v-ATPase作为早期阿尔兹海默症生物标志物

v-atpase作为早期阿尔兹海默症生物标志物
技术领域
1.本发明涉及早期阿尔兹海默症的诊断领域，尤其涉及v-atpase作为早期阿尔兹海默症生物标志物中的应用。


背景技术：

2.阿尔茨海默病(alzheimer' s disease，ad)是一种与年龄相关的进行性神经系统变性疾病。ad的核心症状是记忆障碍伴有其他认知域的损害，并对正常生活、工作造成影响。ad起病隐蔽、病程呈不可逆发展，致残率高，因此，早期诊治对提高 ad病患生存率、尤其对提高其生存质量意义重大
1.。
3.目前检测早期ad经典生物标志物有β淀粉样蛋白42（amyloidβ-protein 42，aβ
42
），总tau（t-tau）和磷酸化tau（p-tau），以及新发现的神经颗粒蛋白及microrna。通常ad患者脑脊液（cerebro-spinal fluid, csf）中的t-tau 和 p-tau显著增加，aβ
42
显著减少
2.、ad患者csf神经颗粒蛋白显著增加
3.以及mir-100、mir-1274a和mir-146a在ad中具有显著差异表达
4.。现有的生物标志物不能满足临床需求，使得寻找早期ad生物标志物已迫在眉睫。
4.v-atpase:是一种依靠水解atp提供能量来转移质子的多亚基复合物,主要分布于真核细胞内多种细胞器的内膜系统上,在人体的肾,脑,睾丸,内耳,骨骼,皮肤等器官有广泛表达。v-atpase全酶是由两个亚单位v0和v1构成的多亚基聚合体，v0是含5种亚基（a、d、e、c、c”）的跨膜蛋白，v1位于细胞质，包括8种亚基（a、b、c、d、e、f、g、h）
5.。atp6v1a
6.和atp6v0a1的突变
7.会导致v-atpase不能行使功能，导致溶酶体酸化失败，从而引起自噬小体和自噬溶酶体在脑内大量堆积，引起认知障碍。
5.app/ps1小鼠:可表达突变的人类早老素(deltae9)和人鼠淀粉样前体蛋白(appswe)融合体，app/ps1(ad)双转基因小鼠这两个基因的表达都由小鼠朊病毒蛋白启动子启动。人类早老素基因的deltae9突变是该基因的第九个外显子缺失产生的，此突变会导致早发性老年痴呆症。对小鼠脑蛋白匀浆进行免疫检测发现，人类早老素蛋白高水平地替代了可检测到的小鼠内源性蛋白。并且，在app/ps1(ad)双转基因的小鼠脑匀浆中还检测到人源淀粉样前体蛋白。据报道，该双转基因模型鼠在7月龄大脑可见老年斑，随着月龄增加，大脑皮层老年斑数量体积明显增加，9-12月龄小鼠大脑出现与ad患者相似的老年斑
8.。


技术实现要素：

6.为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种v-atpase作为诊断早期阿尔兹海默症生物标志物。
7.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：本发明提供了检测尿液v-atpase水平的试剂在制备诊断早期阿尔兹海默症的试剂或试剂盒中的应用。
8.作为本发明的一个优选例，所述的检测尿液v-atpase水平的试剂为elisa试剂。
9.采用上述技术方案的有益效果是：
1.本发明通过水迷宫证实4月龄app/ps1小鼠未出现学习记忆障碍；硫磺素-s染色表明4月龄app/ps1小鼠未出现aβ斑块。说明小鼠还未出现ad的表征。
10.2.本发明通过检测4月龄小鼠尿液中v-atpase含量，与wt型小鼠相比，app/ps1小鼠尿液中v-atpase的含量增加。蛋白免疫印迹（wb）实验检测到4月龄app/ps1小鼠海马部位的atp6v1a、atp6v0a1表达水平降低。
11.3.本发明4月龄app/ps1小鼠在淀粉样斑块及学习记忆障碍出现之前，app/ps1小鼠已经出现了v-atpase变化。证实v-atpase可作为早期阿尔兹海默症的生物标志物。
12.4.本发明采用尿液检测是无创的，优于传统的脑脊液和血液检测。
附图说明
13.图1为4月龄app/ps1小鼠的学习记忆能力。(a)4月龄app/ps1 小鼠第1-4天平均逃避潜伏期。(b)4月龄app/ps1小鼠第5天空间探索轨迹图。
14.图2为4月龄app/ps1及wt小鼠海马部位的老年斑沉积。(40
×
，标尺＝200μm)
15.图3为app/ps1小鼠尿液中v-atpase的含量。(n＝6, app/ps1 vs wt,*p《0.01)。图4为4月龄app/ps1小鼠海马v-atpase亚基的表达水平。(a) atp6v0a1,atp6v1a的代表性条带。(b和c)atp6v0a1,atp6v1a的 蛋白表达水平的定量统计。(n＝6,app/ps1 vs wt,*p《0.05)。
具体实施方式
16.下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
17.（一）实施方法：（1）动物分组4月龄雄性app/ps1小鼠9只，野生型小鼠9只（spf级），体重(22
±
5g)。所有实验动物均饲养于spf级动物房，环境安静，相对恒定室温（22
±
1℃）和湿度（55%
±
5%），动物自由饮食饮水。实验前适应性喂养2周。水迷宫后直接进行取材；（2）水迷宫实验4月龄app/ps1小鼠行morris水迷宫检测小鼠记忆能力，装置主要由隐藏平台、直径120cm,高度50cm的白色圆盆、自动记录分析系统组成。利用自动分析系统将水盆分为四个象限，隐藏平台始终固定在第一象限或者第三象限，隐藏平台直径60 cm，高29cm，实验执行过程中该平台始终淹没在水下1cm；为期5天迷宫实验分为两个步骤完成：前1-4天为定位航行测试，该步骤中所有小鼠每天均被训练3次，全部训练结束后，记录小鼠在60s内找到隐藏平台的时间，即逃避潜伏期，如果小鼠在规定时间内未找到，引导小鼠找到隐藏平台，并让其停留20s后结束；第5天空间探索测试中，撤掉水池中隐藏平台，小鼠只执行一次下水任务并记录60s内的轨迹，目标现象停留时间；最后根据系统记录的相应指标，进行数据处理，
统计分析；（3）取材及标本制备行为学实验结束后，每组随机选取3只小鼠，利用戊巴比妥钠（50 mg/kg）腹腔注射麻醉后打开胸腔暴露心脏，0.01 m 磷酸盐缓冲液（phosphate belanced solution，pbs）从心尖位置缓慢地被注入洗净血液后，用预冷的4%的多聚甲醛灌注固定至小鼠头颈部位僵硬，四肢发白后终止灌流，断头取脑，将完整大脑用4%的多聚甲醛溶液固定，48 h后，用30%蔗糖溶液脱水；剩余小鼠麻醉后迅速取脑于冰盒上分离出海马组织装于ep管中标记并置于-80 ℃低温冰箱保存，用于后续相关指标检测；（4）硫磺素-s染色利用硫磺素-s染色观察小鼠海马老年斑沉积。4%多聚甲醛固定48 h后的大脑用30%蔗糖溶液脱水3天后，在冰冻切片机上连续切片(切片厚度30
µ
m，包含完整的海马结构)。用载玻片将切片贴好，切片37℃复温20 min，pbs溶液漂洗2次/5 min，取100
µ
l1%硫磺素-s覆盖住组织，避光染20 min，pbs漂洗3次/5 min，70%的乙醇洗脱10 min，pbs洗3次，每次5 min，滤纸轻轻擦掉组织旁边水分，用正置显微镜4
×
观察老年斑，每只小鼠分别选取相同冠状切面的3张脑片拍摄并使用image-pro plus软件对海马区域老年斑进行统计；（5）elisa检测尿液中v-atpase含量收集小鼠尿液，1000xg离心20min，取上清进行后续检测；elisa试剂盒购至上海江莱生物科技有限公司。具体检测步骤如下：江莱生物小鼠v-atp酶试剂盒室温平衡60min, 标准品孔加不同浓度的标准品50
µ
l，样本孔加待测样本50
µ
l, 空白孔加样本稀释液50
µ
l
→
每孔加入辣根过氧化物酶（hrp）标记的检测抗体100
µ
l, 封孔，37℃温育60min
→
弃去液体，拍干，加满洗涤液反复洗涤拍干5次，加入底物a，b各50
µ
l，37℃避光敷育15min，每孔加50
µ
l，15min内，450nm下测定各孔的od值；（6）蛋白免疫印迹（western blot, wb）实验1）海马组织蛋白的提取：取海马50mg，加入300μl裂解液（ripa:pmsf:蛋白磷酸酶抑制剂混合物=100:1:1），冰上裂解30min后，4℃离心（12000rpm, 10min），收集上清；2）二喹啉甲酸（bicinchoninic acid, bca）法测定蛋白浓度：（a）将5mg/ml的蛋白标准品用pbs稀释成0.5mg/ml的标准品备用；（b）按每孔200
µ
l的体积配制bca工作液（a液: b液=50:1），现配现用；（c）配制比例标准液，如表1；（d）将之前收集的蛋白样本按每孔20
µ
l的体积用pbs稀释30倍，每个样本设置3个复孔；（e）将配制好的标准品和样本稀释液分别按20
µ
l/孔加入96孔板中，然后再每孔加
入200
µ
l bca工作液，37℃烘箱孵育30min，酶标仪上562nm处测量吸光度od值；（f）拟合出标准曲线，并根据标准曲线计算样本浓度；3）变性：用pbs将蛋白浓度统一稀释到最大浓度，一般为30
ꢀµ
g/10ul，加5
×
蛋白上样缓冲液混匀，100℃高温变性10min，-20℃保存备用；4）配胶：根据目的蛋白分子量的不同，配制不同浓度的分离胶；具体配胶方案如表2：5）电泳：蛋白样品充分混匀，上样体积为marker：1.5
µ
l，样本：10
µ
l；6）电转：甲醇活化pvdf膜，1
×
快转液泡滤纸。电转仪最下层铺上一层滤纸，然后铺pvdf膜，小心放上电泳后的凝胶，凝胶上面再铺一层滤纸，即可进行电转。电转完成后，弃去凝胶，取出pvdf膜，于tbst中洗5min
×
1次；7）封闭：以5%脱脂牛奶摇床振荡室温封闭2.5h，tbst洗10min
×
3次；8）切膜：依据marker所提示不同蛋白分子量的位置，分别切下目的蛋白以及内参的条带；9）一抗敷育：4℃孵育17h；一抗稀释比例：atp6v1a 抗体(1:2000)，atp6v0a1 抗体(1:2000)，tbst洗10 min
×
3次；10）二抗敷育：4℃孵育40min，二抗稀释比例：1：5000，tbst洗10 min
×
3次；11）曝光：等体积的ecl工作液a与b混合，化学发光成像系统分析目标条带及其内参；12）数据统计：采用image lab对条带进行定量分析。
18.（7）数据分析所有实验数据均采用spss22.0统计分析软件，数据以均数
±
标准差（
±
sd）表示，水迷宫实验数据采用重复测量方差分析方法，如p》0.05，则采用球型检验分析；如p《0.05，则使用greenhouse-geisser法进行校正分析。各组间不同时间点的分析采用多元方差分析，事后原则同单因素方差分析；单因素方差分析用于其他各指标间的两两比较，方差齐用lsd检验，方差不齐用dunnett’s t3检验，p《0.05有统计学意义。
19.（二）结果（1）水迷宫实验为了检测app/ps1小鼠早期是否开始出现学习记忆障碍，采用morris水迷宫实验
检测其空间学习记忆能力。结果表明两组小鼠随着每日训练，平均逃避潜伏期均日渐缩短，定向航行实验数据重复测量，mauchly’s球形检验p》0.05，说明服从球形假设。分组主效应无统计学差异，说明app/ps1对照组小鼠的平均潜伏期与wt对照组小鼠无明显差异，且时间和分组的相互作用没有统计学差异，如图1中a所示。同时在第五天的空间探索实验中，两组小鼠的运动轨迹和穿越平台次数并无明显差异，如图1中b所示。说明4月龄app/ps1小鼠并未出现学习记忆障碍。
20.（2）硫磺素-s染色采用硫磺素-s染色观察早期app/ps1小鼠脑内达淀粉样斑块变化情况，如图2所示。结果显示，4月龄app/ps1小鼠与wt组相同，并未出现aβ斑块。
21.（3）elisa检测尿液中v-atpase含量通过elisa检测4月龄app/ps1小鼠尿液中v-atpase含量，结果显示，与wt型小鼠相比，app/ps1小鼠尿液中v-atpase的含量显著增加，如图3所示。
22.（4）蛋白免疫印迹（western blot, wb）实验采用western blot检测了4月龄app/ps1小鼠海马v-atp酶相关亚基的蛋白表达，结果显示，与同月龄野生型小鼠相比，4月龄app/ps1小鼠海马部位的atp6v1a、atp6v0a1表达水平降低，如图4所示。
23.参考文献[1]洪萍,王培昌,刘辰庚,张跃其.阿尔茨海默病患者生物标志物的研究进展[j].临床检验杂志,2014,32(07):522-524.doi:10.13602/j.cnki.jcls.2014.07.12.[2]blennow k, zetterberg h. the past and the future of alzheimer's disease fluid biomarkers. j alzheimers dis. 2018;62(3):1125-1140. doi:10.3233/jad-170773.[3]thorsell a, bjerke m, gobom j, et al. neurogranin in cerebrospinal fluid as a marker of synaptic degeneration in alzheimer's disease. brain res. 2010;1362:13-22. doi:10.1016/j.brainres.2010.09.073.[4]denk j, boelmans k, siegismund c, lassner d, arlt s, jahn h. microrna profiling of csf reveals potential biomarkers to detect alzheimer`s disease. plos one. 2015;10(5):e0126423. published 2015 may 20. doi:10.1371/journal.pone.0126423.[5] abbas ym, wu d, bueler sa, robinson cv, rubinstein jl. structure of v-atpase from the mammalian brain. science. 2020;367(6483):1240-1246. doi:10.1126/science.aaz2924.[6] fassio a, esposito a, kato m, et al. de novo mutations of the atp6v1a gene cause developmental encephalopathy with epilepsy. brain. 2018;141(6):1703-1718. doi:10.1093/brain/awy092.[7] aoto k, kato m, akita t, et al. atp6v0a1 encoding the a1-subunit of the v0 domain of vacuolar h+-atpases is essential for brain development in humans and mice. nat commun. 2021;12(1):2107. published 2021 apr 8。
[0024]
[8]宗园媛,王晓映,王海林,刘亚莉,黄澜,马春梅,张连峰,秦川.app/ps双转基因
阿尔茨海默病小鼠模型的老年斑及行为学动态分析[j].中国比较医学杂志,2008(09):8-12+87-88。