一种快速检测血型抗体滴度的试剂、制备方法、试纸条及应用与流程

1.本发明涉及血型检测技术领域，特别是涉及一种快速检测血型抗体滴度的试剂、制备方法、试纸条及应用。


背景技术：

2.对于大失血休克患者而言，快速有效的输血是其救治的关键，而通用o型全血其红细胞表面无a、b抗原，因此无需交叉配血，节约时间，但由于o型血浆中含有抗-a和抗-b抗体，抗体的滴度也是因人而异，因而当受血者接受了含有高滴度抗体的o型血液后就会出现严重的急性溶血性输血反应。然而，具有低滴度的抗-a和抗-b抗体的o型全血可以安全的跨血型输血。目前低滴度o型全血(ltowb)可用于非特定类型的紧急输血，从而显著降低输血反应的风险。
3.目前临床o型血浆中抗体水平的筛查主要有两种方法：试管法和微柱凝胶法。试管法通过倍比稀释供体血浆，然后与试管中标准红细胞反应，传统的盐水试管法进行抗体滴度检测虽己得到广泛应用但却具有操作比较复杂、程序繁多、实验结果影响因素多等弊端。而作为高科技产物的微柱凝胶法是凝胶分子筛技术和免疫学抗原抗体反应相结合的产物，通过调节凝胶(葡聚糖)的浓度，控制凝胶间隙大小，只允许游离红细胞通过，从而达到分离游离红细胞和凝集红细胞的目的，虽然具有高度的敏感性，但对实验环境和标本要求高、且成本高昂，需要的仪器设备复杂。除此之外，流式细胞术、微板法等也用于血型抗体的检测。流式细胞术使用荧光标记的抗血型抗体实现抗-a(b)的定量检测。固相微板法，用戊二醛处理的微板使红细胞与微板板底牢固结合，在微板中加入倍比稀释的供体血浆，离心后读取抗-a(b)滴度，且成本低廉、操作简便，适用于大批量样本检测。但这些方法都需要冷藏保存的红细胞，且无法满足即时检测需求，以应对复杂的环境，因此亟需开发一种可常温储存且适用于复杂环境的血型抗体检测试剂。


技术实现要素：

4.为了解决上述问题，本发明提供一种快速检测血型抗体滴度的试剂、制备方法、试纸条及应用。本发明提供的的试剂可以代替标准红细胞作为血型抗体滴度的检测试剂，将其包被于试纸上，可常温保存，无需冷藏，且红细胞内容物由荧光微球取代，不会发生溶血现象，可以用于复杂环境的血型抗体检测。
5.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
6.本发明提供了一种快速检测血型抗体滴度的试剂，所述试剂为红细胞膜偶联的荧光微球；所述试剂包括以下质量份的制备原料：荧光微球0.2份、edc 3000份和红细胞膜4份。
7.优选的，所述红细胞膜包括只含a抗原或b抗原的红细胞膜。
8.本发明还提供了上述试剂的制备方法，包括以下步骤：
9.将荧光微球和edc溶于水后混合，得到活化后的荧光微球溶液；
10.将活化后的荧光微球溶液和红细胞膜混合，得到沉淀为所述试剂。
11.优选的，得到试剂后还包括：将所述试剂与保存液混合；所述保存液包括以下组分：水1000ml、na2hpo412g、tris 3.6g、bsa 10g、果糖20g、pvp-40 1g、hcl 1.34ml、nan30.025g、酪蛋白8g、nacl 0.85g和peg-255g。
12.本发明还提供了一种快速检测血型抗体滴度的试纸条，所述试纸条的反应区包被有上述试剂。
13.优选的，所述试剂的包被浓度为0.5～1.8mg/ml。
14.优选的，所述试纸条还包括：固定区1、加样区2、检测区4和吸水区5；
15.所述试纸条的检测区4上设置有检测线41和质控线42；
16.所述检测线41包被有抗人igm抗体，所述质控线42包被有抗人igg抗体
17.优选的，所述抗人igm抗体和抗人igg抗体的包被浓度分别为0.5～1.8mg/ml。
18.本发明还提供了上述试剂或利用上述制备方法制备得到的试剂或上述的试纸条在检测血型和/或血型抗体滴度中的应用。
19.本发明还提供了一种检测血型和/或血型抗体滴度的方法，包括以下步骤：
20.将待测血浆分别加入a试纸条和b试纸条的加样区，3min后利用仪器观察检测区的结果；
21.其中a试纸条上检测线的荧光值记为t1，a试纸条上质控线的荧光值记为c1；其中b试纸条上检测线的荧光值记为t2，b试纸条上质控线的荧光值记为c2；
22.所述a试纸条为：上述的试纸条，且反应区只包被含a抗原红细胞膜制备的试剂；
23.所述b试纸条为：上述的试纸条，且反应区只包被含b抗原红细胞膜制备的试剂；
24.结果判断：
25.若a试纸条或b试纸条的检测区，检测线和质控线均无荧光或只有检测线有荧光，则表示a试纸条或b试纸条失效；
26.若a试纸条的检测线无荧光，b试纸条的检测线有荧光，则表示待测血型为a血型，其抗-a抗体滴度为1：2
y2
，其中y2＝-0.0618(t2/c2)2+1.4212*(t2/c2)+1.9146；
27.若a试纸条的检测线有荧光，b试纸条的检测线无荧光，则表示待测血型为b血型，其抗-b抗体滴度为1：2
y1
，其中y1＝-0.0618(t1/c1)2+1.4212*(t1/c1)+1.9146；
28.若a试纸条的检测线无荧光，b试纸条的检测线无荧光，则表示待测血型为ab血型；
29.若a试纸条的检测线有荧光，b试纸条的检测线有荧光，则表示待测血型为o血型，其抗-a抗体滴度为1：2
y2
，其中y2＝-0.0618(t2/c2)2+1.4212*(t2/c2)+1.9146，抗-b抗体滴度为1：2
y1
，其中y1＝-0.0618(t1/c1)2+1.4212*(t1/c1)+1.9146。
30.有益效果：
31.本发明提供了一种快速检测血型抗体滴度的试剂，所述试剂为红细胞膜偶联的荧光微球；所述试剂包括以下质量份的制备原料：荧光微球0.2份、edc 3000份和红细胞膜4份。本发明通过适宜的荧光微球、edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和红细胞膜复配，制备得到的试剂荧光强度高，便于检测，可以代替标准红细胞作为血型抗体滴度的检测试剂，将其包被于试纸上，可常温保存，无需冷藏，且红细胞内容物由荧光微球取代，不会发生溶血现象，可以用于复杂环境的血型抗体检测。
附图说明
32.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
33.图1为试纸条结构示意图，其中1为固定区，2为加样区，3为反应区，4为检测区，41为检测线，42为质控线，5为吸水区；
34.图2为不同活化剂剂量下阳性样本和阴性样本荧光强度的变化结果；
35.图3为最适edc量活化下和未活化下制备的试剂(红细胞膜)荧光结果；
36.图4为相同质量的试剂下不同红细胞膜标记量阳性样本荧光结果；
37.图5为阳性、阴性和无效结果中质控线(c)和检测线(t)的判断示意图；
38.图6为利用试纸条检测a型血的荧光结果图；
39.图7为不同血型质控线(c)和检测线(t)的判断示意图；
40.图8为igm抗b抗体不同抗体滴度的荧光结果图；
41.图9为igm抗b抗体不同抗体滴度拟合的标准曲线及计算公式。
具体实施方式
42.本发明提供了一种快速检测血型抗体滴度的试剂，所述试剂为红细胞膜偶联的荧光微球；所述试剂包括以下质量份的制备原料：荧光微球0.2份、edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)3000份和红细胞膜4份。
43.在本发明中，所述edc为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐；所述荧光微球优选包括聚苯乙烯荧光微球、aie荧光微球、量子点荧光微球和时间分辨荧光微球中的一种或多种，更优选为时间分辨荧光微球。
44.在本发明中，所述红细胞膜优选包括只含a抗原或b抗原的红细胞膜。
45.在本发明中，所述红细胞膜的制备方法优选包括以下步骤：
46.1)取3份以上人新鲜全血(a型血或b型血)混合后，3000rpm离心5min，弃去上清，然后使用pbs缓冲液或生理盐水将红细胞洗涤2～3遍，收集红细胞；
47.2)洗涤后的红细胞与裂解液按体积比1:1混合，混匀后静置30min，10000rpm离心5min，弃去上清，得到裂解的红细胞；所述裂解液包括：5wt.％十二烷基磺酸钠溶液、10wt.％氯化钙溶液或1wt.％曲拉通溶液；
48.3)采用超纯水洗涤：将裂解的红细胞与超纯水按体积比1:3混合，混匀后，10000rpm离心5min，收集沉淀；
49.4)将收集的沉淀采用步骤3)的洗涤方法重复洗涤3～4遍，直至上清无色透明为止，收集沉淀为红细胞膜抗原。
50.本发明通过适宜的荧光微球、edc和红细胞膜复配，制备得到的试剂荧光强度高，便于检测，可以代替标准红细胞作为血型抗体滴度的检测试剂。另外本发明提供的试剂(红细胞膜偶联的荧光微球)烘干后复溶仍有良好的血型抗原活性，可使滴度检测从液相反应转移至固相载体中发生。
51.本发明还提供了上述试剂的制备方法，包括以下步骤：
52.将荧光微球和edc溶于水后混合，得到活化后的荧光微球溶液；
53.将活化后的荧光微球溶液和红细胞膜混合，得到沉淀为所述试剂。
54.在本发明中，优选将荧光微球和edc分别溶于水，得到荧光微球溶液和edc溶液；将荧光微球溶液和edc溶液按比例(使混合后的溶液中荧光微球和edc的质量比为0.2：3000)混合，得到活化后的荧光微球溶液。在本发明中，所述水优选包括超纯水；所述荧光微球溶液的制备方法优选包括：将荧光微球与超纯水按体积比1:100混合，8000rpm离心5min，得到所述荧光微球溶液(0.01mg/ml)；所述edc溶液的浓度优选为15mg/ml；所述混合的时间优选为5min。本发明先将荧光微球和edc分别溶于水后再进行混合可以更精确的控制荧光微球和edc的复配用量；另外，本发明通过适宜比例的荧光微球和edc混合，可以使荧光微球上羧基基团完全活化，提高后续和红细胞膜的偶联效果，还可以避免edc过量造成荧光微球上的羧基基团团聚，从而使本底值增高的问题。
55.得到活化后的荧光微球溶液后，本发明将活化后的荧光微球溶液和红细胞膜混合(活化后的荧光微球和红细胞膜的质量比为1：20)，得到沉淀为所述试剂。在本发明中，所述活化后的荧光微球溶液和红细胞膜混合后，优选还包括离心处理；所述离心处理包括10000rpm下离心5min。本发明通过适宜的活化后荧光微球和红细胞膜复配，可以使活化后的荧光微球最大程度且均匀的偶联(活化后的羧基和红细胞膜上的氨基形成酰胺键)在红细胞膜上，从而提高试剂的荧光标记效果。
56.得到试剂后还优选包括：将所述试剂与保存液混合；所述保存液包括以下组分：水1000ml、na2hpo412g、tris 3.6g、bsa 10g、果糖20g、pvp-401g、hcl 1.34ml、nan30.025g、酪蛋白8g、nacl 0.85g和peg-255g。在本发明中，所述水优选包括超纯水。本发明对所述保存液各组分的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。本发明保存液不仅可以防止试剂变质，而且可以便于试剂复溶。
57.本发明还提供了一种快速检测血型抗体滴度的试纸条，所述试纸条的反应区3包被有上述试剂。在本发明中，所述试剂的包被浓度优选为0.5～1.8mg/ml，进一步优选为1～1.6mg/ml，更优选为1.5mg/ml。在本发明中，所述反应区3的制备原料优选包括具有导水性和亲水性的多孔高分子材料，更优选为玻璃纤维；所述反应区3的制备方法优选包括：将所述试剂均匀涂覆于玻璃纤维上置于冻干机中冻干24h，得到所述反应区3。
58.结合附图1对本发明提供的试纸条进行说明。
59.如图1所示，本发明所述试纸条包括：固定区1、加样区2、反应区3、检测区4和吸水区5；
60.沿所述固定区1长度方向依次固定加样区2、反应区3、检测区4和吸水区5；
61.所述反应区3长度方向的一端和加样区2搭接，所述反应区3长度方向的另一端和检测区4搭接；所述检测区4长度方向和反应区3搭接的另一端和吸水区5搭接。
62.所述检测区4上设置有检测线41和质控线42；所述检测线41和质控线42的间距优选为8mm；所述检测线41包被有抗人igm抗体，所述质控线42包被有抗人igg抗体。
63.在本发明中，所述检测区4的制备原料优选包括硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、聚乙烯膜或尼龙膜，更优选为毛细管流速为40～90sec/4cm宽的有背衬的硝酸纤维膜。
64.在本发明中，所述抗人igm抗体的包被浓度优选为0.5～1.8mg/ml，进一步优选为1～1.6mg/ml，更优选为1.5mg/ml；所述抗人igg抗体优选为0.5～1.8mg/ml，进一步优选为1～1.6mg/ml，更优选为1.5mg/ml。
65.在本发明中，所述固定区1的制备原料优选包括聚酯，更优选为聚对苯二甲酸乙二
酯(pet)；所述加样区2的制备原料优选包括具有导水性和亲水性的多孔高分子材料，更优选为玻璃纤维；所述吸水区5的制备原料优选包括具有亲水性、耐酸碱和绝对孔径的有机高分子材料或无机材料，更优选包括棉浆纸。
66.本发明提供的试纸条通过将上述试剂(红细胞膜偶联的荧光微球)冻干后包被在反应区3上，可使滴度检测从液相反应转移至固相载体中发生；另外，本发明提供的试纸条在检测血型和/或血型抗体滴度时，操作简便快捷，无需借助离心设备或者借助玻片，整个反应及检测体系在一个检测卡中即可完成，且无液体医疗废物产生，检测更加安全；本发明提供的试纸条适用场景更加广泛，适合室外场景使用，如急救车、野外战场、空中救援、医院船等。
67.本发明还提供了上述试剂或利用上述制备方法制备得到的试剂或上述的试纸条在检测血型和/或血型抗体滴度中的应用。
68.本发明还提供了一种检测血型和/或血型抗体滴度的方法，包括以下步骤：
69.将待测血浆分别加入a试纸条和b试纸条的加样区，3min后利用仪器观察检测区的结果；
70.其中a试纸条上检测线的荧光值记为t1，a试纸条上质控线的荧光值记为c1；其中b试纸条上检测线的荧光值记为t2，b试纸条上质控线的荧光值记为c2；
71.所述a试纸条为：上述试纸条，且反应区只包被含a抗原红细胞膜制备的试剂；
72.所述b试纸条为：上述试纸条，且反应区只包被含b抗原红细胞膜制备的试剂；
73.结果判断：
74.若a试纸条或b试纸条的检测区，检测线和质控线均无荧光或只有检测线有荧光，则表示a试纸条或b试纸条失效；
75.若a试纸条的检测线无荧光，b试纸条的检测线有荧光，则表示待测血型为a血型，其抗-a抗体滴度为1：2
y2
，其中y2＝-0.0618(t2/c2)2+1.4212*(t2/c2)+1.9146；
76.若a试纸条的检测线有荧光，b试纸条的检测线无荧光，则表示待测血型为b血型，其抗-b抗体滴度为1：2
y1
，其中y1＝-0.0618(t1/c1)2+1.4212*(t1/c1)+1.9146；
77.若a试纸条的检测线无荧光，b试纸条的检测线无荧光，则表示待测血型为ab血型；
78.若a试纸条的检测线有荧光，b试纸条的检测线有荧光，则表示待测血型为o血型，其抗-a抗体滴度为1：2
y2
，其中y2＝-0.0618(t2/c2)2+1.4212*(t2/c2)+1.9146，抗-b抗体滴度为1：2
y1
，其中y1＝-0.0618(t1/c1)2+1.4212*(t1/c1)+1.9146。
79.在本发明中，计算得到的y1或y2的值优选采用四舍五入的计数方法取整数。
80.在本发明中，所述仪器优选包括荧光仪或荧光手电；当仅检测待测血型时，所述仪器优选为可以观察是否有荧光的仪器即可，更优选为荧光手电。
81.为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种快速检测血型抗体滴度的试剂、制备方法、试纸条及应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
82.实施例1
83.一种快速检测血型抗体滴度的试剂，所述试剂由以下质量份的原料组成：时间分辨荧光微球(购自长沙美牛生物科技有限公司，货号为rf02)0.2份、edc 3000份和红细胞膜4份。
84.所述试剂的制备方法由以下步骤组成：
85.1)取3份人新鲜全血(a型血)混合后，3000rpm离心5min，弃去上清，然后使用pbs缓冲液将红细胞洗涤2～3遍，收集红细胞；
86.2)洗涤后的红细胞与5wt.％十二烷基磺酸钠溶液按体积比1:1混合，混匀后静置30min，10000rpm离心5min，弃去上清，得到裂解的红细胞；
87.3)采用超纯水洗涤：将裂解的红细胞与超纯水按体积比1:3混合，混匀后，10000rpm离心5min，收集沉淀；
88.4)将收集的沉淀采用步骤3)的洗涤方法重复洗涤3～4遍，直至上清无色透明为止，收集沉淀为红细胞膜；
89.5)取0.1ml时间分辨荧光微球与超纯水按体积比1:100加入超纯水10ml，8000rpm离心5min，得到荧光微球溶液(浓度为0.01mg/ml)；
90.6)将20μl荧光微球溶液和200μledc溶液(浓度为15mg/ml)混合5min后，得到活化后的荧光微球溶液；
91.7)将活化后的荧光微球溶液和步骤4)收集红细胞膜混合，10000rpm下离心5min，得到沉淀为所述试剂；所述活化后的荧光微球和红细胞膜的质量比为1:20；
92.8)将所述试剂加入保存液中保存；所述保存液包括以下组分：水1000ml、na2hpo412g、tris 3.6g、bsa 10g、果糖20g、pvp-401g、hcl 1.34ml、nan30.025g、酪蛋白8g、nacl 0.85g和peg-255g。
93.实施例2
94.一种与实施例1相似的快速检测血型抗体滴度的试剂，唯一区别在于，步骤1)为：取3份以上人新鲜全血(b型血)混合后，3000rpm离心5min，弃去上清，然后使用生理盐水将红细胞洗涤2～3遍，收集红细胞。
95.实施例3
96.一种快速检测血型抗体滴度的试纸条，由以下结构组成：固定区(聚酯pvc板)1、加样区(玻璃纤维)2、反应区(玻璃纤维)3、检测区4(玻璃纤维)和吸水区(棉浆纸)5；所述反应区3上包被有浓度为1.5mg/ml的实施例1制备的试剂；
97.沿所述固定区1长度方向依次固定加样区2、反应区3、检测区4和吸水区5；
98.所述反应区3长度方向的一端和加样区2搭接，所述反应区3长度方向的另一端和检测区4搭接；所述检测区4长度方向和反应区3搭接的另一端和吸水区5搭接；所述检测区4上未和反应区3和吸水区5搭接的区域沿反应区3至吸水区5方向上依次设置有检测线41和质控线42；所述检测线包括有浓度为1.5mg/ml的鼠igm抗体，所述质控线42包被有浓度为1.5mg/ml的羊抗兔igg抗体；所述检测线41和质控线42的间距为8mm。具体结构示意图见图1。
99.所述试纸条的制备方法由以下步骤组成：
100.反应区3预处理：取实施例1制备的试剂1ml(浓度为1.5mg/ml)均匀涂覆于玻璃纤维上，置于冻干机中冻干24h，冻干后反应区3即处理完成；
101.检测区预处理：检测区预包被鼠igm抗体(检测线41)和羊抗兔igg抗体(质控线42)，包被浓度均为1.5mg/ml；
102.试纸条搭接：沿所述固定区1长度方向依次粘结加样区2、反应区3、检测区4和吸水
区5，最后裁剪为4mm宽度的试纸条。
103.实施例4
104.一种与实施例3相似的快速检测血型抗体滴度的试纸条，唯一区别在于，所述反应区3上包被有浓度为1.5mg/ml的实施例2制备的试剂。
105.实施例5
106.一种检测血型和/或血型抗体滴度的方法，由以下步骤：
107.将待测血浆分别加入a试纸条和b试纸条的加样区，3min后利用荧光仪观察检测区的结果；
108.其中a试纸条上检测线的荧光值记为t1，a试纸条上质控线的荧光值记为c1；其中b试纸条上检测线的荧光值记为t2，b试纸条上质控线的荧光值记为c2；
109.所述a试纸条为实施例1制备的试纸条；所述b试纸条为实施例2制备的试纸条；
110.结果判断(见图5～7)：
111.若a试纸条或b试纸条的检测区，检测线和质控线均无荧光或只有检测线有荧光，则表示a试纸条或b试纸条失效(见图5)；
112.若a试纸条的检测线无荧光，b试纸条的检测线有荧光，则表示待测血型为a血型，其抗-a抗体滴度为1：2
y2
，其中y2＝-0.0618(t2/c2)2+1.4212*(t2/c2)+1.9146(见图6)；
113.若a试纸条的检测线有荧光，b试纸条的检测线无荧光，则表示待测血型为b血型，其抗-b抗体滴度为1：2
y1
，其中y1＝-0.0618(t1/c1)2+1.4212*(t1/c1)+1.9146；
114.若a试纸条的检测线无荧光，b试纸条的检测线无荧光，则表示待测血型为ab血型；
115.若a试纸条的检测线有荧光，b试纸条的检测线有荧光，则表示待测血型为o血型，其抗-a抗体滴度为1：2
y2
，其中y2＝-0.0618(t2/c2)2+1.4212*(t2/c2)+1.9146，抗-b抗体滴度为1：2
y1
，其中y1＝-0.0618(t1/c1)2+1.4212*(t1/c1)+1.9146。
116.对比例1
117.一种与实施例1相似试剂，唯一区别在于，步骤6)中未加入edc溶液。
118.对比例2
119.一种与实施例1相似试剂，唯一区别在于，步骤6)中edc溶液的体积为25μl。
120.对比例3
121.一种与实施例1相似试剂，唯一区别在于，步骤6)中edc溶液的体积为50μl。
122.对比例4
123.一种与实施例1相似试剂，唯一区别在于，步骤6)中edc溶液的体积为100μl。
124.对比例5
125.一种与实施例1相似试剂，唯一区别在于，步骤6)中edc溶液的体积为400μl。
126.对比例6
127.一种与实施例1相似试剂，唯一区别在于，步骤6)中edc溶液的体积为800μl。
128.对比例7
129.一种与实施例1相似试剂，唯一区别在于，步骤6)中所述活化后的荧光微球和红细胞膜的质量比为1:2.5。
130.对比例8
131.一种与实施例1相似试剂，唯一区别在于，步骤6)中所述活化后的荧光微球和红细
胞膜的质量比为1:5。
132.对比例9
133.一种与实施例1相似试剂，唯一区别在于，步骤6)中所述活化后的荧光微球和红细胞膜的质量比为1:10。
134.对比例10
135.一种与实施例1相似试剂，唯一区别在于，步骤6)中所述活化后的荧光微球和红细胞膜的质量比为1:30。
136.对比例11
137.一种与实施例1相似试剂，唯一区别在于，步骤6)中所述活化后的荧光微球和红细胞膜的质量比为1:40。
138.对比例12
139.一种与实施例3相似的试纸条，唯一区别在于，所述反应区3上包被有浓度为1.5mg/ml的对比例1制备的试剂。
140.对比例13
141.一种与实施例3相似的试纸条，唯一区别在于，所述反应区3上包被有浓度为1.5mg/ml的对比例2制备的试剂。
142.对比例14
143.一种与实施例3相似的试纸条，唯一区别在于，所述反应区3上包被有浓度为1.5mg/ml的对比例3制备的试剂。
144.对比例15
145.一种与实施例3相似的试纸条，唯一区别在于，所述反应区3上包被有浓度为1.5mg/ml的对比例4制备的试剂。
146.对比例16
147.一种与实施例3相似的试纸条，唯一区别在于，所述反应区3上包被有浓度为1.5mg/ml的对比例5制备的试剂。
148.对比例17
149.一种与实施例3相似的试纸条，唯一区别在于，所述反应区3上包被有浓度为1.5mg/ml的对比例6制备的试剂。
150.对比例18
151.一种与实施例3相似的试纸条，唯一区别在于，所述反应区3上包被有浓度为1.5mg/ml的对比例7制备的试剂。
152.对比例19
153.一种与实施例3相似的试纸条，唯一区别在于，所述反应区3上包被有浓度为1.5mg/ml的对比例8制备的试剂。
154.对比例20
155.一种与实施例3相似的试纸条，唯一区别在于，所述反应区3上包被有浓度为1.5mg/ml的对比例9制备的试剂。
156.对比例21
157.一种与实施例3相似的试纸条，唯一区别在于，所述反应区3上包被有浓度为
1.5mg/ml的对比例10制备的试剂。
158.对比例22
159.一种与实施例3相似的试纸条，唯一区别在于，所述反应区3上包被有浓度为1.5mg/ml的对比例11制备的试剂。
160.对比例23
161.采用实施例5相似的方法检测不同活化剂剂量(实施例3和对比例12～17制备的试纸条)下阳性样本(a膜+igm抗a)和阴性样本(a膜+igm抗b)荧光强度的变化，每组实验均平行三次，根据阳性样本组荧光强度和阴性样本组荧光强度的比值来确定最佳edc活化量，实验结果见表1图2和图3。
162.表1不同活化剂剂量下阳性样本和阴性样本荧光强度的变化
[0163][0164]
由表1和图2可知，活化剂(edc)的用量直接影响荧光微球活化的程度，活化剂过少会造成荧光微球上的羧基基团没有完全活化，影响偶联效果，而过量会造成荧光微球上的羧基基团团聚，从而使本底值增高，当活化剂为200μl，即3mg时(实施例3)，活化效果最好。
[0165]
由图3可知，最适edc量活化下(实施例3)，红细胞膜上荧光均匀，无edc活化时(对比例12)，红细胞膜上基本无荧光，荧光微球均分散于溶液中。
[0166]
对比例24
[0167]
采用实施例5相似的方法检测相同质量的试剂下不同红细胞膜标记量(实施例3和对比例18～22制备的试纸条)的荧光探针检测阳性样本，读取荧光信号值，每组实验均平行三次，从而确定最佳的红细胞膜标记量。检测结果见表2和图4。
[0168]
表2相同质量的试剂下不同红细胞膜标记量阳性样本荧光值
[0169][0170]
由表2和图4可知，随着红细胞膜偶联质量的增加，不同偶联质量的荧光强度先增加后减小，当红细胞膜质量为200μg时，荧光强度相对较高，且继续增加红细胞膜质量，标记效率明显下降，说明此时抗原的标记量已经达到荧光微球的饱和状态，因此选择200μg为最佳的红细胞膜标记量。
[0171]
应用例1
[0172]
采用实施例5所述的方法检测标准品和临床样本40例的荧光结果，标准品和临床40例样本的符合率均为100％，检测结果见表3。
[0173]
表3标准品和临床样本40例的荧光结果
[0174][0175][0176]
注：表中“+”为出现凝集，阳性，
“‑”
为未出现凝集，阴性，“/”为不进行此单项试验。
[0177]
从检测结果可看出，红细胞血型抗体芯片具有较高的特异性
[0178]
应用例2
[0179]
将滴度为1:1024的igm抗b标准品抗体依次稀释为1：256、1:64、1:16、1:4，然后采用实施例5相似的方法检测，得到不同的t/c值，利用excel软件拟合出抗体滴度与t/c关系的公式(见图9)，检测结果见表4、图8和图9。
[0180]
表4不同抗体滴度的荧光值
[0181][0182]
从检测结果可以看出，抗体滴度与荧光强度有明显的相关关系，血型抗体滴度与荧光强度成正比。
[0183]
应用例3
[0184]
采用经典方法(试管法)和本发明实施例5所述的方法分别检测6例a型血志愿者全血中抗b igm抗体的滴度，检测结果见表5。
[0185]
表5使用本发明检测方法与经典方法(试管法)检测血志愿者全血中抗b igm抗体的滴度
[0186][0187]
由表5可知，本发明提供的方法和经典方法的检测得到结果一致，表明本方案适用于全血血型抗体滴度的检测。
[0188]
综上所述，本发明提供的的试剂可以代替标准红细胞作为血型抗体滴度的检测试剂，将其包被于试纸上，可常温保存，无需冷藏，且红细胞内容物由荧光微球取代，不会发生溶血现象，可以用于复杂环境的血型抗体检测。
[0189]
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。