一种具有常压激光解析电离和二次光电离的质谱成像装置

1.本发明属于质谱成像技术领域，具体涉及一种结合常压激光解析电离和二次光电离质谱成像装置。


背景技术：

2.质谱成像技术是样品平台在软件程序的控制下按照一定的规律运动，通过质谱直接扫描生物样品成像，根据所测质荷比（m/z）来分析生物分子的空间分布的成像方法。与传统的光学生物成像技术相比，质谱成像技术属于分子信息成像，是研究生物组织及活体动物中分子成像的新型分析技术。与传统的荧光分子成像、免疫标记分子成像技术相比，质谱成像可以在不用标记，无需复杂预处理的条件下实现分子成像，而且可以在同一张组织切片上同时分析数百种生物分子的空间分布特征，还可以与生物组织病理学分析结果对照用于生物病理学研究。目前，质谱成像技术已经广泛应用于蛋白质组，脂质组学以及药物代谢组学等领域，同时也已经在病理学，临床医学以及疾病诊断中展现了巨大的应用潜力。
3.目前，主要的质谱成像技术主要包括基质辅助激光解吸电离（maldi）质谱、解析电喷雾电离（desi）质谱和二次离子电离质谱（sims），这三种技术分别是通过激光、带电的小液滴和离子束将待测物从组织的表面解析电离，都属于直接解析电离的分析方法。一种结合解吸电喷雾电离的光电离质谱成像装置，通过电喷雾针喷出的溶剂解析固体被测物，通过取样毛细管进入到光电离室内，经光源的二次离子化后进入到质谱仪进行分析。但是基于带电液滴的解析电喷雾电离质谱成像技术空间分辨率只能达到200μm，高空间分辨的质谱成像技术对于研究组织微区甚至细胞级别的空间结构具有非常重要的意义。基于激光的质谱成像技术可以实现10-50μm左右的空间分辨，可以满足大部分需求，同时激光解析电离技术是一种比二次离子电离更“软”的离子化技术，因此应用最为广泛。但是，在质谱成像领域，灵敏度与分辨率是相互制约的，在更高的空间分辨条件下，实现同样的灵敏度是极具挑战的。此外，由于生物组织自身复杂的基质环境，即使在基质辅助的情况下，生物组织中内源性化学成分的激光解析电离效率依然小于1/1000。而且，高丰度且离子化效率强的化合物会抑制其他种类化合物的电离。例如，在正离子模式下的，生物组织的maldi质谱图中脂质类化合物主要以磷脂酰胆碱类化合物（pc）为主，而同样含量丰富的糖酯类化合物却很少被测到。
4.2015年，soltwisch等人提出为了提高maldi中难电离化合物的离子化效率，可在氮气冷却的中等压力下（2.0-2.5 mbar），激光解析出的扩散粒子与二次光电离激光交叠，经过二次离子化之后经离子传输系统被飞行时间质谱检测，该方法被成为maldi-2（science）2015, 348 (6231), 211-215。


技术实现要素：

5.为了实现在常压条件下，基于激光解析电离技术结合，光诱导的离子分子反应二次电离，实现生物组织中不同种类化合物高分辨高灵敏成像，本发明提供一种具有常压激
光解析电离和二次光电离质谱的成像装置。
6.一种具有常压激光解析电离和二次光电离的质谱成像装置包括激光解析电离机构，所述激光解析电离机构包括质谱仪、激光器1、扩束镜3、反光镜4、聚焦镜5、载物台6和取样毛细管8；还包括二次光电离机构9和气相掺杂剂引入机构10；所述二次光电离机构包括管状的光电离室95和真空紫外放电灯；所述光电离室95的上端内设有同轴的导流管97，所述导流管97的上端口与质谱仪的传输毛细管98的出口对应，与导流管97外周对应的光电离室95一侧连通着抽真空管96的一端；光电离室95下部一侧连通着取样毛细管8的一端；光电离室95的下端连接着同轴的下盖板91，所述下盖板91的一侧连通着掺杂剂引入管94的出口端；所述真空紫外放电灯包括放电管99、环形负极910和窗片911；所述环形负极910设于放电管99的上端，所述窗片911设于环形负极910中心的通孔处，所述放电管99的下部外圆周上均布设有环形正极凸块93；环形正极凸块93与环形负极910之间的电压差使放电管99内稀有气体放电产生真空紫外光，真空紫外光子通过窗片911进入光电离室95；所述环形负极910外圆围上设有同轴的环状的上盖板92，通过下盖板91和上盖板92固定连接实现光电离室95和放电管99密封连接；放电管99中填充稀有气体，得到不同能量的真空紫外光；所述气相掺杂剂引入机构包括鼓泡罐104、第一导管103和第二导管106；所述鼓泡罐104内设有掺杂剂105；所述第一导管103的一端和第二导管106的一端均插设入鼓泡罐104，且第一导管103的端口插设在掺杂剂105内，第二导管106的端口位于掺杂剂105上方的鼓泡罐104内；第一导管103的另一端连接着进气管101；所述第一导管103上串联着第一流量控制计102，所述第二导管106上串联着第二流量控制计107；工作时，将载有待测样品11的玻片7放置于载物台6上；所述光电离室95温度为250～380 ℃，真空度为2
×
103～5
×
10
4 pa。
7.进一步地技术方案如下：所述光电离室95的内径和导流管97的内径连接处为喇叭状管光滑过渡连接；所述光电离室95的内径和导流管97的外径之间的间距为1-2 mm；光电离室95的内径为4-8 mm；导流管97的内径为1.2-1.6 mm，取样毛细管8内径为0.5-1.5 mm。
8.所述玻片7与取样毛细管8出口之间的距离不大于5mm；取样毛细管8进口与所述窗片911表面的距离小于8mm，掺杂剂引入管94出口与所述窗片911表面的距离也小于8mm；所述激光波长为紫外光、可见光或红外光波段。
9.所述载物台6为导体，玻片7的表面喷涂导电材料氧化铟锡时，正离子模式下选择性施加0v至10kv电压，负离子模式下选择性施加-10kv至0v。
10.所述窗片911材料为氟化镁（mg2f）或氟化锂（lif）。
11.检测时，在所述待测样品11表面喷涂基质以增加激光解析电离效率，所述基质为α-氰基-4-羟基肉桂酸或2,5-二羟基苯甲酸或二氧化钛。
12.所述第一流量控制计102的流量小于第二流量控制计107的流量，通过控制两者的流量差值可调节气相掺杂剂的引入量。
13.所述掺杂剂为甲苯、丙酮、苯甲醚、氯苯、溴苯、二硫化碳中的一种。
14.所述稀有气体为氦气、氖气、氪气、氙气、氮气中一种。
15.本发明的有益技术效果体现在以下方面：1. 本发明与结合解吸电喷雾电离的光电离质谱成像装置相比：（1）掺杂剂通过掺杂剂鼓泡系统以气相形式直接引入光电离室，更加高效、稳定；（2）在解吸电喷雾电离的光电离质谱成像装置中，电喷雾针出口端与取样毛细管之间的水平距离为10～40mm，然而本发明取样口距离激光解析位点小于2mm，取样效率高；（3）解吸电喷雾电离的光电离质谱成像装置需要用高速雾化气从雾化器中喷出以雾化溶剂，在高速雾化气吹扫下取样毛细管入口处温度会显著降低，影响取样效率，而本发明不存在上述问题；（4）解吸电喷雾电离的光电离质谱成像技术的成像空间分辨率仅可达到200μm，如图6所示，本发明可实现≤20μm空间分辨的质谱成像。
16.2．本发明与maldi-2相比：（1） maldi-2是一种真空里的解析电离技术，更换样品时需将样品从真空中取出，而本发明是常压激光解析，操作更加方便；（2）虽然maldi-2与本发明都采用紫外光作为二次电离方式，但是maldi-2是利用光致直接电离，本发明是利用光致诱导的离子分子反应和光致直接电离的总和实现二次电离，离子分子反应可显著提高光电离效率，这在之前的文献中已有报道（anal. chim. acta, 2015, 891, 203-210）；（3）二次电离室在本发明（2
×
102～5
×
104pa）可实现比maldi-2（2.0-2.5 mbar）更高的真空度，根据理想气体状态方程pv=nrt,相同温度，相同体积空间内，真空度p越高，待测分子物质的量n越大，即待测分子体积密度越大，可电离得到更高密度的待测离子。
附图说明
17.图1为本发明结构示意图。
18.图2为图1的局部放大图。
19.图3为图1的二次光电离机构剖视放大图。
20.图4为图1的气相掺杂剂引入机构剖视放大图。
21.图5为红色水彩笔涂在玻片上，经常压激光解析电离和常压激光解析电离-二次光电离质谱分析得到的正离子模式质谱图，其中图5中a为常压激光解析电离图，图5中b为常压激光解析电离-二次光电离质谱分析红色水彩笔中罗丹明6g的质谱图。
22.图6为利用本发明中常压激光解析电离和常压激光解析电离-二次光电离质谱分析得到的小鼠小脑组织胆固醇(m/z 369)的分布图。
23.图1-4中序号：激光器1、激光2、扩束镜3、反光镜4、聚焦镜5、载物台6、玻片7、取样毛细管8、二次光电离机构9、气相掺杂剂引入机构10、待测样品11、下盖板91、上盖板92、环形正极凸块93、放电管99、环形负极910、窗片911、掺杂剂引入管94、光电离室95、抽真空管96、导流管97、质谱传输毛细管98、进气管101、第一流量控制计102、第一导管103、鼓泡罐104、掺杂剂105、第二导管106、第二流量控制计107。
具体实施方式
24.下面结合附图，通过实施例对本发明作进一步地描述。
实施例
25.参见图1，一种具有常压激光解析电离和二次光电离的质谱成像装置包括激光解析电离机构；激光解析电离机构包括质谱仪、激光器1、扩束镜3、反光镜4、聚焦镜5、载物台6和取样毛细管8；还包括二次光电离机构和气相掺杂剂引入机构。
26.参见图2，激光器1输出的349nm紫外光先经扩束镜3扩束的激光2，经反光镜4反射，然后，通过聚焦镜5聚焦至生物组织11的背侧。玻片7选用喷涂导电氧化铟锡材料的石英玻片，90%以上349nm紫外光可穿过该玻片7。载物台6为导电材料，加上5kv电压，待测样品11表面距离取样毛细管8的取样口之间的间距1mm，待测样品11为生物组织切片时，其厚度为10μm。
27.参见图3，二次光电离机构包括管状的光电离室95和真空紫外放电灯。
28.光电离室95的上端内设有同轴的导流管97，光电离室95的内径和导流管97的内径连接处为喇叭管状光滑过渡连接。导流管97的上端口与质谱仪的传输毛细管98的出口对应，与导流管97外周对应的光电离室95一侧连通着抽真空管96的一端；光电离室95下部一侧连通着取样毛细管8的一端；光电离室95的下端连接着同轴的下盖板91，下盖板91的一侧连通着掺杂剂引入管94的出口端。
29.真空紫外放电灯包括放电管99、环形负极910和窗片911；所述环形负极910设于放电管99的上端，所述窗片911设于环形负极910中心的通孔处，所述放电管99的下部外圆周上均布设有环形正极凸块93；环形正极凸块93与环形负极910之间的电压差使放电管99内稀有气体放电产生真空紫外光，真空紫外光子通过窗片911进入光电离室95；所述环形负极910外圆围上设有同轴的环状的上盖板92，通过下盖板91和上盖板92固定连接实现光电离室95和放电管99密封连接。放电管99中填充稀有气体氦气。
30.光电离室95的内径和导流管97的外径之间的间距为1.2 mm；光电离室95的内径为5 mm；导流管97的内径为1.6 mm，取样毛细管8内径为1.5 mm。
31.取样毛细管8出口与窗片911之间的距离1.5 mm，掺杂剂引入管94的出口与窗片911之间的距离为1 mm。
32.参见图4，气相掺杂剂引入机构包括鼓泡罐104、第一导管103和第二导管106；所述鼓泡罐104内设有掺杂剂105。
33.第一导管103的一端和第二导管106的一端均插设入鼓泡罐104，且第一导管103的端口插设在掺杂剂105内，第二导管106的端口位于掺杂剂105上方的鼓泡罐104内；第一导管103的另一端连接着进气管101；第一导管103上串联着第一流量控制计102，所述第二导管106上串联着第二流量控制计107。掺杂剂105为甲苯。
34.参见图4，通过第一导管103引入气体在鼓泡罐104内鼓泡使液态的掺杂剂甲苯挥发成气体进入到第二导管106内，进而使掺杂剂能够经掺杂剂引入管94进入到光电离室95内与待测物反应促进离子化，掺杂剂引入管94处于取样毛细管8与光源之间，从而确保样品能够在掺杂剂甲苯的辅助下进行离子化。第二流量控制计107的流速比第一流量控制计102的流速大8ml/min。
35.本发明的工作原理详细说明如下：待测样品11在聚焦的激光光斑作用下，从玻片7表面解析，解析出的化学物质离子化效率小于0.1%，带电离子和中性分子在真空抽吸作用下，同时从取样毛细管8进入光电离
室95。在低于大气压的压力氛围下，未离子化的中性分子可在掺杂剂甲苯的辅助下，继续被从真空紫外灯窗片911发射出的真空紫外光二次电离，二次电离产生的离子与激光解析产生的带电离子一起通过导流管97和质谱传输毛细管98进入质谱仪被检测。
36.参见图5，将红色水彩笔涂覆在玻片7上，在常压激光解析电离和常压激光解析-二次光电离两种模式下分析得到的质谱分析结果。与常压激光解析电离模式相比，激光解析电离-二次光电离模式下，环形正极凸块93与环形负极910之间施加1500v起伏电压以点亮真空紫外放电灯，同时打开气相掺杂剂引入机构的第一流量控制计102和第二流量控制计107，引入掺杂剂甲苯。如图5中a所示，在传统的常压激光解析电离质谱图中，红色水彩笔中罗丹明6g（[m-cl]
+
，m/z 443）的信号只有180；但是，在二次光电离辅助下的常压激光解析-二次光电离质谱图中（图5中b），罗丹明6g（[m-cl]
+
，m/z 443）的信号达到了180000，以该物质为例说明，二次光电离可将待测样品11信号提高三个量级。
[0037]
参见图6，二次光电离对待测物在待测样品11表面的空间可视化分析也有显著的影响，以胆固醇（m/z 369）在小鼠小脑组织成像结果为例，该成像图单像素点尺寸为20μm
×
20μm，该空间分辨率远远优于解吸电喷雾电离的光电离质谱成像分辨率（约200μm）。此外，常压激光解析电离-二次光电离质谱成像（y轴1.7-3.5mm），与传统的常压激光解析电离质谱成像（y轴0-1.7mm）相比，位于m/z 369处的胆固醇（[m+h-h2o]
+
）信号显著提高，该实验证明，二次光电离增强待测样品11表面的待测物信号后，待测物在待测样品11表面空间分布的精细结构也更加清晰，成像质量显著提高。
[0038]
本领域的技术人员容易理解，以上实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。