一种增强免疫组化Ki-67抗体试剂的制备及其应用的制作方法

一种增强免疫组化ki-67抗体试剂的制备及其应用
技术领域
1.本发明涉及免疫组化抗体试剂领域，具体涉及一种增强免疫组化ki-67抗体试剂的制备及其应用。


背景技术：

2.免疫组织化学染色技术是依据抗体能特异性识别抗原的生物学特性，利用特异性强的抗体（或称一抗）来识别组织切片上特殊蛋白（抗原），再用通用酶标记二抗及显色剂将抗原显示出来，并对其进行定位、定性及定量分析，此过程可简称为免疫组化。
3.从免疫组化技术上看，要做好免疫组化试验，就需要好的抗体，有了好的抗体才能够将抗原蛋白有效地显示出来，以此临床病理诊断才能获得有效的检验依据。目前，临床病理免疫组化所用的抗体大多数已经是重组兔单克隆抗体，兔单克隆抗体的优点是特异性高、灵敏度好、染色背景低等，缺点是生产工艺复杂，抗体研发费用高，因此兔单抗的价格较高。
4.ki-67也称为mki67，编码人类ki-67蛋白的基因是mki67。ki-67是一种与细胞增殖相关的核蛋白，与核糖体rna转录相关。在细胞周期的g1，s，g2和m期均有表达，ki-67蛋白在m期位于染色体表面，间期时限于细胞核内。休眠(g0)细胞不表达ki-67。ki-67做为一个优秀的细胞增殖标志物，能够很好地评估某一细胞群生长（增殖）比例，ki-67阳性肿瘤细胞（ki-67标记指数）常与前列腺癌、脑瘤、乳腺癌和神经母细胞瘤等肿瘤患者的生存期和复发风险强相关。
5.总而言之，传统的抗体试剂需要进行二次标记，且成本较高，不能快速免疫组化，不易解决冰冻切片免疫组化染色的实效性问题。


技术实现要素：

6.基于上述现有的传统的抗体试剂需要进行二次标记，且成本较高，不能快速免疫组化，不易解决冰冻切片免疫组化染色的实效性的问题，并为解决上述现有的传统的抗体试剂需要进行二次标记，且成本较高，不能快速免疫组化，不易解决冰冻切片免疫组化染色的实效性的问题，本发明提供一种高自由度万向剃须刀及其剃须单元浮动机构，以使针对上述现有的剃须刀需要手动调整剃须单元与皮肤之间的距离，剃须单元与皮肤之间的自适应能力不强，较为费力，剃须体验感较差的技术问题提出如下技术方案：本发明提供一种增强免疫组化ki-67抗体试剂的制备及其应用，它包括纳米金颗粒、ki-67抗体脱杂蛋白（bsa）、信息抗体、纳米金的抗体标记以及抗体试剂，其中纳米金颗粒的制备包括以下步骤：1）取1ml氯金酸溶液（1%）加入到100ml纯水中；2）在100℃水浴中加热5min，溶液沸腾时立即加入4ml柠檬酸水溶液；3）对其充分搅拌，使其溶液慢慢变色，由黄到浅红，变深红后再继续加热老化15min；
4）取出放置于室温冷却；5）制得粒径约为20nm的纳米金颗粒。
7.进一步地，所述ki-67抗体脱杂蛋白（bsa）的预处理包括以下步骤：1）配制12%（w/v）peg6000溶液：称取6gpeg6000，用超纯水溶解，定容至50ml即可。
8.2）取1ml 12%peg6000溶液，加入30ul ki-67抗体试剂（一抗浓缩液，非工作液）。
9.3）混匀后，室温静置30min。或4℃静置10min。
10.4）离心15000rpm*5min，移去上清液，取沉淀。
11.5）沉淀的抗体，用100ulpbs重新悬浮溶解，备用。
12.进一步地，若干所述信号抗体搭载于纳米金颗粒，信号抗体为正常兔的igg，并经免疫组化检测为阴性反应。
13.进一步地，所述纳米金颗粒的抗体标记，进行抗体混合：信号抗体（兔igg）以及一抗ki-67质量比为10:1；其中一抗ki-67的原始浓度为0.03mg/ml； 信号抗体（兔igg）的原始浓度为1mg/ml，加入30ul信号抗体以及100ul一抗。
14.进一步地，所述纳米金颗粒的抗体标记包括abs-gnps复合物的制备，制备包括以下步骤：1）取一支1.5ml离心管，加入1ml 纳米金溶液（20nm）。注：纳米金浓度为0.1mg/ml。
15.2）加入适量25mm k2co3调ph至9.0。
16.3）在缓慢搅拌下，取抗体混合液（abs：ki-67+兔igg）100ul，加入1ml 纳米金溶液中，混合液在室温下静置反应2小时。
17.4）加入0.2ml的5%bsa，再放置30min。
18.5）加入10ul 2%peg20000，室温放置5min，存放4℃，备用。
19.进一步地，所述抗体试剂配制取abs-gnps复合物，用含有0.2%peg20000抗体稀释液依据一定比例进行稀释，配制的抗体工作即为ki-67抗体试剂。
20.本发明提供的一种增强免疫组化ki-67抗体试剂的一目的在于提供一种纳米金增强免疫组化ki-67抗体试剂（免疫组化），其制备流程包括纳米金制备、ki-67抗体脱杂蛋白（bsa）、信号抗体处理、纳米金的抗体标记、抗体试剂配制等过程；其特点是以纳米金颗粒为载体，依据纳米金颗粒的吸附性在标记一抗的同时标记信号抗体，不需要进行二次标记。
21.本发明提供的一种增强免疫组化ki-67抗体试剂的另一目的在于提供一种纳米金增强免疫组化ki-67抗体试剂（免疫组化），其特征在于，利用abs-gnps复合物，依据免疫组化临床检测要求，配制成ki-67抗体试剂（工作液），即取abs-gnps复合物，用含有0.2%peg20000的抗体稀释液依据一定比例进行稀释，配制的抗体工作液即为ki-67抗体试剂。
22.本发明提供的一种增强免疫组化ki-67抗体试剂的另一目的在于纳米金增强免疫组化ki-67抗体试剂（免疫组化）进行组织切片的ihc染色验证，验证结果显示本发明的ki-67抗体试剂对组织切片染色明显增强，预期可以增强3-5倍。
附图说明
23.图1为本发明提出的一种增强免疫组化ki-67抗体试剂的ihc（扁桃体）染色，染色效果较常规相比增强3倍左右；图2为本发明提出的一种增强免疫组化ki-67抗体试剂的ihc（扁桃体）染色，染色
效果较常规相比增强5倍左右；图3为本发明提出的一种增强免疫组化ki-67抗体试剂的ihc（扁桃体）染色，染色效果较常规相比增强3倍左右；图4为本发明中用作阳性对照的常规ki-67ihc（扁桃体）染色。
具体实施方式
24.下面结合图1至图4以及具体实施方式对本发明作进一步的描述。
25.以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的配制手段。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
26.本发明提供一种增强免疫组化ki-67抗体试剂的制备及其应用，它包括纳米金颗粒、ki-67抗体脱杂蛋白（bsa）、信息抗体、纳米金的抗体标记以及抗体试剂，其中纳米金颗粒的制备包括以下步骤：1）取1ml氯金酸溶液（1%）加入到100ml纯水中；2）在100℃水浴中加热5min，溶液沸腾时立即加入4ml柠檬酸水溶液；3）对其充分搅拌，使其溶液慢慢变色，由黄到浅红，变深红后再继续加热老化15min；4）取出放置于室温冷却；5）制得粒径约为20nm的纳米金颗粒。
27.进一步地，所述ki-67抗体脱杂蛋白（bsa）的预处理包括以下步骤：1）配制12%（w/v）peg6000溶液：称取6gpeg6000，用超纯水溶解，定容至50ml即可。
28.2）取1ml 12%peg6000溶液，加入30ul ki-67抗体试剂（一抗浓缩液，非工作液）。
29.3）混匀后，室温静置30min。或4℃静置10min。
30.4）离心15000rpm*5min，移去上清液，取沉淀。
31.5）沉淀的抗体，用100ulpbs重新悬浮溶解，备用。
32.进一步地，若干所述信号抗体搭载于纳米金颗粒，信号抗体为正常兔的igg，并经免疫组化检测为阴性反应。
33.进一步地，所述纳米金颗粒的抗体标记，进行抗体混合：信号抗体（兔igg）以及一抗ki-67质量比为10:1；其中一抗ki-67的原始浓度为0.03mg/ml； 信号抗体（兔igg）的原始浓度为1mg/ml，加入30ul信号抗体以及100ul一抗。
34.进一步地，所述纳米金颗粒的抗体标记包括abs-gnps复合物的制备，制备包括以下步骤：1）取一支1.5ml离心管，加入1ml 纳米金溶液（20nm）。注：纳米金浓度为0.1mg/ml。
35.2）加入适量25mm k2co3调ph至9.0。
36.3）在缓慢搅拌下，取抗体混合液（abs：ki-67+兔igg）100ul，加入1ml 纳米金溶液中，混合液在室温下静置反应2小时。
37.4）加入0.2ml的5%bsa，再放置30min。
38.5）加入10ul 2%peg20000，室温放置5min，存放4℃，备用。
39.进一步地，所述抗体试剂配制取abs-gnps复合物，用含有0.2%peg20000抗体稀释液依据一定比例进行稀释，配制的抗体工作即为ki-67抗体试剂。
40.具体而言：本发明为纳米金颗粒增强免疫组化ki-67抗体，是通过附加信号抗体来实现的，特异抗体与信号抗体的加入比例将决定信号放大倍数，其比例1:2
‑‑
1:10均可以获得放大的信号。在以下技术方案中实施例1选用特异抗体:信号抗体比为1:5，约可获得3倍的信号放大；实施例2选用特异抗体:信号抗体为1:10，约可获得5倍的信号放大。
41.实施例1本发明实施例1提供一种增强免疫组化ki-67抗体试剂（免疫组化）制备的技术方案，及其制备流程包括：纳米金制备、ki-67抗体脱杂蛋白（bsa）、信号抗体处理、纳米金的抗体标记、抗体试剂配制等过程。
42.1.纳米金颗粒的制备：取1ml氯金酸溶液（1%）加入到100ml纯水中，在100℃水浴中加热5min，溶液沸腾时立即加入4ml柠檬酸水溶液，充分搅拌，使其溶液慢慢变色，由黄到浅红，变深红后再继续加热老化15min，取出放置于室温冷却，即可制得粒径约为20nm的纳米金颗粒。保存于冰箱待用。
43.2.ki-67抗体脱杂蛋白（bsa）的预处理：（1）预处理目的：商品化的ki-67抗体试剂（免疫组化法）是免疫组织化学中常用的一抗，往往加入一定浓度的bsa作为抗体的稳定剂，其含量约为1%，是特异性抗体（兔单抗）的50-66倍，为防止其干扰后续实验，需要将bsa进行去除。
44.（2）预处理方法：peg沉淀法第一步：配制12%（w/v）peg6000溶液：称取6gpeg6000，用超纯水溶解，定容至50ml即可。
45.第二步：取1ml 12%peg6000溶液，加入30ul ki-67抗体试剂（一抗浓缩液，非工作液）。
46.第三步：混匀后，室温静置30min。或4℃静置10min。
47.第四步：离心15000rpm*5min，移去上清液，取沉淀。
48.第五步：沉淀的抗体，用100ulpbs重新悬浮溶解，备用。
49.3.信号抗体：为了增强ki-67抗体试剂的免疫组化染色效果，需要在纳米金颗粒搭载更多的信号抗体，即可放大ki-67抗体的信号，信号抗体为正常兔的igg，并经免疫组化检测为阴性反应。
50.4.抗体标记纳米金颗粒：（1）抗体混合：混合比例为信号抗体（兔igg）:一抗（ki-67）质量比=5:1，其中一抗（ki-67）:原始浓度为0.03mg/ml；信号抗体（兔igg）：原始浓度为1mg/ml； 抗体混合（质量比5：1）：30ul信号抗体+200ul一抗。
51.（2）标记抗体：abs-gnps复合物的制备为第一步：取一支1.5ml离心管，加入1ml 纳米金溶液（20nm）。注：纳米金浓度为0.1mg/ml。
52.第二步：加入适量25mm k2co3调ph至9.0。
53.第三步：在缓慢搅拌下，取抗体混合液（abs：ki-67+兔igg）100ul，加入1ml 纳米金
溶液中，混合液在室温下静置反应2小时。
54.第四步：加入0.2ml的5%bsa，再放置30min。
55.第五步：加入10ul 2%peg20000，室温放置5min，存放4℃，备用。
56.此时，abs-gnps复合物中纳米金颗粒上同时可以标记上ki-67抗体（一抗）和多个兔igg（信号抗体），依据纳米金颗粒上标记兔igg与ki-67抗体的比例，即为一抗ki-67信号放大的比例。
57.5.ki-67抗体试剂配制：免疫组化临床检测使用的一抗多数是已经预配制的工作液，直接使用，不需要复配。即取abs-gnps复合物，用含有0.2%peg20000抗体稀释液依据一定比例进行稀释，配制的抗体工作即为ki-67抗体试剂。
58.参照图1，实施例1利用纳米金增强免疫组化ki-67抗体试剂以1：500的稀释比在扁桃体组织上进行ihc染色，其实验结果显示，大部分b细胞呈现强阳性反应，且部分阳性亮度很强，只有小部分b细胞显示中至高等强度的着色。
59.参照图4，正常的ki-67抗体在扁桃体上进行免疫组化反应的染色效果显示，生发中心的b细胞暗区，也可以呈中等至强阳性反应；而生发中心b细胞则显示弱至中等强度的着色。
60.综上对比所得，实施例1中，纳米金增强后ki-67抗体的信号放大强度可达到3倍左右。
61.实施例2本发明实施例2提供一种增强免疫组化ki-67抗体试剂（免疫组化）制备的技术方案，及其制备流程包括：制备流程包括纳米金制备、ki-67抗体脱杂蛋白（bsa）、信号抗体处理、纳米金的抗体标记、抗体试剂配制等过程。
62.1.纳米金颗粒的制备：取1ml氯金酸溶液（1%）加入到100ml纯水中，在100℃水浴中加热5min，溶液沸腾时立即加入4ml柠檬酸水溶液，充分搅拌，使其溶液慢慢变色，由黄到浅红，变深红后再继续加热老化15min，取出放置于室温冷却，即可制得粒径约为20nm的纳米金颗粒。保存于冰箱待用。
63.2.ki-67抗体脱杂蛋白（bsa）的预处理：（1）预处理目的：商品化的ki-67抗体试剂（免疫组化法）是免疫组织化学中常用的一抗，往往加入一定浓度的bsa作为抗体的稳定剂，其含量约为1%，是特异性抗体（兔单抗）的50-66倍，防止干扰后续的实验，需要将bsa进行去除。
64.（2）预处理方法：peg沉淀法第一步：配制12%（w/v）peg6000溶液：称取6gpeg6000，用超纯水溶解，定容至50ml即可。
65.第二步：取1ml 12%peg6000溶液，加入30ul ki-67抗体试剂（一抗浓缩液，非工作液）。
66.第三步：混匀后，室温静置30min。或4℃静置10min。
67.第四步：离心15000rpm*5min，移去上清液，取沉淀。
68.第五步：沉淀的抗体，用100ulpbs重新悬浮溶解，备用。
69.3.信号抗体：为了增强ki-67抗体试剂的免疫组化染色效果，需要在纳米金颗粒搭载更多的信号抗体，即可放大ki-67抗体的信号，信号抗体为正常兔的igg，并经免疫组化检
测为阴性反应。
70.4.抗体标记纳米金颗粒：（1）抗体混合：混合比例为信号抗体（兔igg）:一抗（ki-67）质量比=10:1，其中一抗（ki-67）的原始浓度为0.03mg/ml；信号抗体（兔igg）的原始浓度为1mg/ml；抗体混合的信号抗体以及一抗的含量为信号抗体30ul，一抗100ul。
71.（2）标记抗体：abs-gnps复合物的制备第一步：取一支1.5ml离心管，加入1ml 纳米金溶液（20nm）。注：纳米金浓度为0.1mg/ml。
72.第二步：加入适量25mm k2co3调ph至9.0。
73.第三步：在缓慢搅拌下，取抗体混合液（abs：ki-67+兔igg）100ul，加入1ml 纳米金溶液中，混合液在室温下静置反应2小时。
74.第四步：加入0.2ml的5%bsa，再放置30min。
75.第五步：加入10ul 2%peg20000，室温放置5min，存放4℃，备用。
76.此时，abs-gnps复合物中纳米金颗粒上同时可以标记上ki-67抗体（一抗）和多个兔igg（信号抗体），依据纳米金颗粒上标记兔igg与ki-67抗体的比例，即为一抗ki-67信号放大的比例。
77.5.ki-67抗体试剂配制：免疫组化临床检测使用的一抗多数是已经预配制的工作液，直接使用，不需要复配。即取abs-gnps复合物，用含有0.2%peg20000抗体稀释液依据一定比例进行稀释，配制的抗体工作即为ki-67抗体试剂。
78.参照图2，实施例2利用1：500的纳米金增强免疫组化ki-67抗体试剂在扁桃体组织上进行ihc染色，结果显示，生发中心的大部分b细胞及其暗区均呈现强阳性反应，且大部分阳性亮度极强，只有极小部分b细胞显示中至高等强度的着色。
79.参照图4，正常的ki-67抗体在扁桃体上进行免疫组化反应的染色效果显示，生发中心的b细胞暗区，也可以呈中等至强阳性反应；而生发中心b细胞则显示弱至中等强度的着色。
80.综上对比所得，实施例2的实验结果满足理论意义上信号可放大5倍左右的概念。
81.实施例3：ki-67抗体试剂染色效果的增强作用将石蜡组织切片置于75℃烤片30分钟。将切片依次浸入环保脱蜡剂中，共2次每次30分钟，依次浸入无水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、去离子水，每次复水5分钟。将石蜡切片置于预先加热至75℃的脱蜡修复复合液（ph9 .0）中，继续加热至微沸状态，维持20分钟，待降温至室温后将切片取出。漂洗后，用阻断剂（3%过氧化氢溶液）阻断内源性过氧化物酶，在室温下孵育阻断10分钟。加100ul 5％的山羊血清封闭组织30分钟以封闭非特异性结合。
82.加入100μl纳米金增强的ki-67抗体试剂，室温避光孵育30分钟，反应结束后用pbs-t溶液漂洗3次，每次3分钟。再加酶标二抗（多聚辣根过氧化物酶标的羊抗鼠/兔igg）100ul，室温避光孵育30分钟，反应后用pbs-t溶液漂洗切片3次，每次3分钟。加dab显色液100ul，室温避光孵育10分钟显色。显色结束后，用苏木素复染5分钟，洗去苏木素后在10%盐酸中浸泡1-2分钟分化即可。用显微镜观察染色效果，评估增强作用。
83.参照图3，利用实施例1中的纳米金增强ki-67抗体试剂，以1：1000的稀释比进行常
规ihc实验，结果显示阳性细胞有明显的放大效应。
84.参照图4，正常的ki-67抗体在扁桃体上进行免疫组化反应的染色效果显示，生发中心的b细胞暗区，也可以呈中等至强阳性反应；而生发中心b细胞则显示弱至中等强度的着色。
85.综上对比所得，实施例3中，纳米金增强后ki-67抗体的信号放大强度可达到3倍左右。
86.临床切片应用验证结果显示：1.纳米金增强的ki-67抗体试剂在应用上与商品化的ki-67抗体试剂没有区别，不需要特殊处理，依据常规ihc操作使用，检测结果是一样的。
87.2.在配制ki-67抗体试剂时，由于增敏了抗体，从而节约了抗体的使用量，也可以降低抗体试剂的生产成本。
88.3.由于ki-67抗体特异强，增敏后抗体的用量进一步减少，也进一步提高了抗体的特异性，使ihc染色的本底进一步降低，所以染片本底好。
89.4.由于纳米金增强了抗体信号，促进了更多的ihc酶标二抗与一抗（含信号抗体）结合，经dab显色，ihc染色效果更强，染色深。
90.本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明所述原理的情况下，本发明的实施方式可以有任何的变形或修改。
91.由此可以看到本发明目的可被充分有效完成。用于解释本发明功能和结构原理的该实施例已被充分说明和描述，在没有背离这些原理的情况下可以进行改变。因此，本发明包括涵盖在附属权利要求范围和精神之内的所有修改。