本发明属于质谱检测领域，涉及基于液质联用技术的血浆或血清蛋白质定量分析方法，具体涉及基于高效液相色谱-质谱联用法的人类生物样本中蛋白质 apoa-i，apoa-iv，apoe，co3，itih4，ndrg2，cof2，catb和/或acap1 蛋白的定量分析方法。
背景技术：
：：1、蛋白质组学研究是后基因组时代的核心内容之一，蛋白质组学是从整体的角度分析细胞内蛋白质的组成成分、表达水平以及修饰状态，进而了解蛋白质之间的相互作用与联系，达到揭示蛋白质功能与生命活动规律的目的。2、作为蛋白质组学重要分支的之一的血浆或血清蛋白质组学，是通过分离技术获得特定人群的血浆或血清蛋白质，在蛋白质表达图谱的基础上，寻找与健康人群存在的差异蛋白质点或蛋白质峰，然后再通过鉴定技术确定差异蛋白，进而研究其结构和功能。3、目前临床检验及科学研究中检测血液中蛋白质最常用的方法为酶联免疫吸附法(elisa)。但该方法一次只能检测单个蛋白质，且存在特异性不高和测量误差偏大等缺点。基于质谱的选择性反应监测(srm)或称为多反应监测(mrm)测定，且在本文中称作srm/mrm，一直以来就是定量的黄金标准。srm/mrm蛋白定量方法利用蛋白专属的肽段序列完成定量分析，特异性高，一次实验可同时检测几十到上百种蛋白质，通量高，重现性好。并且，该方法通过加入稳定同位素标记内标肽段(stable isotope-labeled internal standards，sis)，可以大大降低离子抑制、基质效应和样品前处理过程的误差造成的影响，可得到更准确的定量结果。另一方面，平行反应监测(prm)是目前靶向蛋白质组学数据采集的常用方法，通过对特异性肽段或目标肽段(如发生翻译后修饰的肽段)进行选择性检测，从而实现对目标蛋白质/修饰肽段的靶向相对或绝对定量。选择离子监测(sim) 可选定的离子进行检测，以消除样品中其他组分造成的干扰，相较于其它检测模式而言，操作相对简单，提高对特征离子的检测灵敏度和定量分析的准确性。4、可使用该srm、mrm、sim或prm测定来测量来自apoa-i，apoa-iv，apoe，co3，itih4，ndrg2，cof2，catb和/或acap1蛋白质的一种或多种特异性肽的相对或绝对定量水平，并由此提供通过质谱测量在从生物样品中获得的给定蛋白质制备物中上述蛋白质含量的方法。技术实现思路1、本发明的目的是提供一种血浆中多种蛋白质的定量分析方法。利用所述蛋白的特征肽段及其对应的同位素标记肽段作为内标物，实现同时检测与定量血浆中 apoa-i，apoa-iv，apoe，co3，itih4，ndrg2，cof2，catb和/或acap1 的含量。2、本发明所述的测定来自上述9种蛋白质的特定未修饰的肽的相对或绝对水平并且可测定来自上述蛋白质的特定修饰的肽的绝对或相对水平。修饰包括可能在这些肽上存在的磷酸化氨基酸残基、糖基化氨基酸残基以及其它可能的翻译后修饰。3、为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，根据本发明的一个方面，本发明提供了蛋白质和对应的特征肽段序列，其中，所述的蛋白质和对应的多肽序列包括表1所示内容。4、表格1蛋白质和对应的多肽序列5、
蛋白质
序列编号
特征多肽序列
同位素标记特征多肽序列
apoa-i
1
atehlstlsek
atehlstlsek*
apoa-i
2
lsplgeemr
lsplgeemr*
apoa-i
3
thlapysdelr
thlapysdelr*
apoa-iv
4
lgevntyagdlqk
lgevntyagdlqk*
apoa-iv
5
llphanevsqk
llphanevsqk*
apoa-iv
6
isasaeelr
isasaeelr*
apoe
7
lgplveqgr
lgplveqgr*
apoe
8
lavyqagar
lavyqagar*
apoe
9
seleeqltpvaeetr
seleeqltpvaeetr*
co3
10
tglqevevk
tglqevevk*
co3
11
sgipivtspyqihftk
sgipivtspyqihftk*
co3
12
sgsdevqvgqqr
sgsdevqvgqqr*
itih4
13
speqqetvldgnliir
speqqetvldgnliir*
itih4
14
etlfsvmpglk
etlfsvmpglk*
itih4
15
laldngglar
laldngglar*
ndrg2
16
ldptqtsflk
ldptqtsflk*
ndrg2
17
rpailtyhdvglnyk
rpailtyhdvglnyk*
cof2
18
masgvtvndevik
masgvtvndevik*
catb
19
hygynsysvsnsek
hygynsysvsnsek*
acap1
20
elggeepepslr
elggeepepslr*
6、在本发明的第一方面，提供了一种检测方法，包括在同时检测血浆中apoa-i，apoa-iv，apoe，co3，itih4，ndrg2，cof2，catb和/或acap1时，将表 1所述特征肽段对应的同位素标记肽段作为内标物。7、进一步地，所述的检测方法，包括：8、(1)配制同位素标记肽段内标液；9、(2)利用替代基质配制所述特征肽段的校正标样；10、(3)取待测样品，依次用二硫苏糖醇、碘乙酰胺、胰蛋白酶进行处理，加入同位素标记肽段内标液，除盐，真空离心浓缩干燥，复溶，得待测样品溶液；11、取所述校正标样，加入同位素标记肽段内标液，用液相色谱质谱联用仪器进行分析，记录所述特征肽段的峰面积以及对应的同位素标记肽段的峰面积并计算峰面积之比，建立以特征肽段与内标峰面积之比为纵坐标与浓度为横坐标的校正曲线；12、将所述待测样品溶液用液相色谱质谱联用仪器进行分析，记录所述特征肽段的峰面积以及对应的同位素标记肽段的峰面积，将峰面积之比代入校正曲线，计算特征肽段的含量，进一步计算apoa-i，apoa-iv，apoe，co3，itih4，ndrg2， cof2，catb和/或acap1的含量。13、进一步地，所述的检测方法，还包括：14、利用替代基质配制所述特征肽段的质控样品，向质控样品中加入同位素标记肽段内标液，用液相色谱质谱联用仪器进行分析，记录所述特征肽段的峰面积以及对应的同位素标记肽段的峰面积，将峰面积之比代入标准曲线，计算质控样品回收率值。15、进一步地，所述的检测方法，所述替代基质的制备方法包括：16、取牛清白蛋白，依次用二硫苏糖醇溶液、碘乙酰胺溶液和胰蛋白酶进行处理，除盐，真空离心浓缩干燥，复溶，得替代基质。17、进一步地，所述的检测方法，液相色谱质谱联用仪器为lc-ms/ms；18、质谱条件包括：离子源为电喷雾离子源，正离子方式检测，扫描方式为多重反应监测。19、(1)色谱条件：采用反相高效液相色谱柱作为液相色谱分析色谱柱；采用柱长为5mm-250mm的c18色谱柱；流动相a为水溶液，流动相b为乙腈溶液，流动相比例：a+b＝100％，分析时间为5-60min，在分析时间内从0-20％的流动相 b梯度洗脱至20-70％的流动相b；流动相添加剂为0.1％-1％甲酸；流速为 0.1-1.0ml/min；色谱柱温为10-60℃；进样体积为1-20μl。20、优选，上述特征肽段的色谱分析条件，所述的反相高效液相色谱柱，其柱长优选50-200mm，流动相a为水溶液，流动相b为乙腈溶液，流动相比例：a+b＝100％，分析时间为5-40min，在分析时间内从2-15％的流动相b梯度洗脱至22-60％的流动相b；流动相添加剂为0.1％-0.5％甲酸；流速：0.1-0.8ml/min；色谱柱温：10-50℃。21、更优选，上述特征肽的色谱分析条件，所述的反相高效液相色谱柱，其柱长优选50-150mm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，流动相a为水溶液，流动相b 为甲醇溶液，流动相比例：a+b＝100％，分析时间为8-30min，在分析时间内从 5-10％的流动相b梯度洗脱至20-50％的流动相b，流动相添加剂为0.1％甲酸，流速0.1-0.5ml/min。22、最优选，上述特征肽的色谱分析条件，所述的反相高效液相色谱柱优选watersxbridge c18(2.1*100mm，1.9μm)色谱柱，流动相a为水溶液，流动相b为乙腈溶液，流动相比例：a+b＝100％，分析时间为8-15min，在分析时间内从5-8％的流动相b梯度洗脱至25-40％的流动相b，流动相添加剂为0.1％甲酸，流速0.2-0.4 ml/min。23、(2)质谱条件包括：采用电喷雾离子源，正离子检测模式；干燥气温度： 150-350℃；干燥气流速：5-20l/min；喷雾气流速：10-50psi；鞘气温度：250-400℃；鞘气流速：5-20l/min；喷雾电压：2500-5000v；毛细管温度：150-320℃。24、内标液，其由与权利要求1中所述特征肽段对应的同位素标记肽段配制得到；25、校正标样，其由替代基质和所述特征肽段配制得到；26、本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。27、有益技术效果：28、1、发明提供了高通量检测血清或者血浆中9种蛋白质的液质分析方法，与现有方法比较具有更好的技术效果，例如检测特异性、检测效率、检测成本、临床应用。29、2、发明提供了一种血清或者血浆中9种蛋白质新分析策略，通过检测这些蛋白的特异性肽段，实现蛋白检测。30、3、发明为与这9种蛋白质变化相关的疾病早期筛查、临床诊断和治疗评价提供了方法，具有潜在临床转化应用价值，例如阿尔兹海默症、高血脂、糖尿病、冠心病等疾病。当前第1页12当前第1页12