省时省力，成本低廉，为科研工作者提供了便利，目前尚无相关实验方法的报道。
8.通过优化电子放大镜的不足，改进包埋过程中因位移造成的聚焦不清晰，我们相信利用电子放大镜完成微小组织取材包埋将会得到更广泛的推广应用，旨在为组织形态学
染色的前期制备工作提供便利，为科研工作顺利开展保驾护航。
9.本发明的具体实施方案中，首先提供了一种微小组织样本的石蜡切片制作方法，具体包括：1）样本处理：包括福尔马林固定、脱水、透明、浸蜡；2）视野放大装置准备：在包埋机边上配置电子放大镜，将智能移动终端置于视野前端，并连接电子放大镜对应的应用软件，调节焦距直至显示清晰的视野图像；3）石蜡包埋：浸蜡样本在离心管沉底并完全冷凝后，离断带样本的离心管底部放进包埋框，置于包埋机热台上，加入液体蜡，加热金属包埋框边缘，待离心管底部石蜡融化，取出样本置于包埋框中，待石蜡完全融化样本全可见；在智能移动终端应用软件中显示的视野中调整包埋面，保持位置不变的情况下将样本移至冷却台，完成包埋；4）切片：a）调整刀片角度；b）粗修石蜡块，切除表面石蜡；c）蜡块置于-20℃冰箱预冷；d）将蜡块按之前修片的方向固定好样本；e）轻柔、匀速，切片厚度3μm；f）将蜡片在摊片机热水中展平，然后平铺于载玻片上，烤片，自动染色仪进行he染色。
10.在一个具体的实施例中，其中步骤1）中的福尔马林固定为4%福尔马林溶液常温固定24小时，移除固定液；在另外一个具体的实施例中，其中步骤1）中的脱水为吸取50%，75%，90%乙醇1ml加入带有样品的离心管，各30分钟，95%乙醇30分钟两次， 100%乙醇三次，每次1h；在另外一个具体的实施例中，其中步骤1）中的透明操作为加入二甲苯透明，重复两次，每次6-10分钟，观察样本透明情况，待样本全透明后弃去管中二甲苯；在另外一个具体的实施例中，其中步骤1）中的浸蜡操作为在带有样本离心管内加入熔点为62℃石蜡液，置62度烤箱中浸蜡1.5h，中间更换两次石蜡液，每次间隔1.5h；在另外一个具体的实施例中，其中步骤3）还包括待石蜡完全凝固后，去掉包埋底座，将含有微小组织的石蜡块休成四棱台状；在另外一个具体的实施例中，其中步骤3）中，利用电烙铁加热金属包埋框；利用加热过的尖头镊轻轻夹取微小样本，移至包埋框中心位置；在另外一个具体的实施例中，其中步骤4）中，当切至所需样本切片时，先摊平一张切片在镜下观察样本的位置，微调切面，直至切到满意的切面。
11.本发明第第二个方面提供一种微小组织镜下观察方法，所述的方法包括：1）制备微小组织的石蜡切片；2）镜下读片；其中所述的微小组织石蜡切片使用本发明第一个方面所述的方法制备；所述的镜下观察方法为非诊断的方法。
12.本发明的第三个方面是提供一种微小组织石蜡切片制备方法在制作病理诊断切片中的应用，其中所述的微小组织石蜡切片的制备方法是采用如本发明第一方面所述的方法。
13.本发明的有益效果包括1）本发明利用数码放大系统能清晰地看见微小组织样本，同时可以更好的摆正包埋位置，通过仔细操作得到理想的包埋面，为制片提供保障；2）通过模拟体视显微镜的数码放大效果，可以很好地解决微小组织在包埋过程中
遗失、位置不正等问题，从而获得最佳的切片；3）本发明的方法利用电子放大镜的放大功能，有效解决了微小样本不利于观察，容易遗漏丢失的缺憾，省时省力，成本低廉，克服了微小组织病理切片制备过程中经验因素的不确定性，为科研工作者提供了便利。
附图说明
14.图1 电子放大镜下的斑马鱼图2 利用电子放大镜包埋斑马鱼眼球图3 电子放大镜下斑马鱼立位眼球包埋图4 斑马鱼眼球连续切片图5 40x物镜下斑马鱼he染色
具体实施方式
15.以下通过参考示范性实施例，本发明的目的和功能以及用于实现这些目的和功能的方法将得以阐明。然而，本发明并不受限于以下所公开的示范性实施例；可以通过不同形式来对其加以实现。说明书的实质仅仅是帮助相关领域技术人员综合理解本发明的具体细节。
[0016] 1、材料与方法1）微小组织动物标本来源：斑马鱼为本单位斑马鱼平台提供出生3天的幼鱼，经安乐死后福尔马林固定24小时备用，离心管内幼鱼在电子放大镜下能清晰的看清楚眼球结构（图1）。
[0017]
2）试剂与设备：福尔马林固定液（40%甲醛溶液10ml，ddh2o 90ml），50%乙醇，75%乙醇，90%，95%乙醇，无水乙醇，二甲苯，石蜡（60-62℃），恒温孵育箱，组织包埋机（thermo ec350），切片机（leica2235），摊片机，尖弯头镊，电烙铁，电子放大镜（leyes wifi1000倍），手机（华为meta20），自动染色仪(thermo gemini as)、数字切片扫描仪（olympus vs200）。
[0018]
3）取材、脱水、透明、浸蜡：将斑马鱼幼鱼置培养皿中加4℃冰水中安乐死，然后转移至1.5ml离心管中，经4%福尔马林溶液常温固定24小时，1ml移液枪小心吸取上清，留组织于离心管底部，最后可将离心管缓慢倾斜倒置在面巾纸上，使残留约200μl固定液缓慢沿着管壁流出，操作时关注不要将幼鱼流出丢失。分别吸取50%，75%，90%乙醇1ml加入离心管，各30分钟，95%乙醇30分钟两次， 100%乙醇三次，每次1h。从低浓度酒精开始脱水，脱水完成后用同样的操作加入二甲苯透明，此步骤会使组织变透明，小心换液时不要将组织丢失，尽量轻柔操作让组织沉底，弃上清，重复两次，每次8分钟，观察样本透明情况，待样本全透明后弃去管中二甲苯。在离心管内加入熔点为62℃石蜡液，置62度烤箱中浸蜡1.5h，中间更换两次石蜡液，每次间隔1.5h，更换石蜡时可先将离心管底部凝固，快速吸取上部液体石蜡，并更换新的石蜡，浸蜡中途可适当上下摇动离心管使石蜡混合均匀。
[0019]
4）石蜡包埋：常规的石蜡包埋是指浸蜡后样本，用包埋模具、塑料包埋盒及融化的液体石蜡将组织包埋塑形在包埋框，冷凝后形成组织蜡块。微小组织包埋因样本极小，并需要保持特殊位置，我们在常规包埋机边上配置了电子放大镜，模拟体视显微镜的原理，将样本放大看得更清晰，包埋面更准确（图2）。方法：浸蜡样本在离心管沉底并完全冷凝，用手术
刀将离心管底部离断，离断带样本的离心管尾部放进金属包埋框，置于包埋机热台上，加入液体蜡，用电烙铁加热金属包埋框边缘，随着温度升高，离心管尾部凝固石蜡开始脱落，适时关闭电烙铁电源，将包裹着样本的凝固石蜡分离出来并取出离心管尾部，样本在包埋框中继续溶解，直至样本全部可见。提前将手机放置在视野前方，固定好电子放大镜，打开app连接电子放大镜，调节焦距使包埋区域视野在手机上呈现清晰图像。用加热过的尖头镊轻轻夹取微小样本，移至包埋框中心位置，通过手机同步观察样本，并调整包埋面，由于电子放大镜可以清晰的看到微小组织的结构，我们能更准确的将样本特定部位进行固定，保持位置不变的同时将包埋框轻轻转移至冷台，在模具底部可见一层凝固石蜡，样本已经固定于底部（图3），轻轻移开镊子，加盖塑料包埋盒，同时继续加注石蜡液，将模具放置在包埋机冷台上冷却。待石蜡完全凝固后，去掉包埋框底座，将微小组织石蜡块四周修切成四棱台形状，使后续样本切片时蜡带更容易连续。
[0020]
5）切片：微小组织石蜡切片是对技术员切片技能的一大考验，要保证切片的切面暴露完全，并且将特殊部位暴露在正确位置，切片连续完整，没有皱褶、破损，这要求我们注意以下几个方面：
①
切片前做好准备工作，刀片调好角度，先将石蜡包埋块进行粗修，先修去表面的石蜡，但不要过多暴露样本，以免修过头。
②
将蜡块放进-20℃冰箱预冷半小时后取出切片，注意不要将切面直接接触冰面，防止切面冻裂。
③
将蜡块按之前修片的方向固定好样本，先肉眼观察切片是否暴露正常，调整好位置后进行切片。
④
切片时注意转动手轮时动作要轻柔、匀速，切片厚度3um，当切至所需样本切片时，先摊平一张切片在镜下观察样本的位置，如不在理想位置，微调切面，直至切到满意的切面。
⑤
将蜡片在摊片机50℃热水中展平，然后平铺于载玻片上（图4），62℃烤片2h，自动染色仪进行he染色。
[0021]
2、结果判读微小组织在电子放大镜的放大作用下，通过手机屏幕可以呈现清晰的视野，帮助我们在包埋过程中找准包埋位置并进行准确的包埋，也不容易遗漏样本。切片过程中借助显微镜观察样本的切面位置，能够快速准确的定位微小组织的特殊切面。通过对包埋样本进行多余蜡修整，四棱形能保证蜡带连续，展片良好，无皱褶，常规he染色镜下组织结构呈现清晰完整的细胞形态（图5）以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。