一种利用发光细菌对土壤中有效态重金属毒性进行检测的方法与流程

1.本发明属于土壤重金属毒性检测技术领域，具体涉及一种利用发光细菌对土壤中有效态重金属毒性进行检测的方法。


背景技术：

2.由于工业、采矿业的迅猛发展，化肥滥用以及污水排放，农业土壤中的重金属污染已成为一种普遍现象，重金属以各种方式进入食物链并在生物体内积累，对生物体造成伤害。以往的土壤重金属研究主要关注土壤重金属总量，但是重金属总量分析只代表了土壤中重金属积累，不能反映重金属在土壤中的生物有效性和流动性，因为土壤中只有有效态重金属可被植物累积产生危害。因此，为了评估毒性效应和研究生物地球化学途径，测定有效态重金属含量而不是重金属总量至关重要。
3.在评价土壤中有效态重金属毒性时，大多数时候是测定重金属含量，进而根据其含量来判定其对生物体产生的危害，例如使用电感耦合等离子体质谱仪、电感耦合等离子体发射光谱仪、原子吸收光谱仪等大型仪器进行分析，虽然检测精准度较高，检测线较低，但是测量成本较高，时间较长，对于一些经济不发达地区或者基层工作站来说并不适用，因而需要一种快速、简单的评价有效态重金属毒性的方法。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种操作更加简便，对土壤重金属毒性评价更加全面、准确且简单的方法。
5.为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
6.一种利用发光细菌对土壤中有效态重金属毒性进行检测的方法，包括如下步骤：
7.(1)在待测土壤区域内，采集耕作层混合土样，置于阴凉处风干，去除土壤中石块、树枝杂物后，过筛均质，避光保存；
8.(2)称取步骤(1)所得样品，加入提取液，再将其置于水平震荡箱中充分反应，待反应结束之后过滤，收集滤液；
9.(3)将步骤(2)滤液ph值调节为中性，然后加入发光稳定的发光细菌菌液，待其稳定后，测定发光强度，以空白发光细菌菌液为对照，计算发光抑制率：
[0010][0011]
还包括步骤(4)：通过发光菌发光强度抑制率综合评价土壤重金属污染水平。
[0012]
优选地，步骤(1)中，采用对角线法采集10-20cm耕作层混合土样，将其装入样品袋，贴上样品标签，置于阴凉处风干，阴干后过10目筛网。
[0013]
优选地，步骤(2)中，称取1-3g土样，加入提取液为dtpa溶液，体积为5-15ml。
[0014]
优选地，步骤(2)中，水平震荡箱的震荡速率为100-300rpm，温度为20-30℃，反应
0.5-5h。
[0015]
优选地，步骤(2)中，反应结束之后过0.22μm孔径的滤膜，收集滤液。
[0016]
优选地，步骤(3)中，采用1m naoh水溶液调节ph值为6-8。
[0017]
优选地，步骤(3)中，滤液在调节ph值前，加入nacl使得滤液中nacl质量浓度为3％。
[0018]
优选地，步骤(3)中，发光细菌菌液为明亮发光杆菌t3，从北京保藏生物科技有限公司购买，保藏号为cicc 24880，使用2216e海洋培养基，经培养24-30h所得菌液，发光细菌菌液与提取液的体积比为(90-120μl)：(800-1200μl)，稳定时间为15-20min，优选20min。
[0019]
优选地，步骤(3)中，测定发光强度采用多功能酶标仪infinite 200pro。
[0020]
本发明建立了一种简便、高效的土壤重金属有效态提取方法，通过这种提取方法结合发光菌可以综合评价土壤重金属污染水平，该方法操作简单，经济高效。发光菌无法直接应用与土壤重金属毒性评价。本技术创新性的建立新的土壤有效态重金属测试发光菌发光强度的变化。
[0021]
有益效果：
[0022]
(1)本发明采用重金属螯合剂dtpa提取土壤中有效态重金属，并没有对土壤重金属总量进行分析。自20世纪90年代以来，世界各地的立法机构制定了土壤中潜在有毒元素的指导值，以管理污染场地，保护土壤免受有害变化的影响，在这些法规的范围内，污染场地评估和修复的指导值大多是根据土壤中的总金属含量制定的。然而，这可能会无意中高估潜在风险，导致不必要且昂贵的土壤修复工作。此外，生物体只受到土壤重金属的有效态部分不利影响，而不受不可逆地结合到土壤基质的部分不利影响。因此，本方法能够较准确评估土壤中重金属对生物体产生的毒害作用。
[0023]
(2)本发明方法利用明亮发光杆菌t3对土壤重金属毒性进行测定，明亮发光杆菌培养时间较短，容易扩大培养，同时也避免了使用大型仪器，不仅很大程度上缩短了土壤重金属毒性检测时间，而且节省了测试成本。
附图说明
[0024]
下面结合附图和具体实施方式对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/或其他方面的优点将会变得更加清楚。
[0025]
图1是实施例1～3分别计算得到的发光抑制率。
具体实施方式
[0026]
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。
[0027]
以下实施例中，发光细菌菌液通过如下方式培养得到：将购入的发光杆菌冻干粉通过3％nacl溶液活化，将其接入到2216e固体培养基上，在25℃环境中培养24h，然后再将单菌落接入到2216e液体培养基中，培养24-30h，即得到发光稳定的菌液。
[0028]
实施例1
[0029]
本实施例提供了利用发光细菌对土壤中有效态重金属毒性进行检测的方法，包括以下步骤：
[0030]
1、在待测土壤区域内(黑龙江鸡西土样)，采用对角线法采集20cm耕作层混合土
样，将其装入样品袋，贴上样品标签，置于阴凉处风干，待阴干后去除土壤中石块、树枝等杂物，过过10目筛网使其质地均匀，避光保存；
[0031]
2、称取2g均匀土样，加入10ml dtpa溶液，然后将其置于水平震荡箱中反应2h，设置震荡箱震荡速率为180rpm，温度为25℃，反应结束之后，将土壤与dtpa混合液过0.22μm滤膜，收集滤液；
[0032]
3、滤液中加入适量nacl使nacl浓度为3％(w/w)，采用1m naoh水溶液调节滤液ph为中性，然后取900μl提取液，加入100μl发光稳定的明亮发光杆菌t3，稳定20min后，使用多功能酶标仪infinite 200pro测定发光强度，同时测定对照组发光强度，通过以下公式：计算发光抑制率，每组做三个平行。
[0033]
4、通过发光菌发光强度抑制率综合评价土壤重金属污染水平。
[0034]
实施例2
[0035]
本实施例提供了利用发光细菌对土壤中有效态重金属毒性进行检测的方法，包括以下步骤：
[0036]
1、在待测土壤区域内(南通海门土样)，采用对角线法采集20cm耕作层混合土样，将其装入样品袋，贴上样品标签，置于阴凉处风干，待阴干后去除土壤中石块、树枝等杂物，过过10目筛网使其质地均匀，避光保存；
[0037]
2、称取2g均匀土样，加入10ml dtpa溶液，然后将其置于水平震荡箱中反应2h，设置震荡箱震荡速率为180rpm，温度为25℃，反应结束之后，将土壤与dtpa混合液过0.22μm滤膜，收集滤液；
[0038]
3、滤液中加入适量nacl使nacl浓度为3％(w/w)，采用1m naoh水溶液调节滤液ph为中性，然后取900μl提取液，加入100μl发光稳定的明亮发光杆菌t3，稳定20min后，使用多功能酶标仪infinite 200pro测定发光强度，同时测定对照组发光强度，通过以下公式：计算发光抑制率，每组做三个平行。
[0039]
4、通过发光菌发光强度抑制率综合评价土壤重金属污染水平。
[0040]
实施例3
[0041]
本实施例提供了利用发光细菌对土壤中有效态重金属毒性进行检测的方法，包括以下步骤：
[0042]
1、在待测土壤区域内(南通启东土样)，采用对角线法采集20cm耕作层混合土样，将其装入样品袋，贴上样品标签，置于阴凉处风干，待阴干后去除土壤中石块、树枝等杂物，过过10目筛网使其质地均匀，避光保存；
[0043]
2、称取2g均匀土样，加入10ml dtpa溶液，然后将其置于水平震荡箱中反应2h，设置震荡箱震荡速率为180rpm，温度为25℃，反应结束之后，将土壤与dtpa混合液过0.22μm滤膜，收集滤液；
[0044]
3、滤液中加入适量nacl使nacl浓度为3％(w/w)，采用1m naoh水溶液调节滤液ph为中性，然后取900μl提取液，加入100μl发光稳定的明亮发光杆菌t3，稳定20min后，使用多功能酶标仪infinite 200pro测定发光强度，同时测定对照组发光强度，通过以下公式：计算发光抑制率，每组做三个平行。
[0045]
4、通过发光菌发光强度抑制率综合评价土壤重金属污染水平。
[0046]
图1为三个实施例中分别计算出发光抑制率，其中实施例2发光抑制率最高，实施例3发光抑制率最低，而发光抑制率可以明显反应毒性大小，发光抑制率越高，该土壤中有效态重金属毒性越大，可以从图中看出，通过该发明的方法可以简便快速的得出土壤中有效态重金属的综合毒性大小。
[0047]
本发明提供了一种利用发光细菌对土壤中有效态重金属毒性进行检测的方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。