一种快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的方法和试剂盒与流程

1.本发明涉及生物样品检测技术领域，具体涉及一种快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的方法和试剂盒。


背景技术：

2.十多年前美国杜克大学christopher b.newgard发现支链氨基酸在包括糖尿病、肥胖等在内的代谢性疾病存在密切关系，血浆支链氨基酸水平可以预示肥胖、糖尿病的发生、治疗干预的结果。同时芳香族氨基酸水平在肥胖、糖尿病患者血液中发生变化也相继有报道。
3.根据2021年国际糖尿病联盟idf《糖尿病地图集第10版》报告，2021年全球有5.37亿成人糖尿病人，预计2030年增长至6.43亿，2045年达到7.84亿。据《中国2型糖尿病防治指南》分析，我国糖尿病人绝对人数占全球第一，同时在人口中的比例也是世界第一，每100人中有11人，并且在这11中有7人不知道自己血糖超标。
4.血糖指标是糖尿病诊断的临床指标，包括空腹血糖、餐后2小时血糖，以及口服葡萄糖后血糖的变化都是糖尿病诊断的黄金指标。除了血糖指标外，目前已有文献报道，血中的氨基酸，包括支链氨基酸等可以作为糖尿病的生物标志物，辅助诊断糖尿病。但以上这些方法都涉及到需要进行有创的血样本的获取。
5.氨基酸是人体蛋白质的基本组成单元，同时也参与合成激素、神经递质、碳水化合物、脂肪等机体重要代谢物的合成。
6.近年来的研究发现体液，包括血液、唾液、尿液中氨基酸异常与各种疾病相关，比如苯丙酸酮症、精神分裂、阿尔兹海默症、糖尿病、乳腺癌等。所以准确检测氨基酸的方法显得尤为重要。唾液是人体的一种重要的体液，唾液相对于血液来说蛋白含量低，所含成分相对简单。并且唾液的获取是无创性的，操作简单、易于获取。
7.目前市面上有很多氨基酸检测试剂盒，比如美国的ez:faast
tm
、picotag
tm
、aqc.tag
tm
和aqc.tag ultra
tm
，la chromitraq aa45/32
tm
，以及美国fda批准的氨基酸和酰化肉碱ms/ms分析试剂盒。但目前这些试剂盒均针对血液，包括血清和血浆中的氨基酸的定量测定。
8.唾液中氨基酸的检测方法一般有氨基酸分析仪，而气相色谱、毛细管电泳、高效液相以及超高效液相通常与质谱联用，常用质谱有飞行时间质谱、三重四极杆质谱等。由于氨基酸属于极性大的水溶性分子，在反相色谱柱上很难有好的保留，更无法获得各种氨基酸之间的良好分离度。故通常采用衍生的方法加强氨基酸在色谱柱上的保留。针对氨基酸的衍生试剂有印三酮、邻苯二醌、丹璜酰氯、异硫氰酸苯酯以及6-氨基喹啉-n-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(aqc)等。据文献研究报道，印三酮、邻苯二醌、丹璜酰氯的衍生方法存在样本用量大、过程耗时、衍生物不稳定或者操作复杂等问题。
9.就目前的文献研究报道，尚未见有将唾液氨基酸谱及代谢物与糖尿病的生物标志物联系起来的报道，也没有对唾液氨基酸谱进行快速定量的技术方法的报道。


技术实现要素：

10.本发明针对测定肥胖、糖尿病等代谢性疾病血液生物标志物需要有创的获取生物样本，且目前唾液氨基酸定量检测方法前处理过程复杂、需要样本用量大，检测定量过程需要专业的质谱技术人员操作、检测时间较长的问题进行改进，提供了一种快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的方法和试剂盒。
11.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
12.本发明的第一方面是提供一种快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的方法，该氨基酸及其衍生物包括天冬酰氨酸、精氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、牛磺酸、甘氨酸、乙醇胺、胍氨酸、肌氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、β-丙氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、赖氨酸、酪氨酸、脯氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、γ-氨基丁酸、氨基己二酸、β-氨基异丁酸、α-氨基酸丁酸；
13.上述方法将去除蛋白质的唾液样本用aqc衍生试剂进行唾液衍生前处理，最后将处理好的唾液样本采用超高效液相色谱-质谱检测进行定量测定。
14.进一步地，采用预冷过的甲醇溶液去除蛋白。
15.进一步地，唾液样本的体积为20μl。
16.进一步地，aqc衍生试剂为采用乙腈配制而成的，其中6-氨基喹啉-n-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯的浓度为8-14mmol/l，优选为10mmol/l。
17.进一步地，上述唾液衍生前处理的条件为50℃下加热、振摇10分钟。
18.进一步地，上述质谱检测选自qda检测，或单四极杆、三重四极杆、飞行时间、四极杆与飞行时间串联，离子阱质谱检测中的任一质谱仪。
19.进一步地，上述超高效液相色谱的条件如下：
20.反相色谱柱，粒径为1.6μm，50mm长；
21.流动相：a相：浓度为0.01％的甲酸水溶液，b相：含0.01％甲酸的乙腈溶液；
22.梯度洗脱条件为：0
–
0.1min 99.9％
–
90％a相，0.1
–
1min 90％
–
85％a相，1
–
1.5min85％
–
83％a相，1.5
–
3min 83％
–
80％a相，3
–
3.5min80％
–
1％a相，3.5
–
4min1％a相，4
–
4.1min 1％
–
99％a相，4.1
–
6min 99％a相；
23.流速：0.5ml/min；
24.进样体积：1μl。
25.本发明的第二方面是提供一种快速定量唾液中氨基酸的试剂盒，该试剂盒包括上述方法实施过程中所采用的试剂和器材。
26.本发明的第三方面是提供用于快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的试剂在制备诊断代谢性疾病的试剂盒中的应用，该试剂盒包括上述方法实施过程中所采用的试剂。
27.进一步地，代谢性疾病包括肥胖、糖尿病、心血管疾病，其中糖尿病包括1型、2型糖尿病和妊娠糖尿病；该试剂盒诊断代谢性疾病的指标是各个氨基酸或其衍生物的含量，或者各个氨基酸或其衍生物相对于其它氨基酸及其衍生物总和的比例。
28.本发明的第四方面是提供用于快速定量唾液中支链氨基酸和/或芳香族氨基酸的试剂在制备诊断肥胖或糖尿病的试剂盒中的应用，该试剂盒包括上述方法实施过程中所采用的试剂，上述支链氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸中的一种或多种；上述芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸中的一种或多种。
29.进一步地，上述试剂盒诊断肥胖或糖尿病的指标是总支链氨基酸和/或总芳香族氨基酸与其它氨基酸总和的比例，或各个支链氨基酸或芳香族氨基酸与其它氨基酸总和的比例。
30.本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
31.本发明提供的唾液氨基酸定量检测技术简单、快速、不需要质谱专业人员操作，一般实验室人员均可操作，仅需3.0min即完成一个样本的氨基酸谱及衍生物的检测定量，且可靠性高，为快速诊断包括肥胖、糖尿病、心血管疾病等的代谢性疾病提供了切实、可大规模推广的手段。
附图说明
32.图1是28种氨基酸的总离子图，其中：1.asn，2.arg，3.ser，4.gln，5.tau，6.gly，7.ea，8.asp，9.cit，10.sar，11.glu，12.thr，13.β-ala，14.ala，15.gaba，16.2-aaa，17.pro，18.baiba，19.orn，20.aaba，21.lys，22.tyr，23.met，24.val，25.ile，26.leu，27.phe，28.trp；
33.图2显示了糖尿病患者唾液中总支链氨基酸或总芳香族氨基酸与其它氨基酸总和的比值，其中，“*”表示p＜0.05，“**”表示p《0.01；
34.图3显示了糖尿病唾液中各支链氨基酸或各芳香族氨基酸与其它氨基酸总和的比值，其中，“*”表示p＜0.05，“**”表示p《0.01。
具体实施方式
35.本发明提供了一种快速定量唾液中氨基酸及其衍生物的方法和试剂盒。下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
36.实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
37.以下实施例中相关分析采用ibm spss 26version进行spearman斯皮尔曼相关性分析，数据为平均值sd，显著性“*”表示p《0.05，“**”表示p《0.01
38.实施例1
39.本实施例提供一种简单、快速的唾液中氨基酸及其衍生物的定量方法，包括如下步骤：
40.步骤一，获取20μl唾液样本，加入60μl-20℃预冷过的甲醇溶液去除蛋白，在4℃下13200rpm离心10分钟后取20μl上清液，加入70μl ph＝9.18的硼酸缓冲溶液；
41.步骤二，再加入20μl用乙腈配制成10mmol/l的6-氨基喹啉-n-羟基琥珀酰亚胺氨基甲酸酯(aqc)衍生试剂，反应液在50℃下加热、振摇10分钟，置-20℃下放置20分钟，4℃下13200rpm离心10min；
42.步骤三，取离心后的上清液采用waters的acquityuplc-qda色谱-质谱检测器对氨基酸进行定量，具体的为采用粒度为1.6μm，长度为50mm的反相色谱柱；流动相a为浓度为0.01％的甲酸水溶液，流动相b为含0.01％甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱条件为：0
–
0.1min(99.9％
–
90％a)，0.1
–
1min(90％
–
85％a)，1
–
1.5min(85％
–
83％a)，1.5
–
3min(83％
–
80％
a)，3
–
3.5min(80％
–
1％a)，3.5
–
4min(1％a)，4
–
4.1min(1％
–
99％a)，4.1
–
6min(99％a)，流速为0.5ml/min。进样体积为1μl。
43.实施例2
44.本实施例对实施例1提供的定量方法进行验证，具体的实验步骤和结论如下：
45.将28种氨基酸用去离子水配制成每个20mmol/l浓度的母液，用去离子水稀释成在混合标品标准液中含有3组不同浓度的标准品，1组：asp、ea、sar、cit、β-ala、gaba、2-aaa、baiba、aaba、met 10个，浓度均为100μmol/l；2组：asn、arg、glu、orn、tyr、ile、leu、phe、trp 9个，浓度均为400μmol/l；3组：ser、gln、tau、gly、thr、ala、pro、lys、val 9个，浓度均为400μmol/l。精确取20μl混合标品溶液，加入70μl ph＝9.18的硼酸缓冲溶液后，再加入20μl用乙腈配制成10mmol/l的aqc衍生试剂，反应液在50℃下加热、振摇10分钟后置-20℃下放置20分钟，4℃下13200rpm离心10min，取上清液待测定。
46.采用waters的acquityuplc-qda色谱-质谱检测器对氨基酸进行定量，各氨基酸定量离子见下表1，总离子流图见图1所示。
47.表1唾液中各氨基酸衍生后的定量离子
48.[0049][0050]
该方法具有良好的线性关系，28种氨基酸线性方程的r2均大于0.991。重复性的相对偏差rsd均小于10％，精确度在80-120之间，一周内的稳定性的相对偏差均小于15％，日间和日内的精密度的相对偏差也均小于15％，加样回收率均在80-120％之间，表明该方法的可靠性。
[0051]
实施例3
[0052]
本实施例采用实施例1提供的方法探究唾液支链氨基酸与血糖水平及血清支链氨基酸的相关性，具体的操作和结果如下：
[0053]
据文献研究报道，血清支链氨基酸是诊断糖尿病的生物标志物，糖尿病人血清支链氨基酸水平显著高于正常人。分别利用年龄(42
±
12.2和44.3
±
12.1)、性别(1:1)和bmi(23.7
±
2.6和24.8
±
2.7)匹配的正常人(空腹血糖3.5
±
1.5，餐后2h血糖7.7
±
1.4，糖化血红蛋白6.2
±
0.9)和糖尿病人(空腹血糖4.5
±
1.5，餐后2h血糖12.4
±
2.5，糖化血红蛋白14.6
±
3.9)的唾液和血清，取20μl唾液或血清，加入60μl-20℃预冷过的甲醇溶液去除蛋白，在4℃下13200rpm离心10分钟后取20μl上清液，加入70μl ph＝9.18的硼酸缓冲溶液后，再加入20μl用乙腈配制成10mmol/l的aqc衍生试剂，反应液在50℃下加热、振摇10分钟，置-20℃下放置20分钟，4℃下13200rpm离心10min，取上清液用实施例1中的方法定量唾液和血清中的氨基酸含量。
[0054]
采用spss进行空腹血糖、餐后2h血糖和糖化血红蛋白分别与唾液中的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸进行spearman相关性分析，并进一步对唾液中的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸分别与血清中的亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸的相关性进行分析。结果表明，唾液支链氨基酸与餐后2h血糖以及糖化血红蛋白均分别有正显著相关性，p《0.01，如下表2所示，且唾液的支链氨基酸水平与血清支链氨基酸水平也分别有正的显著相关性，如下表3所示，以上结果表明可以利用唾液支链氨基酸水平的变化替代血清支链氨基酸水平作为糖尿病疾病诊断的生物标志物。
[0055]
表2唾液支链氨基酸水平与血糖、糖化血红蛋白的相关系数
[0056]
spearman相关系数和显著性亮氨酸异亮氨酸缬氨酸空腹血糖-0.131-0.185-0.0972h血糖0.345**0.361**0.373**糖化血红蛋白0.384**0.406**0.354**
[0057]
表3唾液支链氨基酸水平与血清支链氨基酸水平的相关性
[0058]
spearman相关系数和显著性唾液_亮氨酸唾液_异亮氨酸唾液_缬氨酸血清_亮氨酸0.236*0.246*0.264*
血清_异亮氨酸0.2080.234*0.232*血清_缬氨酸0.222*0.241*0.258*
[0059]
此外，对糖尿病和正常人的唾液总支链氨基酸或总芳香族氨基酸与其它氨基酸总和的比值发现，糖尿病人唾液中的无论总支链氨基酸或总芳香族氨基酸与正常人相比均显著上升(如图2)。进一步分析每个支链氨基酸和每个芳香族氨基酸与其它氨基酸总和的比值，结果也显示糖尿病人唾液中的各支链氨基酸或芳香族氨基酸与其它氨基酸总和之比均分别显著上升(如图3)。
[0060]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。