胶体金免疫层析法检测mRNA样本中双链RNA副产物的制作方法

本发明属于免疫检测，具体涉及一种使用胶体金免疫层析法检测mrna样本中双链rna副产物的方法，以及相应的层析试纸条及其制备方法。

背景技术：

1、目前，mrna疫苗是对抗新型冠状病毒肺炎(covid-19)的最有效工具之一。随着人们对mrna疫苗的需求不断增加，需要通过体外转录(ivt)工艺生产大量的mrna。然而，噬菌体聚合酶介导的ivt mrna过程会产生多种双链rna(dsrna)副产物。这些双链rna副产物源自无效转录物的随机启动和反义转录等，可诱导蛋白质合成的抑制和免疫反应。具体来说，双链rna能激活相关信号通路，导致不同促炎细胞因子的上调。因此，通过检测手段监测ivtmrna的质量，并确认纯化后双链rna的有效去除，对于减少先天免疫激活和改善mrna翻译至关重要。

2、先前的研究已经展示了一些检测ivt过程中双链rna副产物的技术。离子对反相高效液相色谱(ip-rp-hplc)已成为双链rna快速纯化和高分辨率定量分析的一种方法。但这种方法需要使用大量具有毒性的洗脱液，而且仪器大型又昂贵，不适合大多数实验室。目前，最突出的检测工具之一是斑点印迹分析(dot blot)，它依赖于双链rna特异性抗体对双链rna的识别。然而，这种方法很难立即评估转录后产物的纯度。此外，由于靶标与膜的非特异性结合，斑点印迹分析可能会产生假阳性结果。此外，将样本固定在膜上严重限制了测定的定量特征。因此，迫切需要开发快速、简单和经济的检测双链rna的方法。

3、根据文献报道，可以获得对dsrna抗原具有高度特异性的单克隆抗体。基本方法是：选择dba/2小鼠，用larger dsrna(l-dsrna)(来源于微小隐孢子虫病毒)进行第三次免疫后的血清，以l-dsrna和poly(a)-poly(u)为抗原，进行elisa检测。两种抗原在1:100稀释时，看血清是否显阳性，然后将阳性血清再以1:1000稀释，与单链rna均聚物poly(a)和(u)以及天然和变性的鲱鱼精dna进行交叉反应分析。如果没有发现交叉反应，再选择相应的动物进行杂交瘤生产。然后进行细胞融合，建立3个稳定的杂交瘤株系(j5、j2和kl)，产生对dsrna抗原具有高度特异性的单克隆抗体j5、j2和kl。j5抗体属于igg2b，j2和kl抗体属于igg2a；三种抗体的轻链均为kappa(κ)型。具体可参见schonborn j，oberstraβj，breyel e，et al.monoclonal antibodies to double-stranded rna as probes of rna structurein crude nucleic acid extracts[j].nucleic acids research,1991(11):2993-3000。

4、胶体金免疫层析试纸条分析法作为一种成熟的快速检测方法，已在疾病诊断、食品安全和环境监测等许多研究领域得到应用。与其他检测方法相比，该方法具有许多实际优势，包括现场快速检测、操作简单、结果解释容易、成本低、无需样本预处理和大型仪器等。但是，根据发明人了解，截至目前胶体金免疫层析法并未用于检测双链rna。

技术实现思路

1、为了解决以上问题，尤其是体外转录(ivt)的mrna的检测，本发明提出了一种利用胶体金免疫层析原理检测mrna样本中双链rna副产物的方法，以及相应的层析试纸条。本发明的技术方案如下：

2、第一方面，本发明提供一种定性检测样本中双链rna的方法，包括：用胶体金对第一抗体进行标记，所述第一抗体能够和双链rna在第一位点进行特异性结合，而且可以随样本一起流动；滴加样本，利用毛细作用原理，使样本依次流经第一抗体、第二抗体，所述第二抗体不能随样本流动，所述第二抗体能够和双链rna在第二位点进行特异性结合；通过肉眼观察显色与否来判断样本中是否存在双链rna。所述第一位点和第二位点的位置不同。需要说明的是，由于双链rna是线状结构，因此双链rna的某些特定结构例如a-helix上沿长度方向的两个不同结合位点，可以分别视为本专利中所述的第一位点和第二位点。

3、其基本原理是，当样本中存在双链rna时候，双链rna首先在在第一位点和第一抗体进行抗原-抗体特异性结合，形成双链rna-第一抗体复合物；由于第一抗体不是固定的，因此该复合物在毛细作用下继续往前流动，到达固定有第二抗体的区域；由于第二抗体和双链rna在第二位点进行特异性结合，由此形成了金标第一抗体-双链rna-第二抗体夹心复合物；由于第二抗体是固定的，因此夹心复合物将不再向前移动，其中的金标第一抗体将会按照第二抗体的预先固定区域进行聚集从而呈现出特定的图案。比如在第二抗体按照窄条形状进行固定的情况下，当样本中存在双链rna时候，对应窄条区域呈现出特定颜色。没有参与形成复合物的金标第一抗体继续向前流动因而不会在第二抗体区域聚集，也就不会显色。

4、优选方案是，一种定性检测样本中双链rna的方法，包括：用胶体金对第一抗体、第三抗体进行标记，所述第一抗体能够和双链rna在第一位点进行特异性结合，所述第三抗体不能和双链rna进行特异性结合(也不能和第一抗体、第二抗体特异性结合，否则会产生干扰)，但是可以和第四抗体进行特异性结合，所述第一抗体、第三抗体可以随样本一起流动；滴加样本，利用毛细作用原理，使样本先流经第一抗体、第三抗体，然后再流经第二抗体、第四抗体，所述第二抗体、第四抗体不能随样本流动，所述第二抗体能够和双链rna在第二位点进行特异性结合；通过肉眼观察第二抗体区域显色与否来判断样本中是否存在双链rna；通过肉眼观察第四抗体区域显色与否来判断检测结果可靠性。

5、通过肉眼观察第二抗体区域显色与否来判断样本中是否存在双链rna的原理如上所述。通过肉眼观察第四抗体区域显色与否来判断检测结果可靠性的原理是：金标第三抗体随样本一起向前流动，到达第四抗体区域，并且和第四抗体进行特异性抗原-抗体结合，由此形成了金标第三抗体-第四抗体复合物；由于第四抗体是固定的，因此复合物将不再向前移动，其中的金标第三抗体将会按照第四抗体的预先固定区域进行聚集从而呈现出特定的图案。比如在第四抗体按照“一”字形固定在硝酸纤维素膜的情况下，当检测正常进行时，对应的“一”字形第四抗体区域将会呈现出特定颜色。如果金标第三抗体失效或者不能随样本一起向前流动情况下，即检测没有正常进行情况下，由于不会产生胶体金聚集，因而“一”字形的第四抗体区域不会显色，提示检测过程有问题。

6、为了便于操作，优选方案是，通过免疫侧向层析试纸条进行检测，所述胶体金标记的第一抗体、第三抗体喷涂在免疫侧向层析试纸条的相同位置例如金标垫上。为了更有效地判断检测结果的可靠性，优选方案是，样本先流经第二抗体，然后再流经第四抗体。

7、通过检测确认存在双链rna情况下，可通过胶体金分析仪或image j灰度值分析，检测双链rna的含量，从而实现定量分析。

8、优选方案是，所述第一抗体(检测抗体)、第二抗体(捕获抗体)都是单克隆抗体，例如所述第一抗体是j5，所述第二抗体是k1；或者所述第一抗体是j2，所述第二抗体是k1；或者所述第一抗体是k1，所述第二抗体是j5。最优选方案是，所述第一抗体是j5，所述第二抗体是k1。所述第三抗体(质控抗原)是兔igg抗体；所述第四抗体(质控抗体)是羊抗兔igg抗体。羊抗兔igg抗体通过弱的非共价相互作用(如静电、氢键、范德华力和疏水相互作用)，与兔igg抗体发生特异性的抗原-抗体结合。

9、作为优选的方案，所述双链rna包括低分子量的聚肌苷酸胞苷酸、高分子量的聚肌苷酸胞苷酸、含u的双链rna、含n1-甲基-假尿苷的双链rna中的一种或多种。

10、优选方案是，所述待检测的双链rna长度至少为40bp，优选长度是至少45bp、50bp、55bp、60bp、65bp、70bp、75bp、80bp、85bp、90bp、95bp、100bp；所述双链rna的第一位点、第二位点都是a-helix结构但是位置不同。例如双链rna长度为200bp，其中1-40bp的a-helix结构形成第一位点，80-130bp的a-helix结构形成第二位点；或者20-70bp的a-helix结构形成第一位点，100-148bp的a-helix结构形成第二位点，等等。

11、另一方面，本发明提供一种执行上述检测方法的免疫侧向层析试纸条，用于定性或者定量检测样本中双链rna，其特征在于，所述试纸条包括金标垫、检测线；所述金标垫涂布有金胶溶液标记的抗体j5；所述检测线包被有捕获抗体k1。优选方案是，所述金标垫同时涂布有金胶溶液标记的兔igg抗体；所述试纸条还包括质控线，所述质控线包被有羊抗兔igg抗体。

12、作为优选的方案，本发明所述的层析试纸条还包括支撑底板，所述支撑底板上顺次搭接加样区、金标垫、实验反应区和手持部位，所述检测线和质控线设置在实验反应区；所述手持部位是吸水滤纸。优选方案是，所述检测线更接近加样区。优选的实施方式是，所述检测线和质控线平行设置在实验反应区。

13、作为优选的方案，所述支撑底板为双面胶白色塑料聚氯乙烯(pvc)背板。作为优选的方案，所述加样区是玻璃纤维素膜，用于滴加检测样本。作为优选的方案，所述实验反应区是硝酸纤维素膜。作为优选的方案，所述检测线和质控线上溶液的划膜量为1μl/cm。

14、需要检测样本中双链rna时候，按照如下步骤使用试纸条：

15、(1)将样本滴加到试纸条的加样区，上样量通常可以是50μl，并静置15分钟；

16、(2)通过目视观察显色情况，确定样本中是否存在双链rna，判定方法如下：

17、(a)样本中含有双链rna：检测线t位置显色，质控线c位置显色；

18、(b)样本中不含双链rna：检测线t位置不显色，质控线c位置显色；

19、(c)试纸条失效：质控线c位置不显色；

20、(3)如果判定结果显示存在双链rna，可通过胶体金分析仪或image j灰度值分析，检测双链rna的含量。

21、另一方面，本发明还提供所述的胶体金免疫侧向层析试纸条的制备方法，包括：

22、制备加样区：将玻璃纤维素膜通过处理液浸润后，干燥备用。

23、制备金标垫：将玻璃纤维素膜浸润后干燥，制得结合垫，然后将含有金胶溶液标记的检测抗体j5以及金胶溶液标记的兔igg抗体的重悬液喷涂到所述结合垫上，干燥备用。

24、制备实验反应区：在支撑底板上粘贴硝酸纤维素膜，然后将捕获抗体k1溶液和羊抗兔igg抗体溶液分别划在硝酸纤维素膜上，形成检测线和质控线，干燥备用；作为优选的方案，所述检测线上的捕获抗体k1溶液的终浓度为1mg/ml；所述质控线上的羊抗兔igg抗体的终浓度为1.5mg/ml；作为优选的方案，所述检测线和质控线的划膜量均为1μl/cm。

25、需要说明的是，上述加样区、金标垫、实验反应区的制备没有先后顺序。最后组装成试纸条：在支撑底板上顺次搭接加样区、金标垫、实验反应区以及手持部位。

26、本发明的有益效果是：

27、将免疫层析技术引入到双链rna副产物的检测中，不仅节约了检测时间，提升了检测的准确性和灵敏度，而且操作简便，成本低，可用于现场检测，适合大规模生成。