一种基于Y形多重DNA镊子的一步式检测多种霉菌毒素的方法

一种基于y形多重dna镊子的一步式检测多种霉菌毒素的方法
技术领域
1.本发明涉及霉菌毒素的检测方法，特别是黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的检测方法领域。


背景技术：

2.霉菌毒素是一种不同的细胞外代谢物，主要由某些霉菌菌株产生。饲料或食物在生长、收获、储存和加工过程中，通常会被各种霉菌污染。黄曲霉毒素b1(afb1)、赭曲霉毒素a(ota)、伏马菌素b1(fb1)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)是环境中广泛存在的毒性最大的霉菌代谢物。全球发病率数据显示，生谷物中霉菌毒素污染的发生率如下：黄曲霉毒素为55％，赭曲霉毒素a为29％，伏马菌素为61％，脱氧雪腐镰刀菌烯醇为58％，玉米赤霉烯酮为46％。霉菌毒素仍然是一个主要的公共健康问题。由于其致癌作用、免疫抑制作用、神经毒性对人类和动物的影响，黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a已被国际癌症研究机构(iarc)列为最有效的肾致癌物之一。黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a在包括欧盟和美国在内的全球许多国家都对多种食品进行了监管。
3.霉菌毒素可以直接或间接地进入人类的食物链。由于化学稳定性好和哺乳动物组织中的半衰期长，它可以在植物和动物中积累。即使是小剂量的食物，也会导致霉菌毒素在人类和动物体内积累。在过去的几十年里，许多研究检测了生物模型中霉菌毒素的相互作用，显示了加性效应和协同效应。这意味着，联合摄入霉菌毒素可能比单独摄入其中一种霉菌毒素导致更高的不良健康影响风险。因此，应监测食品和环境中霉菌毒素的发生情况，以评估与霉菌毒素相关的风险，并了解霉菌毒素在体外之间的相互作用。
4.在过去的几年里，霉菌毒素的检测取得了重大进展，包括紫外检测、荧光、电化学检测、质谱检测。常用的色谱法对霉菌毒素的测定准确、灵敏。然而，色谱法需要复杂的预处理，经验丰富的操作人员和昂贵的仪器。适配体是单链dna或rna寡核苷酸。它是一种新型的化学抗体，具有化学合成和修饰简单、储存条件友好、免疫原性低、低成本等独特优点。它与抗体的靶标也具有相当的亲和力和特异性。与传统的仪器方法和免疫学方法相比，它已被用于检测多种霉菌毒素，包括赭曲霉毒素a、黄曲霉毒素b1、黄曲霉毒素m1(afm1)、和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)和玉米丙烯酮(zen)。因此，该适配体在环境监测、食品分析、毒理学研究、药物筛选和临床诊断等领域比抗体具有更好的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明提供一种基于y形多重dna镊子的一步式检测多种霉菌毒素的方法。
6.该方法包括如下步骤：
7.1)y形多重dna镊子的合成：通过两步形成y形的多重dna镊子,第一步，含有黄曲霉毒素b1适配体的序列y1,含有赭曲霉毒素a适配体的序列y3，能与dna镊子序列部分配对的序列y2，和赭曲霉毒素a的dna片段、黄曲霉毒素b1的dna片段混合形成y形臂结构；第二步，dna镊子的形成：上述第一步形成的y形臂结构与dna镊子序列1、1’、2、2’和赭曲霉毒素a锁
链序列、黄曲霉毒素b1锁链序列混合形成y形多重dna镊子；
8.2)同时检测赭曲霉毒素a和黄曲霉毒素b1:将多个霉菌毒素样品加入步骤1)所得y形多重dna镊子中，孵育后进行荧光光谱检测，利用标准曲线法计算赭曲霉毒素a和黄曲霉毒素b1的浓度。
9.优选的，所述步骤1)中，序列y1(5’to3’)为gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccactttgta-ccgg-ccattcgg-aaccggta-cgcggaggaagc，序列y2(5’to3’)为ctctgtgttatg-ctgggtgt-ccgaatgg-aaaa-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggacaaagtgg，序列y3(5’to3’)为caggatagatac-taccggtt-acacccag-atctgagtccta。
10.优选的，所述步骤1)中，赭曲霉毒素a的dna片段(5’to3’)为cc-actttg-tc-attaat-at、黄曲霉毒素b1的dna片段(5’to3’)为cg-cgcggg-cg-tgccca-ac。
11.优选的，所述步骤1)中，dna镊子序列1(5’to3’)为cy5-cgcggg-gcttcctccgcg、dna镊子序列1’(5’to3’)为gtatctatcctg-tgccca-dabcyl、dna镊子序列2(5’to3’)为bhq3-actttg-taggactcagat、dna镊子序列2’(5’to3’)为cataacacagag-attaat-fam。
12.优选的，所述步骤1)中，赭曲霉毒素a锁链序列(5’to3’)为at-attaat-ga-caaagt-gg、黄曲霉毒素b1锁链序列(5’to3’)为gt-tgggca-cg-cccgcg-cg。
13.优选的，所述步骤1)中第一步具体为：序列y1,y2，y3和赭曲霉毒素a的dna片段、黄曲霉毒素b1的dna片段混合被加热至90℃。保持5min后，慢慢冷却形成y形臂结构。
14.优选的，所述步骤1)中第二步具体为，第一步形成的y形臂结构与dna镊子序列1、1’、2、2’和赭曲霉毒素a锁链序列、黄曲霉毒素b1锁链序列混合，在室温下杂交30min形成y形多重dna镊子。
15.优选的，所述步骤2)中，孵育的具体时间为40分钟。
16.本文开发了一种多功能的y形多重dna镊子，用于简单、快速、一步同时检测黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a。在两端用两个完整的dna镊子形成y形的双dna臂。第三端尾部包含两种适配体(黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a)。这两个适配体可以与特定的霉菌毒素结合，释放原本结合的赭曲霉毒素a的dna片段、黄曲霉毒素b1的dna片段，分别打开dna镊子。dna镊子的打开可以导致荧光团和猝灭剂的分离，从而导致荧光强度的显著恢复。最后，fam和cy5的荧光强度显著增加。黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的含量可以通过相应的荧光强度进行定量分析。该方法简单、快速，采用自动力dna杂交技术控制y型dna镊子的“开放”。此外，所有的检测过程都可以在60min内完成，只有一步的操作。重要的是，通过替换相应的适体序列，可以扩展到其他霉菌毒素。
附图说明
17.图1为本发明检测过程示意图。
18.图2为不同样品测试所得荧光信号图。
19.图3为优化相关实验条件检测结果图，其中图(a)dna镊子臂的碱基对数、图(b)适配体与短dna片段之间的碱基对数、图(c)孵育温度和图(d)反应时间对y型多重dna镊子荧光强度的影响。
20.图4为黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a同时检测的分析性能图，其中(a)不同浓度的黄曲霉毒素b1的荧光光谱(a-e：0，5、5、50、100和200ng/ml)和赭曲霉毒素a(a-e：4、50、100、
200和300ng/ml)。(b)在0.5-200ng/ml范围内，黄曲霉毒素b1浓度和荧光强度之间的线性图。(c)在4-300ng/ml范围内，赭曲霉毒素a浓度和荧光响应之间的线性图。(d)该方法对其他一些霉菌毒素的抗干扰作用(空白：缓冲液，混合其他霉菌毒素：黄曲霉毒素m1(afm1)和玉米丙烯酮(zen)和和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don))的抗干扰作用和选择性
具体实施例
21.下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明。
22.该方法的检测原理如图1所示，序列y1,y2，y3和赭曲霉毒素a的dna片段、黄曲霉毒素b1的dna片段混合形成y形臂结构；y形臂结构再与dna镊子序列1、1’、2、2’和赭曲霉毒素a锁链序列、黄曲霉毒素b1锁链序列混合形成y形多重dna镊子。此时dna镊子被关闭，荧光强度被猝灭。在目标霉菌毒素存在的情况下，黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a与y形多重dna镊子上的赭曲霉毒素a的dna片段、黄曲霉毒素b1的dna片段竞争，导致y形多重dna镊子上的赭曲霉毒素a的dna片段、黄曲霉毒素b1的dna片段的释放。这些dna片段与dna镊子的锁链序列分别互补。它们可以打开dna镊子，导致荧光团和猝灭剂的分离，最终导致荧光信号的恢复。黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的浓度可以通过相应的荧光强度来确定。通过改变适配体序列，可以扩展到检测其他目标霉菌毒素。
23.实施例1
24.y形多重dna镊子的合成：通过两步形成y形的多重dna镊子：第一步，序列y1,y2，y3(序列y1(5’to3’)为gttgggcacgtgttgtctctctgtgtctcgtgcccttcgctaggcccactttgta-ccgg-ccattcgg-aaccggta-cgcggaggaagc，序列y2(5’to3’)为ctctgtgttatg-ctgggtgt-ccgaatgg-aaaa-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagcatcggacaaagtgg，序列y3(5’to3’)为caggatagatac-taccggtt-acacccag-atctgagtccta)和赭曲霉毒素a的dna片段、黄曲霉毒素b1的dna片段(赭曲霉毒素a的dna片段(5’to3’)为cc-actttg-tc-attaat-at、黄曲霉毒素b1的dna片段(5’to3’)为cg-cgcggg-cg-tgccca-ac)混合被加热至90℃，保持5min后，慢慢冷却形成y形臂结构；第二步，dna镊子的形成：上述第一步形成的y形臂结构与dna镊子序列1、1’、2、2’(dna镊子序列1(5’to3’)为cy5-cgcggg-gcttcctccgcg、dna镊子序列1’(5’to3’)为gtatctatcctg-tgccca-dabcyl、dna镊子序列2(5’to3’)为bhq3-actttg-taggactcagat、dna镊子序列2’(5’to3’)为cataacacagag-attaat-fam)和赭曲霉毒素a锁链序列、黄曲霉毒素b1锁链序列(赭曲霉毒素a锁链序列(5’to3’)为at-attaat-ga-caaagt-gg、黄曲霉毒素b1锁链序列(5’to3’)为gt-tgggca-cg-cccgcg-cg)混合，在室温下杂交30min形成y形多重dna镊子；
25.同时检测赭曲霉毒素a和黄曲霉毒素b1:将多个霉菌毒素样品加入步骤1)所得y形多重dna镊子中，孵育40分钟后进行荧光光谱检测，利用标准曲线法计算赭曲霉毒素a和黄曲霉毒素b1的浓度。
26.实施例2
27.本发明的可行性研究
28.设计了一些不同条件下的样品，研究了该方法的作用机理，检测结果如图2所示。没有黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的空白样品显示出背景荧光强度，表明如果没有黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的存在，dna镊子不能被打开(样品1)。样品2中黄曲霉毒素b1的适配
体(y1)序列发生了改变，导致fam(样品2)的荧光强度较低。在样品3中也发生了类似的情况，其中赭曲霉毒素a的适配体(y2)序列发生了改变，导致cy5的荧光强度较低。样本4(不含黄曲霉毒素b1片段)和样本5(不含赭曲霉毒素a片段)在相应的信号通道上均表现出相似的背景荧光强度。这可以解释为y形的多个dna镊子没有其特定的互补dna片段。在标准条件下的样品在两个信号通道(实施例1，样品6)上均表现出较高的荧光强度，所有的结果都间接证明了该方法的工作机制和可行性。
29.实施例3
30.优化相关实验条件
31.一些实验参数对该方法的性能有很大的影响。因此，需要优化获得最佳效率，如dna镊子臂的碱基对数、适配体与短dna片段之间的碱基对数、孵育温度和反应时间。
32.dna镊子臂的碱基对数量会显著影响dna镊子的稳定性。结果表明，当臂的碱基对数小于6时，荧光信号是稳定的。但当碱基对数为10时，荧光信号明显降低。这可以解释为dna镊子具有较强的稳定性，且短dna片段与锁链序列之间的杂交效率较低(图3a)。此外，当臂碱基对数大于6时，背景信号(无目标)明显下降。因此，选择dna镊子的臂碱基对数为6。
33.霉菌毒素与适配体的结合效率受适配体与短dna片段之间的碱基对数的影响。如图3b所示。当碱基对数较低时，由于适配体与霉菌毒素之间的高结合亲和力，荧光信号较高。当碱基对数增加到20时，荧光信号大大降低。这是由于适配体和霉菌毒素短dna片段之间的高稳定性，这极大地增加了用霉菌毒素取代dna片段的难度。然而，当碱基对数低于10时，适配体和短dna片段的熔化温度低于室温，这是由寡聚分析仪计算出来的。因此，适配体和短dna片段之间的碱基对数被选择为10。
34.孵育温度会影响y型多重dna镊子的稳定性和开放效率。如图3c所示，荧光信号随温度增加，在25℃左右稳定，但由于y形多dna镊子的热稳定性较弱，背景随温度明显增加。因此，该方法的最佳孵育温度选择在25℃.
35.孵育时间与y形多重dna镊子打开的完成程度有关。因此，在这里优化了孵育时间(图3d)。结果表明，荧光强度随孵育时间的延长而呈阳性。信号随时间明显增加，并在40min左右保持稳定。这一结果表明，适配体结合和dna镊子开放几乎完成。因此，孵育时间选择为40min。
36.实施例4
37.黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a同时检测的分析性能
38.在具体实施例1的条件下，研究了包括线性范围和灵敏度在内的分析性能(图4a)。fam的荧光强度随黄曲霉毒素b1浓度的增加而显著增加，在0.5-200ng/ml呈线性关系(r2＝0.995)，检测限(lod)为0.1ng/ml(图4b)。此外，cy5的荧光强度也随赭曲霉毒素a浓度的增加而明显增强，在4-300ng/ml之间呈良好的线性范围(r2＝0.990)，lod为2ng/ml(图4c)。lod的计算方法是程序性空白样品的标准偏差的三倍。该方法的lod可与那些仅基于适配体的方法检测一种霉菌毒素(no：1-5)的方法相比较。此外，lod也与那些多种霉菌毒素检测方法一样好(编号：6-7)。此外，我们的方法非常简单，只需一步操作，可以在60min内完成。
39.在霉菌毒素分析中，联合霉菌毒素分离是实际应用的关键挑战。在相同的实验程序下，通过比较探索其他一些常见的霉菌毒素，包括黄曲霉毒素m1(afm1)和玉米赤霉烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇，来探讨其特异性。如图4d所示，黄曲霉毒素m1(afm1)和玉米赤霉烯
酮、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其混合物的信号都几乎可以忽略不计。只有黄曲霉毒素b1或赭曲霉毒素a及其混合物在相应的信号通道上显示出较强的荧光信号。这些结果可以归因于这些相关的霉菌毒素与特异性适配体的亲和力较弱，表明所提出的方法对多种霉菌毒素的检测具有良好的特异性。
40.实施例5
41.真实的食品样品分析
42.利用直接从当地超市获得的食品样品对其实际应用能力进行了评价。所有样品均为随机购买，固体样品至少1公斤，液体样品至少1升。在测试前需要进行一些简单的预处理。固体样品需要粉碎，然后用甲醇-水(70：30v/v)混合溶液提取。液体样品用甲醇-水(70：30v/v)混合溶液直接提取。摇晃30min后，通过以下离心去除沉淀。用0.22μm膜过滤上清液，然后按实施例1中的步骤检测霉菌毒素。
43.表1的结果显示，食品样品中黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的浓度均低于规定的最大残留量。另外，将两种不同浓度的黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a加入到食品样品中进行回收率试验。该方法的回收率在92.0％-107.0％之间，rsd值在4.6％-8.5％之间，满足了实际应用的要求。这些结果也被标准的hplc方法所验证。
44.表1真实食品样品中黄曲霉毒素b1和赭曲霉毒素a的测定
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以上所述仅为本技术的优选实施例而已，并不用于限制本技术，对于本领域的技术人员来说，本技术可以有各种更改和变化。凡在本技术的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本技术的保护范围之内。