土壤中有效磷的测定方法与流程

1.本发明涉及两种测定有效磷含量的方法，具体涉及一种适用于酸性土壤的有效磷快速测定方法，和一种适用于中性及石灰性土壤的有效磷快速测定方法。


背景技术：

2.土壤矿物中能够被作物直接吸收利用的部分，即有效量，以活动态存在于土壤中。元素对环境或生物体产生的效应或毒性，在很大程度上取决于其各形态含量，而不是总浓度。土壤微量元素有效量不但影响作物的生长发育，而且影响作物品质和产量。因此元素的形态分析越来越受到研究人员的重视。
3.土壤是植物磷素的主要来源，土壤磷素的生物有效性主要取决于其在土壤中的赋存形态，植物可直接吸收的土壤磷素主要以磷酸盐(h2po
4-和hpo
42-)为主。然而，酸性土壤的磷通常与金属氧化物、黏土矿物等发生吸附、沉淀反应进而被固定，导致土壤磷的植物利用率普遍较低。以南方典型的赤红壤为例，其表面丰富的正电荷对磷产生吸附作用，然后土壤表面的磷又会从物理吸附向更稳定的化学吸附转变；与此同时，磷还与土壤溶液中游离的铁、铝发生沉淀反应，从而形成难溶性磷酸盐。此外，过量施用磷肥而导致土壤磷累积的现象在全球已经非常普遍，我国的情况尤为严重。磷肥的过量施用会造成植株体内锌、锰元素的代谢紊乱，致使作物的产量和品质降低，同时加重农业面源污染。
4.通过土壤有效磷的测定，有助于了解土壤供应磷的情况，为合理使用磷肥及提高磷肥利用率提供依据。通常通常所谓的土壤有效磷只是指某一特定形态的磷，不具有真正的数量概念，所以土壤有效磷水平只是一个相对指标，但是其可以说明土壤的供磷水平。目前，土壤有效磷测定的主要方法有olsen法和bray法，其中bray法在酸性土壤效果良好，olsen法在中性及石灰性土壤效果良好，但存在一些不足。
5.现有技术存在以下问题：(1)现有测定方法需浸提后过滤得到澄清待测液，过滤操作繁琐，且有些土壤沉淀颗粒细，极易穿透滤纸，速度慢效率低下。(2)浸提液显色前需要先将ph调至指定值，再加钼锑抗显色剂才能发生特定显色反应。现有方法常使用二硝基酚(变色范围为无色2.4-4.0黄色)作指示剂，由黄色调至恰变浅黄，土壤浸提液多略带黄色的底色，导致调ph时颜色无法判断；且二硝基酚属于易制爆试剂，管控严格难以购买，且毒性强。


技术实现要素：

6.针对以上问题，本发明提供了一种土壤有效磷快速测定方法，在已有的快速测定基础上，所用试剂易购买毒性低，使用效果更易操作，颜色突变明显，操作方法更简便，效率更高，适用于土壤中有效磷的快速测定。
7.为解决以上问题，本发明通过以下技术方案实现：
8.一种酸性土壤有效磷快速测定方法，包括以下步骤：
9.(1)待测液的制备：
10.称取酸性土壤样品5.00g于浸提瓶中，加入50.0ml浸提液，在25
±
1℃、震荡速度
160r/min的条件下震荡60min后，离心20min，上清液即为有效磷的待测液；所述浸提液为浓度0.03mol/l氟化铵-0.025mol/l盐酸的溶液；
11.(2)比色前的预处理：
12.移取上清液5-10ml于50ml比色管中，加入5.00ml硼酸溶液，加水或不加水，加溴酚蓝指示剂，用2mol/l氨水调至恰呈蓝色后，用2mol/l盐酸溶液调至恰呈黄色；
13.(3)比色测定：
14.加入钼锑抗显色剂，定容摇匀，20℃以上条件放置30min，将分光光度计的波长调至700或880nm，比色测定；通过标准曲线(提前采用不同标准浓度的磷浓度制备出对应的标准曲线)得出待测样品中有效磷的含量。
15.一种中性及石灰性土壤有效磷快速测定方法，包括以下步骤：
16.(1)待测液的制备：
17.称取中性或/和石灰性土壤样品2.50g于浸提瓶中，加入50.0ml浸提液，在25
±
1℃、震荡速度160r/min的条件下震荡30min后，离心20min，上清液即为有效磷的待测液；所述浸提液为浓度0.5mol/l碳酸氢钠溶液(ph 8.5)；
18.(2)比色前的预处理：
19.移取上清液2-10ml于50ml比色管中，加水或不加水，加溴酚蓝指示剂，变蓝色，逐滴加入0.5mol/l硫酸调至恰呈黄色；
20.(3)比色测定：
21.加入钼锑抗显色剂，定容摇匀，20℃以上条件放置30min，将分光光度计的波长调至700或880nm，比色测定，通过标准曲线(提前采用不同标准浓度的磷浓度制备出对应的标准曲线)得出待测样品中有效磷的含量。
22.本发明采用离心分离浸提液及土壤，操作简便效率高；溴酚蓝作为调待测液ph的指示剂，变色范围黄色3.0-4.6蓝色，调至恰呈黄色时，待测液ph在适宜范围溶液中的磷酸根可与钼锑抗显色剂形成蓝色络合物。本发明用溴酚蓝作ph指示剂，颜色突变明显，不受待测液底色影响，突变易判断。调至适宜ph值时颜色为黄色，磷酸根与钼锑抗显色剂形成蓝色络合物，两种颜色波长差异非常大，不干扰后续显色的测定。
23.本发明的土壤中有效磷的测定方法，与国标基本相似，可以快速对土壤中有效磷进行分析，尤其颜色突变明显，方法简单，测试数据准确，由于土壤样品的复杂性，偏提取得到的待测溶液可能含有未知物质，由于偏提取过程中化学反应的复杂性，土壤中的未知物有可能会干扰本发明所用指示剂的使用效果，但现有方法所用指示剂也均存在这种未知性，本发明应用中尚未见不适用情况。
具体实施方式
24.下面结合实施例对本发明作进一步描述，但本发明并不限于以下实施例。
25.实施例1
26.1、主要仪器
27.分光光度计，摇床，离心机；
28.2、试剂
29.(1)盐酸hcl，ρ＝1.19g/ml；
30.(2)硫酸h2so4，ρ＝1.84g/ml；
31.(3)氟化铵-盐酸浸提剂称取1.11g氟化铵于400ml水中，加2.1ml盐酸，用水定容至1l，贮存于塑料瓶中，此溶液含0.03mol/l氟化铵和0.025mol/l盐酸；
32.(4)0.06mol/l硼酸称取3.7g硼酸用水定容至1l；
33.(5)2mol/l氨水吸取15ml浓氨水(nh3·
h2o 26％)用水定容至1l；
34.(5)2mol/l盐酸溶液吸取16.4ml盐酸用水定容至100ml；
35.(6)无水乙醇；
36.(7)溴酚蓝指示剂称取0.2g溴酚蓝溶于100ml乙醇中；
37.(8)酒石酸锑钾溶液5g/l称取酒石酸锑钾0.5g溶于100ml水中；
38.(9)钼锑贮存液量取153ml硫酸缓缓倒入约400ml水中，搅拌，冷却，另称取10g钼酸铵，溶于约60℃的300ml水中，冷却，然后将硫酸溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中，再加入100ml 5g/l酒石酸锑钾溶液，最后用水稀释至1l，摇匀，贮存于棕色试剂瓶中，于4℃可保存2个月；
39.(10)钼锑抗显色剂称取1.5g抗坏血酸溶于100ml钼锑贮存液中，现用现配；
40.3、操作步骤
41.(1)待测液的制备：
42.称取酸性土壤样品5g于浸提瓶中，加入50ml氟化铵-盐酸浸提液，在25
±
1℃、震荡速度160r/min的条件下震荡60min后，离心20min，上清液即为有效磷的待测液；
43.(2)比色前的预处理：
44.移取上清液5-10ml于50ml比色管中，加入5ml硼酸溶液，加水，加溴酚蓝指示剂，用2mol/l氨水调至恰呈蓝色后，用2mol/l盐酸溶液调至恰呈黄色；
45.(3)比色测定：
46.加入5ml钼锑抗显色剂，定容摇匀，20℃以上条件放置30min，将分光光度计的波长调至700或880nm，比色测定，读出待测样品中有效磷的含量。
47.(4)标准曲线：
48.分别吸取5mg/l磷标准溶液0.00ml 1.00ml 2.00ml 3.00ml 4.00ml 5.00ml 6.00ml于50ml比色管中，再分别加入与待测溶液等量的氟化铵-盐酸浸提液和5ml硼酸溶液，加水，加溴酚蓝指示剂，用2mol/l氨水调至恰呈蓝色后，用2mol/l盐酸溶液调至恰呈黄色，加入5ml钼锑抗显色剂，定容摇匀，20℃以上条件放置30min，将分光光度计的波长调至700或880nm，比色测定，以0.00mg/l标准溶液为参比溶液调节仪器零点，由低到高测定标准系列待测液的吸收值。
49.(5)结果计算
50.从标准曲线上查得待测液的磷含量后，可按下式计算
51.w
p
＝(c-c0)
×
t/m
52.w
p
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
土壤有效磷量，单位为微克每克(ug/g)
53.c
‑‑‑‑‑‑‑‑
从标准曲线上获得的待测液的磷含量，单位为微克
54.c0‑‑‑‑‑‑‑‑
从标准曲线上获得的空白溶液的磷含量，单位为微克
55.t
‑‑‑‑‑‑‑‑
分取倍数
56.m
‑‑‑‑‑‑
土样质量，单位为克
57.本发明采用离心分离浸提液及土壤，操作简便效率高；溴酚蓝作为调待测液ph的
指示剂，变色范围黄色3.0-4.6蓝色，调至恰呈黄色时，待测液ph在适宜范围溶液中的磷酸根可与钼锑抗显色剂形成蓝色络合物。本发明用溴酚蓝作ph指示剂，颜色突变明显，不受待测液底色影响，突变易判断。调至适宜ph值时颜色为黄色，磷酸根与钼锑抗显色剂形成蓝色络合物，两种颜色波长差异非常大，不干扰后续显色的测定。
58.本发明的土壤中有效磷的测定方法，可以快速对土壤中有效磷进行分析，方法简单，测试数据准确。
59.实施例
60.(1)分别称取表1所示土壤样品5.00g于浸提瓶中，加入50.0ml氟化铵-盐酸浸提液，在25
±
1℃、震荡速度160r/min的条件下震荡60min后，离心20min，上清液即为有效磷的待测液；
61.(2)比色前的预处理：
62.移取上清液5-10ml于50ml比色管中，加入5.00ml硼酸溶液，加水，加溴酚蓝指示剂，用2mol/l氨水调至恰呈蓝色后，用2mol/l盐酸溶液调至恰呈黄色；对照组加二硝基酚指示剂，用2mol/l氨水调至黄色后，用2mol/l盐酸溶液调至微黄色；
63.(3)比色测定：
64.加入5.00ml钼锑抗显色剂，定容摇匀，20℃以上条件放置30min，将分光光度计的波长调至700或880nm，比色测定，读出待测样品中有效磷的含量。
65.(4)标准曲线：
66.分别吸取5mg/l磷标准溶液0.00ml 1.00ml 2.00ml 3.00ml 4.00ml 5.00ml 6.00ml于50ml比色管中，再分别加入与待测溶液等量的氟化铵-盐酸浸提液和5.00ml硼酸溶液，加水，调ph，加入5.00ml钼锑抗显色剂，定容摇匀，20℃以上条件放置30min，将分光光度计的波长调至700或880nm，比色测定，以0.00mg/l标准溶液为参比溶液调节仪器零点，由低到高测定标准系列待测液的吸收值。
67.表1土壤有效磷对比实验结果
[0068][0069]
表2标准点吸光度比较
[0070] 二硝基酚溴酚蓝浓度(ug)吸光度吸光度000.00750.0570.062100.1140.117
[0071]
实施例2
[0072]
1、主要仪器
[0073]
分光光度计，摇床，离心机，ph计
[0074]
2、试剂
[0075]
(1)2mol/l氢氧化钠
[0076]
(2)硫酸h2so4，ρ＝1.84g/ml
[0077]
(3)碳酸氢钠浸提液称取42.0g碳酸氢钠，加水至近1l，用ph计测溶液ph，如ph不在8.5，则用2mol/l氢氧化钠溶液调ph到8.5，然后定容至1l，每周检查一次溶液的ph。
[0078]
(4)无水乙醇
[0079]
(5)溴酚蓝指示剂称取0.20g溴酚蓝溶于100ml乙醇中
[0080]
(6)酒石酸锑钾溶液ρ＝5g/l称取酒石酸锑钾0.50g溶于100ml水中
[0081]
(7)钼锑贮存液量取153ml硫酸缓缓倒入约400ml水中，搅拌，冷却，另称取10g钼酸铵，溶于约60℃的300ml水中，冷却，然后将硫酸溶液缓缓倒入钼酸铵溶液中，再加入100ml 5g/l酒石酸锑钾溶液，最后用水稀释至1l，摇匀，贮存于棕色试剂瓶中，于4℃可保存2个月
[0082]
(8)钼锑抗显色剂称取1.50g抗坏血酸溶于100ml钼锑贮存液中，现用现配
[0083]
3、操作步骤
[0084]
(1)待测液的制备：
[0085]
称取中性或/和石灰性土壤样品2.50g于浸提瓶中，加入50ml碳酸氢钠浸提液，在25
±
1℃、震荡速度160r/min的条件下震荡30min后，离心20min，上清液即为有效磷的待测液；
[0086]
(2)比色前的预处理：
[0087]
移取上清液2-10ml于50ml比色管中，加溴酚蓝指示剂，逐滴加入0.5mol/l硫酸调至恰呈黄色；
[0088]
(3)比色测定：
[0089]
加入5ml钼锑抗显色剂，定容摇匀，20℃以上条件放置30min，将分光光度计的波长调至700或880nm，比色测定，读出待测样品中有效磷的含量。
[0090]
(4)标准曲线：
[0091]
分别吸取5mg/l磷标准溶液0.00ml 1.00ml 2.00ml 3.00ml 4.00ml 5.00ml 6.00ml于50ml比色管中，再分别加入与待测溶液等量的碳酸氢钠浸提液，加溴酚蓝指示剂，逐滴加入0.5mol/l硫酸调至恰呈黄色，加入5ml钼锑抗显色剂，定容摇匀，20℃以上条件放置30min，将分光光度计的波长调至700或880nm，比色测定，以0.00mg/l标准溶液为参比溶液调节仪器零点，由低到高测定标准系列待测液的吸收值。
[0092]
(5)结果计算
[0093]
从标准曲线上查得待测液的磷含量后，可按下式计算
[0094]wp
＝(c-c0)
×
t/m
[0095]wp
‑‑‑‑‑‑‑‑‑
土壤有效磷量，单位为微克每克(ug/g)
[0096]c‑‑‑‑‑‑‑‑
从标准曲线上获得的待测液的磷含量，单位为微克
[0097]
c0‑‑‑‑‑‑‑‑
从标准曲线上获得的空白溶液的磷含量，单位为微克
[0098]
t
‑‑‑‑‑‑‑‑
分取倍数
[0099]m‑‑‑‑‑‑
土样质量，单位为克
[0100]
本发明采用离心分离浸提液及土壤，操作简便效率高；溴酚蓝作为调待测液ph的
指示剂，变色范围黄色3.0-4.6蓝色，调至恰呈黄色时，待测液ph在适宜范围溶液中的磷酸根可与钼锑抗显色剂形成蓝色络合物。本发明用溴酚蓝作ph指示剂，颜色突变明显，不受待测液底色影响，突变易判断。调至适宜ph值时颜色为黄色，磷酸根与钼锑抗显色剂形成蓝色络合物，两种颜色波长差异非常大，不干扰后续显色的测定。
[0101]
本发明的土壤中有效磷的测定方法，可以快速对土壤中有效磷进行分析，方法简单，测试数据准确。
[0102]
实施例
[0103]
(1)分别称取表3所示土壤样品2.50g于浸提瓶中，加入50.0ml碳酸氢钠浸提液，在25
±
1℃、震荡速度160r/min的条件下震荡30min后，离心20min，上清液即为有效磷的待测液；
[0104]
(2)比色前的预处理：
[0105]
移取上清液2-10ml于50ml比色管中，加溴酚蓝指示剂，逐滴加入0.5mol/l硫酸调至恰呈黄色；对照组加二硝基酚指示剂，逐滴加入0.5mol/l硫酸调至微黄色；
[0106]
(3)比色测定：
[0107]
加入5.00ml钼锑抗显色剂，定容摇匀，20℃以上条件放置30min，将分光光度计的波长调至700或880nm，比色测定，读出待测样品中有效磷的含量。
[0108]
(4)标准曲线：
[0109]
分别吸取再分别加入与待测溶液等量的碳酸氢钠浸提液，加溴酚蓝指示剂，逐滴加入0.5mol/l硫酸调至恰呈黄色，加入5.00ml钼锑抗显色剂，定容摇匀，20℃以上条件放置30min，将分光光度计的波长调至700或880nm，比色测定，以0.00mg/l标准溶液为参比溶液调节仪器零点，由低到高测定标准系列待测液的吸收值。
[0110]
表3土壤有效磷对比实验结果
[0111][0112]
表4标准点吸光度比较
[0113]
nahco3二硝基酚溴酚蓝浓度(ug)吸光度吸光度0-0.0200.00050.0350.034100.0890.089。