一种3-氨基-6-甲氧基哒嗪有关物质的检测方法与流程

1.本发明属于医药技术领域，涉及一种医药中间体3-氨基-6-甲氧基哒嗪中有关物质的检测方法。


背景技术：

2.3-氨基-6-甲氧基哒嗪(英文名：3-amino-6-methoxydazine)是一种重要医药中间体，其可以用于具有显著生物活性的吡啶并嘧啶类化合物或药品，如抗癌药瑞卢戈利，该药可用于治疗子宫内膜异位症引起的疼痛、子宫肌瘤以及晚期前列腺癌等适应症。
3.目前，关于该化合物制备方法的报道有很多，在现有合成工艺的过程中往往会引入多种工艺杂质，如3-氨基-6-氯哒嗪(杂质a)、3-氨基-6-羟基哒嗪(杂质b)、3-氯-6-羟基哒嗪(杂质c)、3,3-二氯哒嗪(杂质d)、3,6-二甲氧基哒嗪(杂质e)、3-氨基-6-甲氧基哒嗪(杂质f)、3-氨基哒嗪(杂质g)等7种，但并没有相关文献报道这些工艺杂质的检测方法。因此，开发一种能够实现对3-氨基-6-甲氧基哒嗪中有关物质的检测方法，对提供用药安全和3-氨基-6-甲氧基哒嗪的质量控制具有重要意义。


技术实现要素：

4.发明目的：本发明旨在提供一种分离度、准确度、重现性及稳定性均良好，检出限低，分析时间短的3-氨基-6-甲氧基哒嗪中有关物质的检测方法。
5.技术方案：本发明提供的3-氨基-6-甲氧基哒嗪中有关物质的检测方法包含以下步骤：
6.(1)配制供试品溶液和对照溶液；
7.(2)检测和记录：采用液相色谱法对所述供试品溶液和对照溶液进行检测并记录谱图，所述液相色谱的色谱条件为：
8.色谱柱：耐水的十八烷基键合硅胶柱；流动相：以六氟磷酸钾缓冲液(用磷酸调ph至2.8～3.2)为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；流速：0.9～1.1ml/min；柱温：33～37℃；检测波长：213～217nm。
9.作为优选，在液相色谱仪的进样器前接有鬼峰捕集柱。
10.进一步地，步骤(1)中供试品溶液的浓度为0.5mg/ml，对照溶液的浓度为1μg/ml。
11.溶剂：水。
12.溶液的配制方法：
13.杂质a贮备液(7.5μg/ml)：精密称取15mg的杂质a对照品，置100ml量瓶中，加20ml 20％乙腈超声使溶解，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取该溶液5ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
14.其它杂质贮备液(7.5μg/ml)：精密称取15mg的其它各杂质对照品，精密称定，置100ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取该溶液5ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
15.供试品溶液：精密称取3-氨基-6-甲氧基哒嗪供试品约25mg，置于50ml量瓶中，加水超声使溶解，再加水至刻度，摇匀；
16.对照溶液：量取上述供试品溶液2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得溶液i；量取溶液i 5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
17.进一步地，步骤(2)中检测使用的色谱柱的型号为atlantis t3柱或sepax hp c18柱。atlantis t3柱的规格为粒径(μm)
×
内径(mm)
×
柱长(mm)：3
×
4.6
×
150；sepax hp c18柱的规格为粒径(μm)
×
内径(mm)
×
柱长(mm)：5
×
4.6
×
250。
18.进一步地，步骤(2)流动相a中六氟磷酸钾缓冲液的浓度为15～25mmol/l。
19.进一步地，步骤(2)流动相梯度洗脱过程如下：
20.时间(min)流动相a(％)流动相b(％)010005100025752525.011000351000
21.进一步地，步骤(2)中检测的对照溶液、供试品溶液进样量为5～10μl。
22.计算公式：
[0023][0024][0025]
总杂(％)＝未知单杂之和(％)+已知杂质之和(％)；
[0026]
其中a
杂质
—供试品溶液中各已知杂质的峰面积；a
对照
—对照溶液峰面积；f—各已知杂质校正因子。
[0027]
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
[0028]
(1)建立了3-氨基-6-甲氧基哒嗪中有关物质的检测方法，可以快速、准确地测定各有关物质的含量；
[0029]
(2)方法操作简便，可以有效检测3-氨基-6-甲氧基哒嗪中有关物质的含量，灵敏度高(检出限为0.045μg/ml，定量限为0.15μg/ml)、专属性强(空白溶剂和降解实验对杂质检测干扰)、线性相关性良好(r2＞0.999)、准确度高(不同浓度水平加标回收率在94％～106％之间，且回收率rsd值＜5％，重复性及中间精密度rsd值均＜3％)；
[0030]
(3)方法耐用性好，可用于各种供试品中3-氨基-6-甲氧基哒嗪中有关物质的质量控制。
附图说明
[0031]
图1为系统适用性溶液的hplc色谱图。
[0032]
图2为空白溶剂的hplc色谱图。
[0033]
图3为供试品溶液的hplc色谱图。
[0034]
图4为对比实施例1中系统适用性溶液的hplc色谱图。
[0035]
图5为对比实施例2中系统适用性溶液的hplc色谱图
[0036]
图6为ph＝2.7的色谱条件下系统适用性溶液的hplc色谱图。
[0037]
图7为ph＝3.3的色谱条件下系统适用性溶液的hplc色谱图。
具体实施方式
[0038]
下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。
[0039]
溶液的配制方法：
[0040]
杂质a贮备液(7.5μg/ml)：精密称取15mg的杂质a对照品，置100ml量瓶中，加20ml 20％乙腈超声使溶解，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取该溶液5ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0041]
其它杂质贮备液(7.5μg/ml)：精密称取15mg的其它各杂质对照品，精密称定，置100ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取该溶液5ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0042]
3-氨基-6-甲氧基哒嗪对照品贮备液的配制：精密称取3-氨基-6甲氧基哒嗪对照品约25mg，置50ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，再用水稀释至刻度，摇匀。
[0043]
供试品溶液的配制：精密称取3-氨基-6-甲氧基哒嗪供试品约25mg，置于50ml量瓶中，加水超声使溶解，再加水至刻度，摇匀。
[0044]
对照溶液的配制：量取上述供试品溶液2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得溶液i；量取溶液i 5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0045]
实施例1系统适用性试验
[0046]
系统适用性溶液的配制：取3-氨基-6-甲氧基哒嗪供试品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，再精密加入7.5μg/ml的各杂质贮备液各5ml，用水稀释至刻度，摇匀，制成各杂质0.75μg/ml和3-氨基-6-甲氧基哒嗪0.5mg/ml的系统适用性溶液。进样测试，检测条件如下：色谱柱：atlantis t3柱；流动相：以20mmol/l六氟磷酸钾缓冲液(用磷酸调ph至3.0)为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；进样量5μl。记录结果，如表1和图1所示。
[0047]
表1系统适用性试验结果
[0048]
成分浓度(μg/ml)相对保留时间分离度杂质a(impuritya)0.750.8435.05杂质b(impurityb)0.750.25n/a杂质c(impurityc)0.750.957.34杂质d(impurityd)0.751.3719.88杂质e(impuritye)0.751.475.92杂质f(impurityf)0.751.533.47杂质g(impurityg)0.750.282.943-氨基-6-甲氧基哒嗪50012.64
[0049]
试验结果显示，系统适用性溶液中主峰与相邻杂质分离较好，各杂质间分离较好。
[0050]
实施例2专属性试验
[0051]
2.1干扰试验
[0052]
空白溶剂：水
[0053]
供试品溶液的配制：精密称取3-氨基-6-甲氧基哒嗪供试品约25mg，置50ml量瓶中，加水超声使溶液，冷却至室温，再用水稀释至刻度，摇匀。
[0054]
对空白溶剂和供试品溶液分别进样，检测条件如下：色谱柱：atlantis t3柱；流动相：以20mmol/l六氟磷酸钾缓冲液(用磷酸调ph至3.0)为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；进样量5μl。记录结果，谱图分别如图2和图3所示。结果表明，空白溶剂不干扰供试品的检测，且主峰纯度＞990。
[0055]
2.2破坏试验
[0056]
供试品溶液：精密称取3-氨基-6-甲氧基哒嗪供试品约25mg，置于50ml量瓶中，加水超声使溶解，再加水至刻度，摇匀；
[0057]
对照溶液：量取上述供试品溶液2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得溶液i；量取溶液i 5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0058]
氧化降解试验：精密称取3-氨基-6-甲氧基哒供试品约25mg，置50ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，加入3％过氧化氢溶液1ml，室温放置3小时，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0059]
酸降解试验：取3-氨基-6-甲氧基哒供试品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水适量(约30ml)超声使溶解，冷却至室温，加0.1mol/l盐酸溶液1ml，室温放置3小时，用1ml的0.1mol/l氢氧化钠溶液中和，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0060]
碱破坏：取3-氨基-6-甲氧基哒供试品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水适量(约30ml)超声使溶解，冷却至室温，加0.1mol/l氢氧化钠溶液1ml，室温放置3小时，用1ml的0.1mol/l盐酸溶液中和，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0061]
固体高温破坏：取3-氨基-6-甲氧基哒供试品适量于称量瓶中，摊成≤5mm厚的薄层，置60℃的烘箱中放置3小时，取出，放冷至室温，取本品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0062]
溶液高温破坏：取3-氨基-6-甲氧基哒供试品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，水浴60℃放置3小时，取出，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0063]
固体光破坏：取3-氨基-6-甲氧基哒供试品适量于称量瓶中，摊成≤5mm厚的薄层，置4500lx
±
500lx照度下放置3天，取出，取本品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0064]
溶液光破坏：取3-氨基-6-甲氧基哒供试品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，置4500lx
±
500lx照度下放置1天，取出，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
[0065]
将供试品溶液、对照溶液、降解后的样品分别进样，检测条件如下：色谱柱：atlantis t3柱；流动相：以20mmol/l六氟磷酸钾缓冲液(用磷酸调ph至3.0)为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；进样量5μl。记录结果，结果如下表2所示。
[0066]
表2强制降解试验结果
[0067][0068][0069]
计算公式：
[0070][0071][0072]
总杂(％)＝未知单杂之和(％)+已知杂质之和(％)；
[0073]
其中a
杂质
—供试品溶液中各已知杂质的峰面积；a
对照
—对照溶液峰面积；f—各已知杂质校正因子。
[0074]
结果表明，溶液光破坏条件下有降解杂质生成，但降解杂质并不干扰检测，分离度均符合要求，物料守恒，其他各条件3-氨基-6-甲氧基哒嗪均比较稳定。
[0075]
实施例3检出限和定量限
[0076]
3-氨基-6-甲氧基哒嗪对照品贮备液的配制：精密称取3-氨基-6甲氧基哒嗪对照品约25mg，置50ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，再用水稀释至刻度，摇匀。
[0077]
定量限贮备液的配制：精密量取3-氨基-6-甲氧基哒嗪对照品贮备液1.5ml，其他各杂质贮备液5ml置同一100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
[0078]
定量限溶液的配制：精密量取定量限贮备液1ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
[0079]
检测限溶液的配制：精密量取定量限溶液3ml置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
[0080]
将定量限溶液和检测限溶液分别进样，检测条件如下：色谱柱：atlantis t3柱；流动相：以20mmol/l六氟磷酸钾缓冲液(用磷酸调ph至3.0)为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；进样量5μl。记录结果，如表3所示。
[0081]
表3检出限与定量限结果汇总
[0082]
成分定量限(μg/ml)检出限(μg/ml)检出限s/n杂质a(impuritya)0.1550.04614.1杂质b(impurityb)0.1510.04526.2杂质c(impurityc)0.1550.04612.0杂质d(impurityd)0.1570.0475.7杂质e(impuritye)0.1550.0467.2杂质f(impurityf)0.1450.04411.6杂质g(impurityg)0.1520.0467.73-氨基-6-甲氧基哒嗪0.1500.04513.9
[0083]
从表中数据可知，各成分的定量限和检出限相当于供试品浓度的0.03％和0.009％。检出限和定量限都较低，方法的灵敏度高。
[0084]
实施例4线性范围和校正因子试验
[0085]
线性贮备液的配制：精密量取3-氨基-6-甲氧基哒嗪对照品贮备液1.5ml，其他各杂质贮备液5ml置同一100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
[0086]
线性-200％浓度溶液的配制：精密量取线性贮备液10ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0087]
线性-150％浓度溶液的配制：精密量取线性贮备液7.5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0088]
线性-100％浓度溶液的配制：精密量取线性贮备液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0089]
线性-80％浓度溶液的配制：精密量取线性贮备液4ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0090]
线性-50％浓度溶液的配制：精密量取线性贮备液2.5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0091]
线性-定量限溶液的配制：精密量取线性贮备液1ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0092]
分别由不同实验人员在不同的仪器上进行线性与校正因子试验，检测条件如下：色谱柱：atlantis t3柱；流动相：以20mmol/l六氟磷酸钾缓冲液(用磷酸调ph至3.0)为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；进样量5μl。试验结果如下表4所示。
[0093]
表4线性范围及校正因子试验结果
[0094]
[0095][0096]
结果显示，各杂质在0.03％～0.30％范围内线性关系良好，相关系数r2≥0.999，校正因子在1.09～3.20之间，均可采用加校正因子的自身对照法计算。
[0097]
实施例5准确度试验
[0098]
准确度杂质储备液：精密量取各杂质贮备液5ml置同一100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。
[0099]
定量限准确度溶液：取3-氨基-6-甲氧基哒嗪供试品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，精密加入准确度杂质对照品贮备液1ml，用水稀释至刻度，摇匀。
[0100]
定量限准确度对照溶液：精密量量取定量限准确度溶液2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；再精密量取该溶液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0101]
100％准确度溶液：取3-氨基-6-甲氧基哒嗪供试品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，精密加入准确度杂质对照品贮备液5ml，用水稀释至刻度，摇匀。
[0102]
100％准确度对照溶液：精密量量取100％准确度溶液2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；再精密量取该溶液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0103]
150％准确度溶液：取3-氨基-6-甲氧基哒嗪供试品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，精密加入准确度杂质对照品贮备液7.5ml，用水稀释至刻度，摇匀。
[0104]
150％准确度对照溶液：精密量量取150％准确度溶液2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；再精密量取该溶液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0105]
将样品进样检测，检测条件如下：色谱柱：atlantis t3柱；流动相：以20mmol/l六氟磷酸钾缓冲液(用磷酸调ph至3.0)为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；进样量5μl。通过测得值和理论加入量计算加标回收率，结果如下表5所示。
[0106]
表5加标回收率结果
[0107][0108]
上表结果显示，各杂质在不同浓度水平加标回收率均在94％～106％之间，且回收率rsd均小于5％，该方法准确度高。
[0109]
实施例6重复性和精密度试验
[0110]
由不同实验员配制相当于供试品浓度0.15％的杂质a和杂质b加标溶液作为测试溶液，配制方法如下：
[0111]
重复性(精密度)杂质对照品贮备液：精密量取杂a和杂质b贮备液各5ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0112]
重复性(精密度)溶液：取3-氨基-6-甲氧基哒嗪供试品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，加水超声使溶解，冷却至室温，分别精密加入重复性杂质对照品贮备液5ml，用水稀释至刻度，摇匀，平行配制6份。
[0113]
重复性(精密度)对照溶液：精密量重复性溶液2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，再精密量取该溶液5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。取6份重复性溶液，分别配制对照溶液。
[0114]
分别于不同日期、不同仪器上考察方法的重复性和精密度，检测条件如下：色谱柱：atlantis t3柱；流动相：以20mmol/l六氟磷酸钾缓冲液(用磷酸调ph至3.0)为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；进样量5μl。结果如表6所示。
[0115]
表6重复性与精密度试验结果
[0116][0117]
上表结果显示，两杂质的重复性rsd值分别为1.3％和0.5％，中间精密度rsd值分别为2.3％和1.8％，该方法重复性和精密度都较好。
[0118]
实施例7耐用性试验
[0119]
系统适用性溶液的配制：按照实施例1的配制方式配制系统适用性溶液。
[0120]
供试品溶液：精密称取3-氨基-6-甲氧基哒嗪供试品约25mg，置于50ml量瓶中，加水超声使溶解，再加水至刻度，摇匀；
[0121]
对照溶液：量取上述供试品溶液2ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得溶液i；量取溶液i 5ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。
[0122]
改变色谱条件(柱温、流速、缓冲盐浓度、ph、检测波长、色谱柱)，对系统适用性溶液、供试品溶液和对照溶液进样检测，记录结果，如下表7和表8所示。
[0123]
计算公式：
[0124][0125]
[0126]
总杂(％)＝未知单杂之和(％)+已知杂质之和(％)；
[0127]
其中a
杂质
—供试品溶液中各已知杂质的峰面积；a
对照
—对照溶液峰面积；f—各已知杂质校正因子。
[0128]
表7不同色谱条件下关键峰的分离度
[0129][0130]
表8不同色谱条件下检测结果
[0131][0132]
从上表7和8中的数据可知，色谱条件的微小变化对检测结果几乎无影响，该方法耐用性好。
[0133]
对比实施例1
[0134]
杂质a和杂质b系统适用性溶液的配制：准确称取杂质a、杂质b和3-氨基-6甲氧基哒嗪供试品适量，加水溶解并稀释至含杂质a0.75μg/ml、杂质b 0.3μg/ml、3-氨基-6甲氧基哒嗪0.5mg/ml的混合溶液。
[0135]
将该系统适用性溶液进样检测并记录结果，检测条件如下：色谱柱：xbridge shield rp18柱，3.5μm
×
4.6mm
×
150mm；流动相：以10mmol/l磷酸二氢钾和磷酸氢二钾溶液为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；进样体积：5μl，梯度程序如下：
[0136]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0100010100025752525.011000351000
[0137]
色谱图如图4所示。
[0138]
结果表明在该色谱条件下，杂质b无保留，杂质a和主峰3-氨基-6甲氧基哒嗪分离不佳。
[0139]
对比实施例2
[0140]
杂质a和杂质b系统适用性溶液：准确称取杂质a、杂质b和3-氨基-6甲氧基哒嗪对照品适量，加水溶解并稀释至含杂质a0.75μg/ml、杂质b 0.3μg/ml、3-氨基-6甲氧基哒嗪0.5mg/ml的混合溶液。
[0141]
将该系统适用性溶液进样检测并记录结果，检测条件如下：色谱柱：xbridge shield rp18柱，3.5μm
×
4.6mm
×
150mm；流动相：以20mmol/l六氟磷酸钾溶液(磷酸调节ph至3.0)为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：35℃；检测波长：215nm；进样体积：10μl，梯度程序如下：
[0142]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0100010100025752525.011000351000
[0143]
色谱图如图5所示。
[0144]
结果表明在该色谱条件下，杂质a和主峰3-氨基-6甲氧基哒嗪虽分离良好，但杂质b无保留。
[0145]
对比实施例3
[0146]
系统适用性溶液：按照实施例1配制系统适用性溶液。
[0147]
将该系统适用性溶液进样检测并记录结果，检测条件如下：色谱柱：atlantis t3柱，3μm
×
4.6mm
×
150mm；流动相：以20mmol/l六氟磷酸钾缓冲液(用磷酸调ph至2.7)为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；检测波长：215nm；进样体积：5μl，梯度程序如下：
[0148]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)010005100025752525.011000351000
[0149]
色谱图如图6所示。
[0150]
结果表明，在该色谱条件下，杂质e和杂质f未基线分离。
[0151]
对比实施例4
[0152]
系统适用性溶液：按照实施例1配制系统适用性溶液。
[0153]
将该系统适用性溶液进样检测并记录结果，检测条件如下：色谱柱：atlantis t3柱，3μm
×
4.6mm
×
150mm；流动相：以20mmol/l六氟磷酸钾缓冲液(用磷酸调ph至3.3)为流动相a，以乙腈为流动相b，梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温：37℃；检测波长：215nm；进样体积：5μl，梯度程序如下：
[0154]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0100010100025752525.011000351000
[0155]
色谱图如图7所示。
[0156]
结果表明，在该色谱条件下，杂质c和主峰3-氨基-6-甲氧基哒嗪分离不佳。