一种检测鹅庚型肝炎病毒抗体的间接ELISA检测试剂盒及应用

一种检测鹅庚型肝炎病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术研究领域，具体涉及一种检测鹅庚型肝炎病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用。


背景技术：

2.庚型肝炎病毒（pegiviruses，pgv）为单股正链rna病毒，基因组长度为9-13kb，包含一个大的开放阅读框，翻译后蛋白可以被蛋白酶切割为结构蛋白（e1、e2、x）和非结构蛋白（ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b）。庚型肝炎病毒以前被称为gb病毒，是于1995年在狨猴血清中发现。在近几年，在各种哺乳动物均发现庚型肝炎病毒的感染，包括人类、啮齿动物、马、猪等。而根据所发现的病毒基因组特征，可将庚型肝炎病毒分为11个基因型（a~k）。所有的庚型肝炎病毒均可在动物体内引起持续感染，而目前缺乏任何的证据表明庚型肝炎病毒可以致使宿主发病。由于缺乏合适的培养系统，泰勒氏病相关的庚型肝炎病毒可引起马急性肝炎之间的关系仍是推断的结果，然而有人认为人庚型肝炎病毒1型可改善hiv引起的免疫缺陷的影响。因此，庚型肝炎病毒的发病机制、传播途径和流行病学情况仍不是很清楚。
3.2020年，西南地区首次发现非哺乳动物庚型肝炎病毒——鹅庚型肝炎病毒（goose pegivirus，gpgv），该病毒表现出高度的淋巴嗜性，可引起鹅只体重减轻。为了更好地了解鹅庚型肝炎病毒感染的流行情况以及该病毒与其他病毒在中国西南地区的共同感染情况，收集了来自四川省的25只健康欠佳的鹅和来自重庆市的24只健康欠佳的鹅。用rt-pcr或巢式rt-pcr检测了9种鹅病毒（鹅出血性多瘤病毒、鹅庚型肝炎病毒、星形病毒、细小病毒、圆环病毒、呼肠孤病毒、冠状病毒、副粘病毒和禽流感病毒），研究结果显示：49只鹅中有22只（44.9%）对鹅庚型肝炎病毒呈阳性，并且与鹅细小病毒、鹅圆环病毒有很高的混合感染率。这充分说明，鹅群中鹅庚型肝炎病毒感染率很高，需要建立一种快速、简单的检测方法用于监测鹅庚型肝炎病毒的感染。目前，鹅庚型肝炎病毒主要是通过rt-pcr进行检测，该检测方法需要采集病料进行rna提取、反转录及pcr扩增，对检测人员的技术水平要求较高且操作繁琐，不适合在基层广泛使用。由于该病毒是一种新发现的鹅庚型肝炎病毒，其它血清学诊断方法目前未见任何报道，因此建立特异性强、敏感性高、操作简单、成本低廉的鹅庚型肝炎病毒抗体检测方法有重要意义。


技术实现要素：

4.为了克服上述缺陷，本发明提供一种特异性强、敏感性高、操作简单、成本低廉的鹅庚型肝炎病毒抗体的间接elisa检测试剂盒及应用，可以对新发现的鹅庚型肝炎病毒抗体进行快速、有效的检测，以监测鹅群中鹅庚型肝炎病毒的流行情况。
5.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明的第一方面，提供一种检测鹅庚型肝炎病毒抗体的间接elisa检测试剂盒，所述间接elisa检测试剂盒包含包被有鹅庚型肝炎病毒e2蛋白重组抗原的酶标板。
6.本发明还提供了所述鹅庚型肝炎病毒e2蛋白重组抗原的制备方法，具体如下：（1）鹅庚型肝炎病毒e2基因的合成：以鹅庚型肝炎病毒fv2毒株（genebank登录号mw365447）的e2基因为模板进行密码子优化，使之可以在大肠杆菌中大量表达，并在e2基因两端引入hind iii和xhoi限制性酶切位点，合成e2基因于puc57中获得puc57-e2重组质粒；（2）重组菌的构建：将pet28a(+)质粒和步骤（1）获得的puc57-e2重组质粒分别使用hind iii和xhoi限制性内切酶酶切，回收酶切后的pet28a(+)质粒片段和e2基因片段，用t4 dna连接酶连接回收的片段，并将连接产物转化bl21(de3)大肠杆菌感受态细胞，菌液pcr、酶切和测序鉴定获得表达鹅庚型肝炎病毒e2蛋白的重组菌；（3）鹅庚型肝炎病毒e2蛋白的表达及纯化：将步骤（2）获得的鹅庚型肝炎病毒e2蛋白的重组菌接种于lb培养基，加入iptg进行诱导表达，将表达产物经过变性和复性后，获得纯化的庚型肝炎病毒e2蛋白重组抗原，同时使用western blot对庚型肝炎病毒e2重组蛋白抗原性进行检测。
7.其中，步骤（1）所述的e2基因序列如seq id no.1所示；步骤（1）所述的e2基因序列优化后序列如seq id no.2所示。
8.作为优选，所述鹅庚型肝炎病毒e2蛋白重组抗原的包被量为250ng/孔。
9.进一步的，所述间接elisa检测试剂盒还包含：酶标抗体、样品稀释液、10倍洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、tmb底物溶液和终止液。
10.优选的，所述酶标抗体为hrp兔抗鹅抗体。
11.上述间接elisa检测试剂盒在鹅庚型肝炎病毒的流行病学调查中的应用也是本发明的保护范围。
12.本发明的第二方面，提供一种鹅庚型肝炎病毒e2抗体的间接elisa检测方法，包括以下步骤：（1）包被：以本发明所述方法获得的庚型肝炎病毒e2蛋白重组抗原作为包被抗原，将包被抗原稀释后加入到酶标板孔中，4℃过夜孵育，使用含0.05%吐温20的pbst洗涤；（2）封闭：使用10%的脱脂奶粉进行封闭，37℃条件下孵育2h后甩干，用pbst洗涤；（3）待检血清作用条件：每孔加入待检血清稀释混合液，37℃条件下孵育1h后甩干，用pbst洗涤；（4）酶标二抗作用条件：将hrp兔抗鹅抗体用pbst按1:2000稀释，每孔加100μl，37℃条件下作用1h后甩干，用pbst洗涤；（5）底物显色：加入tmb底物显色液100μl/孔，37℃条件下避光作用15min；（6）终止反应：加入50μl/孔终止液终止显色反应；采用酶标仪吸光度450nm下读取数据od；（7）阴性阳性的判定：od450nm≥0.291为阳性，od450nm《0.291判定为阴性。根据本发明生物统计学原理计算平均数(x ̅
)和标准差(sd)，利用临界值的计算公式为x ̅
+3sd得到临界值为0.291，故采用上述判定方法。
13.本发明的有益效果：相对于现有技术，本发明的一种检测鹅庚型肝炎病毒抗体的间接elisa试剂盒具有灵敏度高、检测通量大、操作简便的特点，可用于鹅庚型肝炎病毒抗体检测，弥补了目前在引起鹅只体重减轻的鹅庚型肝炎病毒抗体检测方法上的空白。本发明利用分子生物学技
术，克隆、表达优化的核酸序列，通过his标签纯化获得重组的e2蛋白，以该重组蛋白为包被抗原，建立检测鹅庚型肝炎病毒抗体的间接elisa试剂盒。该试剂盒可用于鹅庚型肝炎病毒血清学诊断以及抗体的水平的监测、流行病学调查等，为鹅庚型肝炎病毒的防制提供一种简便、快捷的方法。
附图说明
14.图1：重组蛋白e2在bl21感受态中诱导表达后蛋白纯化sds-page分析图；图2：纯化的重组蛋白e2免疫印迹图。
具体实施方式
15.为了阐述本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图说明及具体实施方式对本发明做进一步的介绍，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
16.在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
17.本发明首次用血清学的方法对鹅庚型肝炎病毒进行抗体检测。能够对新现的以鹅体重减轻为主要特征的鹅庚型肝炎病毒抗体进行快速有效地检测，是一种简便的适于基层使用的间接elisa检测方法。
18.在本发明的一个实施方案中，所给出的鹅庚型肝炎病毒间接elisa检测方法，包括以下步骤：（1）鹅庚型肝炎病毒e2蛋白重组抗原的制备
①
鹅庚型肝炎病毒e2基因的合成：以鹅庚型肝炎病毒fv2毒株（genebank登录号mw365447）e2基因为模板进行密码子优化，使之可以在大肠杆菌中大量表达，并在e2基因两端引入hind iii和xhoi限制性酶切位点，合成e2基因于puc57中获得puc57-e2重组质粒；
②
重组菌的构建：将pet28a(+)质粒和puc57-e2重组质粒分别使用hind iii和xhoi限制性内切酶酶切，回收酶切后的pet28a(+)质粒片段和e2基因片段，用t4 dna连接酶连接回收的片段，并将连接产物转化bl21(de3)大肠杆菌感受态细胞，菌液pcr、酶切和测序鉴定获得表达鹅庚型肝炎病毒e2蛋白的重组菌；
③
鹅庚型肝炎病毒e2蛋白的表达及纯化：将鹅庚型肝炎病毒e2蛋白的重组菌接种于lb培养基，加入iptg进行诱导表达，将表达产物经过变性和复性后，获得纯化的庚型肝炎病毒e2蛋白重组抗原，将纯化的鹅庚型肝炎病毒e2蛋白重组抗原作为包被抗原。
19.（2）以纯化后的鹅庚型肝炎病毒e2蛋白重组抗原做包被抗原建立间接elisa：
①
包被：用1
×
碳酸盐缓冲液(p h＝9.6)稀释庚型肝炎病毒e2重组蛋白至终浓度2.5μg/ml，向96孔酶标板加入100μl稀释后的e2重组蛋白溶液，4℃孵育过夜或37℃孵育2h，使用含0.05%吐温20的pbst洗涤三遍，每遍4min；
②
封闭：封闭采用pbst稀释10％脱脂奶粉(质量浓度)200μl/孔，37℃条件下孵育2小时后甩干，用pbst洗涤3遍，每遍4min；
③
待检血清作用条件：每孔加入待检血清稀释混合液，37℃条件下孵育1h后甩干，用pbst洗涤3遍，每遍4min；
④
酶标二抗作用条件：将hrp兔抗鹅抗体用pbst按1:2000稀释后，每孔加100μl，37℃条件下作用1h后甩干，用pbst洗涤4遍，每次4min；
⑤
底物显色：加入tmb底物显色液100μl/孔，37℃条件下避光作用15min；
⑥
终止反应：加入50μl/孔 2m h2so4终止液终止显色反应；采用酶标仪吸光度450nm下读取数据od。
20.（3）结果判定标准：根据生物统计学原理计算平均数(x ̅
)和标准差(sd)，利用临界值的计算公式为x ̅
+3sd得到临界值为0.291，即od450nm≥0.291为阳性，od450nm《0.291判定为阴性。
21.对于该鹅庚型肝炎病毒间接elisa检测而言，包被抗原的选择非常关键，直接决定检测方法的特异性。为优选包被抗原，本发明在试验过程中根据genbank上发表的鹅庚型肝炎病毒e2基因进行密码子优化、合成后克隆至pet28a(+)载体，获得的重组表达载体pet28a-e2转化至bl21(de3)感受态细胞中，加入iptg进行诱导表达；将表达产物经过变性和复性后，获得纯化重组蛋白，将获得的重组蛋白分别作为包被抗原，构建间接elisa检测试剂盒。应用临床上已确诊的血清样本对不同包被抗原制备的间接elisa检测试剂盒的特异性进行考察。结果显示，以本发明纯化的鹅庚型肝炎病毒e2蛋白作为包被抗原制备的间接elisa检测试剂盒对已确诊血清样本检测的准确率达100％，其检测的敏感性和特异性均显著优于以其他重组蛋白作为包被抗原制备的间接elisa检测试剂盒。
22.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本技术的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本技术的技术方案。
23.本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明中所用到的部分试剂及组分如下：包被缓冲液：1
×
碳酸盐缓冲液(100ml，ph＝9.6)：na2co3 0.2756g，nahco3 0.6216g，用蒸馏水溶解并定容至100ml，ph值9.5-9.7，4℃保存。
24.pbs溶液：nacl 4.25g，nah2po4
·
2h2o 0.178g，na2hpo4
·
12h2o 1.386g，用蒸馏水溶解并定容至2000ml，ph值7.2-7.4。
25.pbst溶液：加入tween-20 0.5ml至1l pbs，充分混匀。
26.pbst封闭液：将10g 脱脂奶粉溶解于100ml pbst稀释液中，短期保存于4℃，长期保存于-20℃。
27.tmb显色液：buffer a：称取66.506g柠檬酸钠用800ml蒸馏水溶解并用浓hcl调ph至4.0，加入314μl h2o定容至1l，4℃保存；buffer b：称取0.296g四甲基联苯胺(tmb)，0.0633g四丁基硼氢化铵(tbabh)溶于30ml二甲基乙酰胺(dma)，4℃避光保存；使用时，将buffer a和buffer b以体积39:1的比例混合，现用现配。
28.2m h2so4终止液：在178.3ml蒸馏水中，逐滴加入浓硫酸(98%) 21.7 ml，边加边摇，冷却至室温即为2m h2so4终止液。
29.本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如m.r.格林等主编，科学出版社，2017，分子克隆实验指南(第四版)；d.l.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。
30.实施例1：鹅庚型肝炎病毒e2重组蛋白的制备1.1鹅庚型肝炎病毒e2基因的人工合成：根据鹅庚型肝炎病毒fv2毒株（genebank登录号mw365447）e2基因为模板进行密码子优化，使之可以在大肠杆菌中大量表达，并在e2基因两端引入hind iii和xhoi限制性酶切位点，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成该基因，序列如下：5
′‑
actcagtaccataccgtaaacgcgcagaactctctgggtcgtctggtgatgaactccgtatggcgttcccgtgctaccatgaaggactacgaaccgtgccattactataacggtacctgggtggaagaaagcccgtgggatcagttctctcgtccgaacacgaacaagtcttggttctgtggcagcggttggtttttccgtaaaccgactaactggaccatcattgctaatggtaaagcactgggtccgcgttgtggccgtaatctgaccgttgaagccccggctggtgaagatccgtggatcgtctgcgtatatggttccgtatggacctacgctcgtcgtggtaaccattctggtccgatcggtaccaaacagtccagcacgtgctacgttcgtacgtctaaagcccattccatcgtccacacctgtgtcgtcgataaacgtgaacgttggtgtggcaactgtactcgtgattgttggccagaaaccggtagcccgctgttcgattttaaacgttgtggcgttggcactcgcctgactaaatatctggacgctgacccgcgttgcacctggaacaaaactatcggcggttggaacaccaaactggctgaacagaaatgtcgtggctacgttctggcagaggtcgatggtcgtgttcatgctctgcgttgcccgctgggtcacgattataccctgccggtatatatcccgggtaaaccggtcggtcgcacccgttctccaaacaccggttggtggccgtggggtatcaccctgtggggtgtaccgaatctgcactacctgcgcgaggaatattataatgtttgcctgggtttcgctttccgttgggaagatgagatggatggtctgatccactacaacaaagttcacaacgctggtcatcaggctgttcgtggtggcgttccgccgaaaggttacttcatgatggacttcttcatcggtgtcctgatcgttactaaactgaccggtgcgcgctggattccgttcattgtactgatggtttgggtgcagctgactcctatcgcttttgcccgtcgtctggaagttctgccgaacggcagccaggttctgacttactctgtt-3
′
（seq id no.2）合成e2基因于puc57中获得puc57-e2重组质粒；1.2重组菌的构建：将pet28a(+)质粒和puc57-e2重组质粒分别使用hind iii和xhoi限制性内切酶酶切，回收酶切后的pet28a(+)质粒片段和e2基因片段，用t4 dna连接酶连接回收的片段，并将连接产物转化bl21(de3)大肠杆菌感受态细胞。
31.挑取单个阳性克隆菌落pcr鉴定结果表明能扩增到1101 bp左右的目的条带，与预计的e2基因片段大小一致。挑取单个阳性克隆菌落进行增菌培养后提取质粒，用限制性内切酶hind iii和xhoi进行酶切鉴定，酶切条带正确。阳性克隆测序结果显示e2基因插入位置、插入方向和阅读框正确，结果表明重组载体pet28a-e2构建成功。
32.1.3鹅庚型肝炎病毒e2蛋白的诱导表达与鉴定：按1∶100体积比，将携带质粒pet28a-e2的重组菌接种含50 μg/ml卡那霉素的lb培养基，37℃培养至od600约为0.6~0.8，加入iptg至终浓度为1 mmol/l，37℃诱导6 h；8000 rpm离心5 min，收集菌体用pbs溶液洗涤2次，离心；用pbs重悬菌体，加入溶菌酶，-80
°
c反复冻融3次。1:1000加入100mmol/l pmsf，在冰浴中超声破碎菌体。裂解后的菌液分别收集超声上清和沉淀进行sds-page，分析发现重组蛋白为包涵体蛋白。
33.用包涵体洗涤液(50 mmol/l tris-hcl(p h8.0)，1 mmo1/l edta，1%triton x-100，2 mo1/l尿素)将超声沉淀洗涤3次，以包涵体蛋白变性液（50 mmol/l tris-hcl(p h8.0)，2 mmol/l 2-me，8 mol/l尿素）溶解沉淀。使用镍离子亲和层析柱进行目的蛋白的吸附，以洗脱缓冲液(含60 mmol/l咪唑的包涵体变性液)洗脱目的蛋白。收集纯化过程中的蛋
白液进行sds-page分析，sds-page分析显示，重组蛋白e2在bl21感受态细胞中成功表达，全部以包涵体的形式存在，蛋白分子量大小与预期的重组e2大小一致(参见附图1，其中，m泳道为蛋白质标准；第1泳道为纯化的e2重组蛋白)。
34.将纯化重组蛋白的浓度调整为400g/ml，转入透析袋，浸泡在装有250 ml预冷包涵体变性液的烧杯中。使用医用点滴架以0.4 ml/min的流速缓慢滴入等体积的包涵体复性缓冲液（50 mmol/l tris-hci(ph8.0)，0.1 mmol/l氧化型谷胱甘肽，1 mmol/l还原型谷胱甘肽），在冰浴条件下以磁力搅拌器进行充分搅拌，将透析带中蛋白液中尿素的浓度从8 mol/l缓慢降低至4mol/l(整个过程约12 h)。以同样的方式，通过连续3次透析，将蛋白液中尿素的浓度降低至0.5 mol/l，测定透析后蛋白的浓度，滤过除菌后，-80
°
c冻存备用。
35.分别使用兔抗鹅庚型肝炎病毒的阳性血清作为一抗，对复性后的鹅庚型肝炎病毒e2重组蛋白进行western-blot检测，结果显示，在50 ku处均出现明显的蛋白条带，表明复性后的e2重组蛋白与鹅庚型肝炎病毒的阳性血清具有良好的反应原性（参见附图2，其中，m为蛋白质标准；1为鹅庚型肝炎病毒抗体阳性血清，2为鹅庚型肝炎病毒抗体阴性血清）。
36.实施例2：间接elisa检测鹅庚型肝炎病毒抗体取实施例1纯化重组蛋白e2做包被抗原建立间接elisa方法，采用方阵法摸索elisa最佳蛋白包被浓度和血清稀释浓度，以及elisa最佳反应条件。最终确定条件如下：2.1包被：抗原用1
×
碳酸盐缓冲液(ph＝9.6)稀释后，取100μl包被到96孔elisa板中，保鲜膜包好，4℃过夜孵育或者37℃孵育2h，采用含0.05％吐温的pbst洗涤三次，每遍4min。检测孔e2蛋白包被量250ng/孔；2.2封闭：封闭采用pbst稀释10％脱脂奶粉200μl/孔37℃条件下孵育2h后甩干，用pbst洗涤3遍，每遍4min；2.3血清作用条件：每孔加入2 μl待检血清和98 μl抗原稀释液稀释的混合液，37℃条件下孵育1h后甩干，用pbst洗涤3遍，每遍4min；2.4酶标兔抗鹅抗体作用条件：酶标兔抗鹅抗体用pbst按1:2000稀释，每孔加100 μl，37℃条件下作用1h后甩干，用pbst洗涤4遍，每次4min；2.5底物显色：tmb底物显色液100μl/孔，37℃条件下避光作用15min；2.6终止反应：每孔加50μl 2m h2so4终止液终止显色反应；采用酶标仪吸光度450nm下读取数据od；3结果判定标准:根据生物统计学原理计算平均数(x ̅
)和标准差(sd)，利用临界值的计算公式为x ̅
+3sd得到临界值为0.291，即od450nm≥0.291为阳性，od450nm《0.291判定为阴性。
37.4交叉反应性：用本发明建立的方法对鹅细小病毒（gpv）、鹅星状病毒（goastv）、禽流感病毒（aiv）、新城疫病毒（ndv）、坦布苏病毒（tmuv）、鹅呼肠孤病毒（grv）、大肠杆菌（e. coli）阳性血清，阳性血清进行检测，同时设立鹅庚型肝炎病毒阳性血清和阴性血清为对照，该方法只与鹅庚型肝炎病毒阳性血清反应呈阳性，说明该方法具有很好的特异性。
38.以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其
等效物界定。