肝素结合蛋白HBP检测试剂盒的制备方法与流程

肝素结合蛋白hbp检测试剂盒的制备方法
技术领域
1.本发明涉及医学免疫诊断技术领域，尤其涉及一种肝素结合蛋白hbp检测试剂盒的制备方法。


背景技术：

2.肝素结合蛋白（hbp，heparinbinding protein）是一种由成熟中性粒细胞分泌的蛋白质，当细菌感染或出现急性呼吸窘迫综合症（ards）或者急性肺损伤（ali）以及呼吸衰竭时，其水平会升高。非细菌感染hbp不会升高；hbp是细菌感染最早升高的标志物之一，出现局部的或轻微的细菌感染后1h内即可在血浆中检测到。这是相对降钙素原（pct）的一个优势。
3.肝素结合蛋白（hbp）是存在于中性粒细胞中的蛋白质，由shafer教授在1984年发现并分离成功。由于当时测得的相对分子质量为37000，因此将其命名为cap37（cationic antimicrobial protein of 37000）。后来学者又从嗜苯胺蓝颗粒中分离出具有杀菌活性的嗜苯胺蓝蛋白，命名为azurocidin，即天青杀素。再后来发现其具有极强的肝素结合能力，因此命名为肝素结合蛋白（heparin-bindin protein，hbp）。
4.目前，hbp的检测方法主要为荧光免疫层析法，定量检测。该方法学具有操作过程简单、报告结果时间短、结果准确等优势，应用于各个临床科室可有效提高检测效率，特别对于危重症患者，可有效缩短样本流转时间，尽快帮助临床医生了解患者病情。
5.中国发明专利文献（申请号：202110206856.4）公开了一种肝素结合蛋白测定试剂盒，其包括第一试剂、第二试剂和试纸条。本发明肝素结合蛋白测定试剂盒可通过定量客观反映hbp的存在，为临床诊断及疗效观察和预后判断提供了更有力的实验诊断依据。
6.中国发明专利文献（申请号：201711412733.6）公开了一种肝素结合蛋白的检测试剂盒及其制备方法，该试剂盒为胶乳增强免疫比浊检测试剂。该胶乳增强免疫比浊试剂盒的主要成分是含有缓冲溶液、表面活性剂、盐和防腐剂的稀释液r1以及含有hbp抗体标记的胶乳微粒、缓冲溶液、盐、稳定剂、助悬剂和防腐剂的反应液r2，以及hbp校准品和质控品。所述hbp抗体标记的胶乳微粒标记抗体的方法为物理吸附法、中间酯法、一步法或两步法中的任意一种。所述中间酯法为使用碳化二亚胺类和琥珀酰亚胺酯催化剂活化胶乳微粒表面的羧基，形成表面带有琥珀酰亚胺酯中间体的胶乳微粒，再加入hbp抗体，hbp抗体表面的氨基与胶乳微粒表面的琥珀酰亚胺酯缩合，即完成hbp抗体标记过程。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是，提供一种肝素结合蛋白hbp检测试剂盒，该试剂盒可以快速准确地检测肝素结合蛋白hbp，且该肝素结合蛋白hbp检测试剂盒特异性高，重复性高，稳定性高，检测灵敏度高。
8.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：该肝素结合蛋白hbp检测试剂盒包括试剂卡和稀释液，所述试剂卡包括卡壳和试剂条。
9.优选地，所述试剂条包括底板、样品垫、结合垫、硝酸纤维膜和吸水垫。
10.优选地，所述结合垫经喷金液进行喷金处理，所述喷金液包括鸡igy荧光标记物、hbp抗体1荧光标记物；所述硝酸纤维膜为经过c线划膜液和t线划膜液进行包被。
11.本发明要解决的技术问题是，提供一种肝素结合蛋白hbp检测试剂盒的制备方法。
12.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：该肝素结合蛋白hbp检测试剂盒的制备方法，具体包括以下步骤：s1配液：配制各种中间液，分别保存于容器中，待用；s2标记-标记荧光微球：分别制备鸡igy荧光标记物和hbp抗体1荧光标记物；s3结合垫喷金处理：先对结合垫进行预处理，再采用由鸡igy荧光标记物和hbp抗体1荧光标记物制得的喷金液进行喷金处理，干燥后获得已喷金结合垫，待用；s4包被硝酸纤维膜（nc膜）：配制c线划膜液和t线划膜液，对硝酸纤维膜进行包被；s5吸水垫制备：将吸水纸进行干燥处理，保存备用；s6处理样品垫：使用处理液对样品垫进行处理后干燥，保存备用；s7试剂盒制备：黏贴成型板，切条装入卡壳，包装，ep管灌装样本稀释液，制得试剂盒。
13.优选地，所述步骤s2具体步骤为：s21：筛选hbp检测抗体：选择合适的hbp（荧光标记）抗体1和hbp（包被抗体）2；s22：分别制备鸡igy荧光标记物和hbp抗体1荧光标记物；具体包括以下步骤：s221一次清洗：检查荧光微球颗粒溶液的状况，将荧光微球颗粒吹打混匀，放于ep管中，进行离心后再加入ls001缓冲液，吹打混匀，再次离心后移走上清液；s222活化：将荧光微球颗粒与ls001缓冲液复溶混匀并超声，再采用活化液进行活化孵育，孵育后进行离心并进行清洗，获得活化中间品；s223二次清洗：向所述步骤s222活化反应后的产物中加入ls001缓冲液后离心，去除上层清液，再加入ls001缓冲液吹打混匀；s224偶联：将孵育后的荧光微球颗粒与抗体进行偶联反应；s225封闭：将偶联反应后的荧光微球颗粒采用封闭液进行封闭，获得中间品；s226保存：将所述步骤s225中获得的中间品，进行离心后混入甘氨酸封闭液和bs002保存液，吹打混匀，待用。
14.优选地，所述步骤s222活化的具体步骤为：s2221：加入ls001缓冲液，将所述步骤s221离心后的荧光微球颗粒复溶吹打混匀并水浴超声5min，确保荧光微球颗粒全部混匀；s2222：采用ls001缓冲液配制20mg/ml 的nhs溶液和20mg/ml 的edc溶液，分别取ls001缓冲液溶解nhs与edc，配制成20 mg/ml nhs溶液和20 mg/ml edc 溶液；s2223：取适量所述步骤s2222中配制的20 mg/ml nhs 溶液加入所述步骤s2221处理后的离心管中，并震荡使之完全混匀，再边振荡边加入与nhs溶液等量的20 mg/ml edc 溶液，水浴超声5min，全部混匀；s2224：将所述步骤s2223中混匀后的物料的离心管放入37 ℃的恒温振荡器中，置于200 r/min进行活化反应25min。如过程中底部有沉淀，用超声细胞破碎仪超声5 min，确保无聚集。
15.优选地，所述步骤s224偶联为将hbp抗体1与鸡igy抗体分别进行偶联，具体步骤为：将抗体边振荡边加入到步骤s223二次清洗后的荧光微球颗粒中；振荡混匀，水浴超声5min；确保全部混匀；然后置于37 ℃的恒温振荡器中，200 r/min反应2h。如果过程中底部或瓶壁有沉淀或粘附物，用水浴超声5min，确保无聚集。
16.优选地，hbp抗体1的标记量为：取荧光微球颗粒，按荧光微球颗粒：活化剂(nhs&edc)=4:1的比例加入活化剂活化25min，清洗后按照荧光微球颗粒（mg）：抗体（mg）=10:1的比例，加入hbp抗体1进行标记，反应2h，封闭后离心制备抗体-荧光标记物。
17.优选地，所述步骤s225封闭的具体步骤为：s2251：取恢复至室温fs001封闭液，加入到步骤s224中的偶联后的荧光微球颗粒中，吹打混匀，用水浴超声5min，确保全部混匀；然后于37 ℃的恒温振荡器中，200 r/min反应20 min；s2252：再加入恢复至室温的fs001封闭液，吹打混匀，并水浴超声5min，确保全部混匀；然后再置于37 ℃的恒温振荡器中，200 r/min反应20 min。
18.优选地，所述步骤s226保存的具体步骤为：s2261：封闭完成后放置于4 ℃的高速冷冻离心机16000 r/min、10 min，去上清；再取恢复至室温的封闭液，并吹打重悬混匀；s2262：加入恢复至室温的bs002保存液，吹打混匀，并水浴超声5min，确保全部混匀。
19.优选地，所述步骤s3结合垫喷金处理的具体步骤为：s31结合垫预处理：采用结合垫处理液浸润结合垫并静置后干燥，待用；优选地，所述步骤s31中结合垫处理液的配方包括有：tris-hcl（三羟基氨基甲烷盐酸）缓冲液50mm，其中，溶解于所述tris-hcl缓冲液中的tween 20、tween 80、海藻糖、bsa-2、红细胞单抗和proclin300的体积或质量体积比分别是0.2%-0.5%、0.2%-0.5%、1%-2%、0.5%-1.0%、0.025%-0.05%和0.008%~0.02%；其余为纯化水；优选地，所述步骤s31中结合垫处理液的制备方法，具体包括以下步骤：s311：称取tris、bsa-2、海藻糖放入容器中；s312：向容器中加入纯化水，再取tween20和tween80加入容器中，搅动溶解；s313：再加入proclin300混合均匀，加入盐酸调节ph值；s314：再加入红细胞单抗混合均匀，获得配制好的结合垫处理液，保存备用；s32制备喷金液：s321：按所需制备人份数量确定荧光标记物溶液的总体积，并分别计算鸡igy抗体荧光标记物和hbp抗体1荧光标记物的所需量，以及ds002保存液的所需量；s322：将hbp抗体1荧光标记物和鸡igy抗体荧光标记物用超声波细胞破碎仪超声混匀；再按计算的所需量将各个成分加入容器中，充分溶解、混合，用超声波细胞破碎仪超声混匀，确保荧光微球溶液混合均匀；优选地，喷金浓度为：0.5mg/ml鸡igy抗体荧光标记物；1.5mg/ml hbp抗体1荧光标记物；s33喷金干燥：s331：将已处理结合垫固定在喷金仪的滑台上，检查仪器（确认仪器各参数无误，
进行一次试运行；检查喷金是否正常，确认无误后即可正常进行）；s332：调整仪器设置，使用喷量：2
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l/cm*1次，每条喷金长度30cm，喷金间隔13mm；喷金过程中如出现液体线发虚、歪斜、断点断线、过粗或过细等异常部分需及时准确标出；s333：将已喷金结合垫放到指定网架上，放入烘箱进行干燥，温度45℃，湿度≤30%；干燥时间4小时；s334：干燥后进行裁剪，放入铝箔袋，并在铝箔袋里放入干燥剂，封口，保存。
20.优选地，所述步骤s4包被的具体步骤为：s41：将空白nc膜裁切后黏贴在底板上；s42：分别配置c线划膜液和t线划膜液；s43：对所述步骤s41制得的nc膜进行c线和t线包被，干燥后保存待用。
21.优选地，所述步骤s42中配置c线划膜液的具体步骤包括：根据生产人份数量确定所需的羊抗鸡igy的c线包被抗体的总体积；再将羊抗鸡igy和ms001包被液混合均匀，得到c线划膜液；最后将c线划膜液装入试剂瓶，在瓶外做好标签并放入2-8℃保存。
22.优选地，所述步骤s42中配置t线划膜液的具体步骤包括：根据生产人份数量确定所需的hbp抗体2的t线包被抗体的总体积；再将包被抗体和ms001包被液混合均匀，得到t线划膜液；最后将t线划膜液装入试剂瓶，在瓶外做好标签并放入2-8℃保存。
23.优选地，所述步骤s43中进行c线和t线包被的方法为：将包被用抗体的包被缓冲液稀释成1mg/ml（t线），羊抗鸡igy用包被缓冲液稀释成1mg/ml（c线），用划膜机按1
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l/cm包被于nc膜的测试区和质控区，干燥备用。
具体实施方式
24.为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详细描述，该实施例仅用于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。
25.实施例：该肝素结合蛋白hbp检测试剂盒，具体包括以下步骤：s1配液：配制各种中间液，分别保存于容器中，待用；按称量标准操作规程和中间液配液操作规程称取主配方的各种原辅料，分别保存于适当容器中；可根据需要适当扩大和缩小配制量；实际称量与理论量允许上下浮动1%；其中所述中间液包括：ls001缓冲液为pbs缓冲液，配制100ml的配方为：0.155g二水合磷酸二氢钠溶于100ml纯化水中；ls002中间液为tris缓冲液，配制100ml的配方为：1.58g tris、1.7g氯化钠、0.02ml proclin 300，其余为纯化水；ls009中间液的配方（配制100ml）为：10ml tween 20、0.02ml proclin 300 其余为纯化水；fs001封闭液为甘氨酸封闭液，配方是100ml的配方为：99.5ml的ls001缓冲液、0.376g甘氨酸、0.5ml ls009中间液和0.02ml proclin 300；ms001包被液的配方（配制100ml）为：0.03g二水合磷酸二氢钠、0.291g十二水合磷酸氢二钠、0.905g氯化钠、3.002g蔗糖、0.02ml proclin 300，其余为纯化水；bs002保存液的配方（配制100ml）为：50ml ls002、0.5ml ls009、0.5g bsa-2、
0.02ml proclin 300，其余为纯化水；ds002保存液的配方（配制100ml）为：20g蔗糖、5g海藻糖、50ml ls002、5ml ls009、0.02ml proclin 300，其余为纯化水；cs008结合垫处理液的配方（配制1000ml）为：6.06g tris、20g 海藻糖、5g bsa-2、5ml tween20、5ml tween80、250mg 红细胞单抗、0.2ml proclin 300，其余为纯化水；cs119样品垫处理液的配方（配制1000ml）为：7g s9表面活性剂（生产厂家：扬州施惠尔生物科技有限公司，货号：spbhs9）、10g bsa-2、970ml ls002、30ml ls009、500mg 阻断剂-1（0.02%叠氮化钠，10mm pbs，ph 7.4）、0.2ml proclin 300；ys001样本稀释液的配方（配制100ml）为：0.04g 二水合磷酸二氢钠、0.23g 十二水合磷酸氢二钠、0.85g 氯化钠、0.02ml proclin 300，其余为纯化水；s2标记-标记荧光微球：分别制备鸡igy荧光标记物和hbp抗体1荧光标记物；所述步骤s2具体步骤为：s21：筛选hbp检测抗体：抗体是决定试剂盒性能优劣的决定性因素，因此收集了hbp抗体4对，每对两株抗体既包被用又标记用，共计12组配对抗体；包被抗体划线在nc膜上；标记抗体通过荧光颗粒标记，制备成表面结合有hbp抗体的荧光标记物，喷在结合垫上；对12组配对抗体进行性能检测，检测工作校准品，从试剂的检测本底、反应线性等方面进行功能性评价；hbp抗体原料如表1：表1为抗体原料表筛选步骤包括：s211：将包被用抗体的包被缓冲液稀释成1mg/ml（t线），羊抗鸡igy用包被缓冲液稀释成1mg/ml（c线），用划膜机按1
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l/cm包被于nc膜的测试区和质控区，干燥备用；s212：取荧光颗粒溶液，按微球：活化剂(nhs&edc)=4:1的比例加入活化剂活化25min，再按照荧光颗粒（mg）：抗体（mg）=10:1的比例，分别加入标记抗体进行标记，反应2h，封闭（封闭剂为：fs001封闭液）后离心制备抗体-荧光结合物；通过划膜喷金仪按2.0
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l/cm（hbp荧光标记物1.5mg/ml；鸡igy荧光标记物0.5mg/ml）喷到处理好的结合垫上，干燥备用；测试结果如表2~5；表2 配对一和配对二的测试结果
表3 配对三~配对八的测试结果
表4 配对九和配对十的测试结果
表5 配对十一和配对十二的测试结果结果显示，配对三、配对六、配对九、配对十和配对十二线性较差且倍差小；配对四、配对五、配对十一cv较差；配对二、配对七、配对八和配对一的线性、灵敏度和倍差整体较好，但配对一的信号值稍高一点，故选择配对一作为原料，即包被hbp(h01p2m)，亦即hbp抗体1；标记hbp(h01p1m)，亦即hbp抗体2；s22：分别制备鸡igy荧光标记物和hbp抗体1荧光标记物；具体包括以下步骤：s221一次清洗：检查荧光微球溶液的状况，将荧光微球吹打混匀，放于ep管中，进行离心后再加入ls001缓冲液，吹打混匀，再次离心后移走上清液；s2211：检查荧光微球溶液（固含量10 mg/ml，即浓度），确保无凝聚、无漂浮物等变质情况，将荧光微球吹打混匀，取合适体积放于干净的5 ml ep管中；s2212：用于4 ℃的高速冷冻离心机16000 r/min、10 min 离心，移液器轻轻吸取上清液；s2213：加ls001缓冲液，吹打混匀（如不易混匀时，水浴超声5 min），置于4 ℃的高速冷冻离心机16000 r/min、10 min 离心，移液器轻轻吸取上清液；
s222活化：将荧光微球与清洗缓冲液ls001缓冲液复溶混匀并超声，采用活化液进行活化孵育，孵育后进行离心并进行清洗，获得活化中间品；所述步骤s222活化的具体步骤为：s2221：加入清洗缓冲液（ls001缓冲液），将所述步骤s221离心后的荧光微球复溶吹打混匀并水浴超声5min，确保荧光微球全部混匀；s2222：采用ls001缓冲液分别配制nhs（简称）、edc（简称）溶液(现配现用，20mg/ml)；s2223：取所述步骤s2222中配制的20 mg/ml nhs 溶液加入所述步骤s2221处理后的离心管中，并震荡使之完全混匀，再边振荡边加入等量的20 mg/ml edc 溶液，水浴超声5min，全部混匀；s2224：将所述步骤s2223中混匀后的物料的离心管放入37 ℃的恒温振荡器中，置于200 r/min进行活化反应25min；如过程中底部有沉淀，用超声细胞破碎仪超声5 min确保无聚集；s223二次清洗：向所述步骤s222活化反应后的产物中加入ls001缓冲液后离心，去除上层清液，再加入ls001缓冲液吹打混匀；s2231：将步骤s222后的中间品转移到干净的ep管中，并用ls001缓冲液配平，于4 ℃的高速冷冻离心机16000 r/min、10 min 离心，去上清；s2232：加入相应量的ls001缓冲液，吹打混匀（如不易混匀时，水浴超声5 min）；s224偶联：将孵育后的荧光微球与抗体进行偶联反应；所述步骤s224偶联为将hbp抗体1与鸡igy抗体分别进行偶联，具体步骤为：将抗体边振荡边加入到步骤s223二次清洗后的荧光微球中；振荡混匀，水浴超声5min；确保全部混匀；然后置于37 ℃的恒温振荡器中，200 r/min反应2h；如果过程中底部或瓶壁有沉淀或粘附物，用水浴超声5min，确保无聚集；其中荧光标记hbp抗体1 的抗体用量的确定；原材料如表6所示；表6荧光标记抗体用量的确定的原材料荧光标记抗体用量确定的步骤包括：（1）划线：将包被用抗体的包被缓冲液稀释成1mg/ml（t线），羊抗鸡igy用包被缓冲液稀释成1mg/ml（c线），用划膜机按1
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l/cm包被于nc膜的测试区和质控区，干燥备用；（2）荧光抗体标记：取荧光微球（荧光颗粒200）溶液4mg，按荧光微球：活化剂(nhs&edc)=4:1的比例加入活化剂活化25min，清洗后分成4份，每份1mg，分别按照荧光微球（mg）：抗体（mg）=10:0.5、10:1、10:2、10:5的比例，加入hbp(h01p1m)进行标记，反应2h，封闭后离
心制备抗体-荧光结合物，通过划膜喷金仪按2.0
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l/cm喷到处理好的结合垫上，干燥备用；（3）将剪切好的nc膜、吸水垫、结合垫、样品垫组装成hbp试剂条；（4）用hbp试剂条检测工作校准品；测试结果如表7~8所示；表7 抗体用量为10：0.5与10：1对照的结果表8抗体用量为10：2与10：5对照的结果根据以上结果可以看出，当荧光微球：抗体比为10:0.5时信号值相比对照明显偏低；当荧光微球：抗体比为10:2时测值与对照相比无明显差别，倍差有减小趋势；当荧光微球：抗体比为10:5与对照相比倍差变小线性较差；同时考虑到产品生产成本等因素，故暂选择 10:1作为本发明的最优方案；s225封闭：将偶联反应后的荧光微球分别与鸡igy抗体和hbp抗体1进行封闭，获得中间品；所述步骤s225封闭的具体步骤为：s2251：取恢复至室温fs001封闭液，加入到步骤s224中的偶联后的荧光微球颗粒的ep管中，吹打混匀，用水浴超声5min，确保全部混匀；然后于37 ℃的恒温振荡器中，200 r/min反应20 min；s2252：再加入恢复至室温的fs001封闭液，吹打混匀，并水浴超声5min，确保全部
混匀；然后再置于37 ℃的恒温振荡器中，200 r/min反应20 min；s226保存：将所述步骤s225中获得的中间品，进行离心后混入fs001封闭液和bs002保存液，吹打混匀，待用；s2261：封闭完成后放置于4 ℃的高速冷冻离心机16000 r/min、10 min，去上清；取恢复至室温的fs001封闭液，并吹打重悬混匀；s2262：加入恢复至室温的bs002保存液，吹打混匀，并水浴超声5min，确保全部混匀；s3结合垫喷金处理：先对结合垫进行预处理，再采用由鸡igy荧光标记物和hbp抗体1荧光标记物制得的喷金液进行喷金处理，干燥后获得已喷金结合垫，待用；所述步骤s3结合垫喷金处理的具体步骤为：s31结合垫预处理：采用结合垫处理液（cs008）浸润结合垫并静置后干燥，待用；结合垫处理液的筛选，即对结合垫处理液的要求是：1）结合垫处理液的缓冲体系应有利于荧光物质于抗体的结合与释放；2）结合垫处理液对于产品性能（空白限，cv）有一定的改善作用；根据此标准，本发明选择了cs008处理液作为结合垫处理液进行优化；所述步骤s31中结合垫处理液（cs008）的配方包括有：tris-hcl缓冲液50mm，其中，溶解于所述tris-hcl缓冲液中的tween 20、tween 80、海藻糖、bsa-2、红细胞单抗和proclin300的体积或质量体积比分别是0.2%~0.5%、0.2%~0.5%、1%~2%、0.5%~1.0%、0.025%~0.05%和0.008%~0.02%；其余为纯化水；结合垫处理液的浓度的确定：（1）包被抗体：配制t线包被液，t线包被液中添加hbp(h01p2m)抗体即hbp抗体2（t线），t线中的抗体的终浓度为1 mg/ml；配制c线包被液，c线包被液中添加羊抗鸡igy，使得抗体的终浓度为1mg/ml（c线）；用划膜机按1
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l/cm包被于硝酸纤维素膜的测试区和质控区，各包被液包被，干燥12-20h备用；（2）荧光标记抗体：按标记荧光微球的工艺，使用ls001缓冲液，200nm荧光颗粒，10:1的蛋白用量标记hbp（h01p1m）抗体，离心制备抗体-荧光结合物备用；（3）喷金：将在nc膜筛选中制备好的喷金液通过划膜喷金仪按2.0
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l/cm分别喷到用不同方案的结合垫处理液cs008处理好的结合垫上，干燥备用；（4）将采用不同结合垫处理液的结合垫、nc膜、吸水垫、样品垫组装成试剂条，分别检测参考品；由于结合垫主要影响抗体标记物的释放，因此测试10例阴性质控参考品和10例阳性质控参考品，分析数据的空白限和cv；获得了优化后的结合垫处理液（cs008）的配方为：tris-hcl缓冲液浓度为50mm，添加tween 20的体积比为0.5%，tween 80的体积比为0.5%，海藻糖的质量体积比为2.0%，bsa-2的质量体积比为0.5%，红细胞单抗的质量体积比为0.025%；proclin300的体积比为0.02%；所述步骤s31中结合垫处理液的制备方法，具体包括以下步骤：s311：称取tris、bsa-2、海藻糖放入容器中；s312：向容器中加入纯化水，再取tween20和tween80加入容器中，搅动溶解；s313：再加入proclin300混合均匀，加入盐酸调节ph值；s314：再加入红细胞单抗混合均匀，获得配制好的结合垫处理液cs008；保存备用；
采用结合垫处理液对结合垫进行处理的过程具体包括以下步骤：a．将结合垫处理液（cs008）摇匀，恢复室温；b．取出结合垫，确认尺寸后待用；c．将干净玻片平放在水平桌面待用；d．将单张结合垫居中平放在玻片上，将处理液倒入量筒，再将量筒均匀以“n”型手法从结合垫左下角起至右上角倾倒完毕，倾倒完毕后用滚轮辅助溶液扩散至整张浸润，平衡静置约1min，将平衡静置结束的垫子放到事先清洗干净并烘干的指定网架上，放入干燥间烘箱进行干燥；e．放入45℃烘箱干燥，要求至少4小时，湿度≤30%；f．保持时间达到要求，即可收起已处理结合垫，放入铝箔袋，并在铝箔袋里放入干燥剂，至少200度封口机进行封口保存，铝箔袋外须标明：名称、批号、数量、操作人等，4℃-30℃保存备用；s32制备喷金液：s321：按所需制备人份数量确定荧光标记物溶液的总体积，并分别计算鸡igy抗体荧光标记物和hbp抗体1荧光标记物的所需量，以及ds002保存液的所需量；将hbp抗体1荧光标记物和鸡igy抗体荧光标记物用超声波细胞破碎仪超声混匀；再按计算的所需量将上述各个成分加入容器中，充分溶解、混合，用超声波细胞破碎仪超声混匀，确保荧光微球溶液混合均匀；根据实际生产量，可以等比例缩小或放大；将混合好的荧光微球装入合适大小的ep管中，贴上标签；2℃~8℃保存备用；其中hbp抗体1荧光标记物的喷金液浓度的确定；原材料如表9所示；表9喷金液浓度的确定的原材料喷金液浓度的确定的步骤包括：（1）划线：将包被用抗体的包被缓冲液稀释成1mg/ml（t线），羊抗鸡igy用包被缓冲液稀释成1mg/ml（c线），用划膜机按1
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l/cm包被于nc膜的测试区和质控区，干燥备用；（2）荧光抗体标记：按荧光微球（荧光颗粒200nm）：活化剂（nhs&edc）=4:1的比例加入活化剂活化25min，再按照荧光微球（mg）：抗体（mg）=10:1的比例，加入hbp(h01p1m)进行标记，反应2h，封闭（封闭剂：fs001，20min）后离心制备抗体-荧光结合物；（3）喷金：将抗体-荧光标记物稀释成1mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml、3mg/ml的荧光标记喷金溶液，另外分别添加浓度为0.5mg/ml鸡igy抗体-荧光标记物，通过划膜喷金仪按2.0
ꢀµ
l/cm喷到处理好的结合垫上，干燥备用；（4）将剪切好的nc膜、吸水垫、结合垫、样品垫组装成试剂条；（5）用hbp试剂条检测工作校准品。
26.测试结果如表10~11所示；表10 抗体-荧光标记物稀释成1mg/ml、1.5mg/ml的荧光标记喷金溶液的测试结果表11抗体-荧光标记物稀释成2mg/ml、3mg/ml的荧光标记喷金溶液的测试结果结论：根据以上结果，当荧光标记喷金溶液浓度为1mg/ml信号值降低；当浓度为1.5mg/ml与2mg/ml时相比无明显差别；当浓度为3mg/ml时，倍差变小；考虑到产品生产成本等因素，因此选择1.5mg/ml作为本发明的最优方案；s33喷金干燥：s331：将已处理结合垫固定在喷金仪的滑台上，检查仪器（确认仪器各参数无误，进行一次试运行；检查喷金是否正常，确认无误后即可正常进行）；s332：调整仪器设置，使用喷量：2
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l/cm*1次，每条喷金长度30cm，喷金间隔13mm；喷金过程中如出现液体线发虚、歪斜、断点断线、过粗或过细等异常部分需及时准确标出；s333：将已喷金结合垫放到指定网架上，放入烘箱进行干燥，温度45℃，湿度≤30%；干燥时间4小时；s334：保持时间达到要求，即可收起已喷金结合垫，即干燥后用裁纸刀裁剪成宽13mm备用，放入铝箔袋，并在铝箔袋里放入干燥剂（50g左右），封口，保存；s4包被硝酸纤维膜：配制c线划膜液和t线划膜液，对硝酸纤维膜（nc膜）进行包被；所述步骤s4包被的具体步骤为：s41：将空白nc膜裁切后黏贴在底板上；
s411：将空白膜从铝箔袋中取出；s412：将nc空白膜放在裁切刀合适位置；确定nc空白膜的裁切位置，并固定；按下切刀进行裁切，用量尺复核所裁的nc空白膜长度为30cm；s413：取出带白色双面胶的定制底板（规格：30*7cm），撕开中间位置的双面胶贴纸（规格：30*2.5cm）；s414：轻轻拿起空白nc膜（规格：30*2.5cm）的两端，尽量避免手指甲留下划痕或痕迹；沿靠近样品垫的一侧，与所撕开胶板的上沿对齐，将nc膜的两端，先与胶板粘贴；再将背板整个水平拿起，两侧向下30
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弯折1-2秒钟，保证整个nc膜能完全粘贴在背板上；s415：粘贴好的底板可用于c、t线包被；如暂时不进行抗体包被，则放入铝箔袋，封口，保存；s42：分别配置c线划膜液和t线划膜液；s421：所述步骤s42中配置c线划膜液的具体步骤包括：根据生产人份数量确定所需的羊抗鸡igy的c线包被抗体的总体积；再将羊抗鸡igy和ms001包被液混合均匀，得到c线划膜液；最后将c线划膜液装入合适大小的试剂瓶，在瓶外做好标签并放入2-8℃保存；s422：所述步骤s42中配置t线划膜液的具体步骤包括：根据生产人份数量确定所需的hbp抗体2的t线包被抗体的总体积；再将包被抗体和ms001包被液混合均匀，得到t线划膜液；最后将t线划膜液装入合适大小的试剂瓶，在瓶外做好标签并放入2-8℃保存；s43：对所述步骤s41制得的nc膜进行c线和t线包被，干燥后保存待用；所述步骤s43中进行c线和t线包被的方法为：将包被用抗体的包被缓冲液稀释成1mg/ml（t线），羊抗鸡igy用包被缓冲液稀释成1mg/ml（c线），用划膜机按1
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l/cm包被于nc膜的测试区和质控区，干燥备用；具体为：s431：检查和调节划膜机针头位置和高度，调整c线距下底42.0mm，t线距下底35.0mm，与标准板相符；设置包被量：1
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l/cm；s432：将检测线（t线）溶液、对照线（c线）溶液放到相应的位置（注意：避免产生气泡），操作仪器使液体充满管路；s433：取粘贴好的空白nc膜，放在运行平台相应的位置并固定，选择划膜所需要使用的程序，确认仪器各参数无误，进行一次试运行；检查划膜是否正常，确认无误后即可正常进行；划膜过程中如出现液体线发虚、歪斜、断点断线、过粗或过细等异常部分需及时准确标出；s434：划膜操作结束后，将片材放到指定网架上，放入鼓风干燥箱进行干燥，干燥温度45℃，干燥时间12-20小时；s435：干燥结束后将底板取出，放入装有干燥剂（50克左右）的铝箔袋内，封口，保存；其中t线hbp抗体2的包被浓度的确定；原材料如表12所示；表12t线抗体包被浓度的确定的原材料
t线抗体包被浓度确定的步骤包括：（1）划线：将包被用抗体的包被缓冲液分别稀释成0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2mg/ml（t线）四个浓度，羊抗鸡igy用包被缓冲液稀释成1mg/ml（c线），用划膜机按1
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l/cm包被于nc膜的测试区和质控区，干燥备用；（2）荧光抗体标记：取荧光微球（荧光颗粒200）溶液1mg，按荧光微球：活化剂（nhs&edc）=4:1的比例加入活化剂活化25min，再按照荧光微球（mg）：抗体（mg）=10:1的比例，加入hbp(h01p1m)进行标记，反应2h，封闭（封闭剂：fs001封闭液）后离心制备抗体-荧光结合物；（3）喷金：通过划膜喷金仪按2.0
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l/cm喷到处理好的结合垫上，干燥备用；（4）将剪切好的nc膜、吸水垫、结合垫、样品垫组装成hbp试剂条；（5）用hbp试剂条检测工作校准品。
27.结果如表13~14所示；表13包被用抗体的包被缓冲液分别稀释成0.5mg/ml、1.0mg/ml的测试结果表14 包被用抗体的包被缓冲液分别稀释成1.5mg/ml、2mg/ml的测试结果
结论：根据以上结果，当划线溶液浓度为0.5mg/ml时信号值低；当划线浓度为1mg/ml与1.5mg/ml时无明显差异；当划线浓度为2mg/ml时线性较差倍差变小，所以选择1mg/ml作为本发明的最优方案。
28.s5吸水垫制备：将吸水纸进行烘干处理后按所需规格大小进行切割后，保存备用；s6处理样品垫：使用处理液对样品垫进行处理后干燥并切割，保存备用；s61：样品垫的处理：s611：准备垫子以及cs119样品垫处理液，处理后放入干燥间烘箱进行干燥；s612：放入45℃烘箱干燥，要求至少4小时，湿度≤30%；s62：样品垫裁切，保存备用；s7试剂盒制备：黏贴成型板，切条装入卡壳，包装，ep管灌装样本稀释液，制得试剂盒；s71黏贴成型板：准备已包被的nc膜，贴已喷金结合垫、贴已处理样品垫、贴吸水垫；s72切条装卡壳：依次组装下卡壳、扣卡壳上盖；再进行包装（内包装），封口；s73：样本稀释液（ys001样本稀释液）ep管灌装；最后出厂时进行外包装，并附上说明书和试剂卡，根据实际生产产品的规格进行包装，取包装规格数量的试剂卡、一份说明书和对应规格数量的样本稀释液放入外包盒中；贴好外包盒盒贴，定标二维码。
29.对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，例如从其他公开途径购买得到hbp抗体，采用本发明的hbp检测试剂盒的制备方法进行hbp检测试剂盒的制备，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。