一种苯丙胺类药物头发标准物质的制备方法及应用与流程

1.本发明属于分析化学技术领域，尤其涉及一种苯丙胺类药物头发标准物质的制备方法及应用。


背景技术：

2.苯丙胺类药物(amphetamine-type stimulants，简称ats)是苯丙胺及其衍生物的统称，依据化学结构和药理作用可分为兴奋型苯丙胺类、致幻型苯丙胺类、食欲型苯丙胺类和混合型苯丙胺类，主要包括甲基苯丙胺(ma，即冰毒)、苯丙胺(ap)、替苯丙胺(mda)、3，4-亚甲二氧基甲基苯丙胺(mdma)和3，4-亚甲二氧基乙基苯丙胺(mdea)、麻黄碱(ephedrine)等。ats是一类中枢神经兴奋剂，具有强烈的兴奋作用，成瘾性和耐受性较强，是世界上第二大被广泛滥用的违禁药物。ats滥用的不良反应主要有精神损害如造成急慢性精神障碍，生理损害如损害心脏造成心律失常等，会严重危害吸毒者的身心健康。
3.联合国毒品和犯罪问题办公室(unodc)就将其列为国际管制药品。我国公布的《麻醉药品和精神药品管理条例》中，将27种苯丙胺类兴奋剂列为管制药品。
4.毛发作为一种非常规的生物检材，具有采集方便，容易保存，不易造假，检测窗口长和无损非侵入性等特点。与血液和尿液检测相比，毛发检测的主要优势在于检测窗口更宽，根据所分析的毛干的长度，检测窗口为几周至几个月，长期的吸毒史可以通过毛发分析来追溯。由于毛发中的苯丙胺类药物含量较低且药物提取较复杂，需要合适的样品前处理方法和高灵敏度的分析方法。
5.毛发中苯丙胺类药物常用的检测方法有免疫分析法、gc-ms/ms、lc-ms/ms等。基于ats低分子量，易挥发的特点，gc-ms/ms是法医毒理学中检测苯丙胺类药物的重要分析方法之一，gc-ms/ms和lc-ms/ms这两种分析方法也是目前检测生物样品中的苯丙胺类药物应用较普遍的方法。虽然已经有相关研究探索过这两种方法来检测头发样本中的苯丙胺类药物，但由于苯丙胺类药物结构中含有胺基等极性基团，毛发中的苯丙胺类物质及其代谢物的含量一般较低，存在着灵敏度和准确度不高，gc-ms/ms实际分析过程中一般需要进行衍生化，使用酰基化将胺基转化为酰胺的技术问题；两种方法处理过程中也存在样品前处理操作较繁琐，不利于快速检测的技术问题。
6.且现在存在着目前在国际标准物质数据库(comar)和国家标准物质资源共享平台都未找到苯丙胺类药物基体标准物质的登记，缺少用于检测的标准物质，导致检测结果的可靠性、准确性和溯源性得不到保障的技术问题。


技术实现要素：

7.为了解决以上技术问题，本发明提供一种苯丙胺类药物头发标准物质的制备方法及应用，用于检测头发样本中苯丙胺类药物，满足法医和临床实验室对苯丙胺类药物基体标准物质的需求，检测方法快速、准确和灵敏。
8.解决以上技术问题的一种苯丙胺类药物头发标准物质的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
9.(1)采集未有违禁药物使用史的成人头发样本和准备苯丙胺类药物纯品原料；
10.(2)将采集的头发样本使用纯水、色谱级甲醇各洗涤3次，室温下干燥后剪切成小于2cm小段；
11.(3)将剪切后的头发样本浸泡在药物-二甲基亚砜溶液中制备标准物质，浸泡24-26天后，将头发样本取出；优化方案中浸泡时间为25天。
12.头发标准物质制备浸泡时间的选择：在头发标准物质制备过程中采用由密到疏的原则，在6个不同的时间点分别取样，使用lc-ms/ms进行分析。
13.(4)将头发样本取出，使用足够体积的甲醇充分清洗；以去除外部污染，以最后一次清洗液检测结果呈阴性为准。
14.(5)洗涤后的头发样本在真空干燥箱中于24-26℃下干燥47-49h，使用球磨机研磨粉碎成深褐色粉末，粒径《5mm；优化方案中为25℃下干燥48h。
15.(6)粉碎后的头发样本在真空干燥箱中干燥22-26h，经混和仪混合22-26h，混匀后装瓶。装入棕色密封玻璃瓶(2ml amb sv 11mm crimp，usa)，每瓶约100mg，保存。
16.所述步骤(1)中苯丙胺类药物纯品原料为甲基苯丙胺，3,4亚甲基二氧基乙基苯丙胺，3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺，替苯丙胺，麻黄碱和苯丙胺共6种。
17.所述步骤(1)中采用gc-ms/ms对6种苯丙胺类药物纯品原料进行定性分析；采用hplc-dad法对6种苯丙胺类药物纯品原料进行纯度确定。
18.定性分析：确定原料为目标化合物；纯度分析：对原料进行筛选，避免因原料纯度过低而导致无法进行后续的定值分析；纯度分析的结果会影响制备头发标准物质中相关药物的定值结果。
19.所述步骤(4)中当头发中的药物浓度达到最大值时，取出头发样本。
20.采用单因素变量法考察不同提取溶剂、不同提取时间、不同的液料比和不同的盐酸浓度对药物提取量的影响，初步确定合理的实验各因素与水平。
21.本发明中一种苯丙胺类药物头发标准物质的应用，包括以下步骤：
22.(1)将检测样品、头发标准物质与空白样品经过相同的前处理操作后，吸取样品提取液进样分析；
23.(2)采用gc-ms/ms或/和lc-ms/ms进行定性分析。
24.所述前处理操作具体为：准确称取制备的头发标准物质，加入等量的甲基苯丙胺-d5内标溶液，加入hcl，在40℃下超声50min，提取液在45℃下氮气蒸发至干，残留物用甲醇复溶，15000xg高速离心5min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析；
25.其中用量上各原料以体积重量计，头发标准物质：甲基苯丙胺-d5内标溶液：hcl：甲醇＝7.5：50：1：500。
26.所述甲基苯丙胺-d5内标溶液质量浓度为1.0ng
·
mg-1
，hcl质量浓度为0.01mol
·
l-1
。
27.头发样品前处理过程，方法简单，具有高灵敏度和高准确度，特异性好。验证了方法的lod、loq、线性、重复性、稳定性、回收率和基质效应。lc-ms/ms法检测限低至0.05pg
·
mg-1
。gc-ms/ms方法不需要经过衍生化过程，可直接用于定性定量分析。
28.本发明中所述gc-ms/ms法中，采用scan模式提取特征离子，根据保留时间和特征
离子相结合进行定性分析，若检测样品中存在与头发标准物质相同的特征离子为2个及以上，保留时间rsd小于3.0％，而空白样本中只检测出内标物的特征离子，未检测出目标物特征离子，则说明检测样品中含有苯丙胺类药物，定性结果准确可靠；
29.所述lc-ms/ms法，采用mrm模式，若检测样品中存在与头发标准物质相同的mrm离子对为2对或2对以上，保留时间与对照品溶液中相应化合物的色谱峰保留时间比较，保留时间rsd小于3.0％，而空白样品只检测出内标物的mrm离子对，未检出目标物mrm离子对，说明检测样品中含有苯丙胺类药物。
30.本发明中gc-ms/ms和lc-ms/ms方法快速、准确和灵敏，用于测定头发中的苯丙胺类药物，前处理简单，无需进行衍生化过程，在苯丙胺类物质的定性定量分析中具有独特的优势，应用愈加广泛。
31.本发明所建立的gc-ms/ms分析方法无需进行衍生化，可以减少分析时间，提高分析准确度，lc-ms/ms方法具有高灵敏度。本发明中两种方法的头发样本制备过程简单易行，均可作为毛发中苯丙胺类药物标准物质的认证方法，可用于法医学领域的药物滥用检测和实验室质量控制。
32.本发明中苯丙胺类药物头发标准物质的方法填补了苯丙胺类药物基体标准物质的空白，满足法医和临床实验室对苯丙胺类药物基体标准物质的需求，使检测结果的可靠性、准确性和溯源性得到保障。
附图说明
33.图1为本发明中6种苯丙胺类药物结构式
34.图2为本发明中甲基苯丙胺纯品原料gc-ms/ms质谱图
35.图3为本发明中3,4亚甲基二氧基乙基苯丙胺纯品原料gc-ms/ms质谱图
36.图4为本发明中3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺纯品原料gc-ms/ms质谱图
37.图5为本发明中替苯丙胺纯品原料gc-ms/ms质谱图
38.图6为本发明中麻黄碱纯品原料gc-ms/ms质谱图
39.图7为本发明中苯丙胺纯品原料gc-ms/ms质谱图
40.图8为本发明中头发标准物质的制备过程(a：采集；b:清洗；c：剪切；d浸泡；e：干燥；f：粉碎；g：混合；h：分装)
41.图9为本发明中不同的提取溶剂对药物浓度的影响
42.图10为本发明中不同提取温度对药物浓度的影响
43.图11为本发明中不同提取时间对药物浓度的影响
44.图12为本发明中不同液料比对药物浓度的影响
45.图13为本发明中不同盐酸酸度对药物浓度的影响
46.图14为本发明中gc-ms/ms中scan模式下苯丙胺类药物色谱图(出峰顺序为从左到右依次是：甲基苯丙胺，甲基苯丙胺-d5，麻黄碱，替苯丙胺，mdma，mdea)
47.图15为本发明中gc-ms/ms中sim模式下苯丙胺类药物色谱图
48.图16为本发明中lc-ms/ms中空白头发样本总离子流图
49.图17为本发明中lc-ms/ms中第4次清洗液总离子流图
50.图18为本发明中lc-ms/ms中6种苯丙胺类纯品药物总离子流图(出峰顺序为从左
到右依次是：麻黄碱，甲基苯丙胺，甲基苯丙胺-d5，替苯丙胺，苯丙胺，mdma，mdea)
51.图19为本发明中lc-ms/ms中头发标准物质总离子流图(出峰顺序为从左到右依次是：麻黄碱，甲基苯丙胺，甲基苯丙胺-d5，替苯丙胺，mdma，mdea)
52.图20为本发明中lc-ms/ms中头发标准物质mrm色谱图
具体实施方式
53.以下是实验中所用的仪器、试剂和样品信息。
54.表1实验仪器信息表
[0055][0056]
表2实验试剂信息表
[0057][0058]
表3实验样品信息表
[0059][0060][0061]
甲基苯丙胺，3,4亚甲基二氧基乙基苯丙胺，3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺，替苯丙胺，麻黄碱和苯丙胺这6种苯丙胺类药物纯品原料由公安部物证鉴定中心提供，经真空包装密封储存于4℃冰箱中。依据重量法，使用甲醇为溶剂，配制高浓度的单一标准溶液，置于冰箱中冷藏保存。在实验过程中，依据分析要求，使用甲醇稀释至所需浓度。6种原料的结构式如图1所示。
[0062]
实施例1
[0063]
采用gc-ms/ms对6种苯丙胺类药物纯品原料进行定性分析。
[0064]
仪器：安捷伦7890a-7000b三重四级杆气质联用仪；色谱柱：db-5ms色谱柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)；进样口温度：280℃；柱温：80℃(1min)-10℃/min-250℃(2min)-20℃/min-300℃(2min)；载气为氦气，纯度≥99.999％，流量:1.0ml/min；样品浓度：5ppm溶于甲醇，进样量1μl；分流进样，分流比：10:1；溶剂延迟时间4min。电子轰击电离源(ei)；电子能量70ev；离子源温度：230℃；接口温度：250℃；scan模式，扫描范围：m/z 50～450。6种苯丙胺类药物的质谱图可与nist标准谱库相匹配，匹配率≥80％，如图2-图7所示。
[0065]
采用hplc-dad法对6种苯丙胺类药物纯品原料进行纯度确定。
[0066]
仪器：安捷伦1200高效液相色谱仪；色谱柱：agilent eclipxe xdb-c18(250
×
4.6mm，5μm)色谱柱；流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：2μl；流动相：0.05％tfa水溶液：0.05％乙腈溶液梯度洗脱30min；检测波长：210nm。采用峰面积归一化法进行纯度检测。甲基苯丙胺纯度99.65％，3,4亚甲基二氧基乙基苯丙胺纯度99.78％，3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺纯度99.82％，替苯丙胺纯度99.98％，麻黄碱纯度99.93％，苯丙胺纯度98.97％。
[0067]
表4 hplc梯度洗脱程序表
[0068][0069]
实施例2
[0070]
苯丙胺类药物头发标准物质的制备方法，步骤如下：
[0071]
(1)采集未有违禁药物使用史的成人头发样本和准备苯丙胺类药物纯品原料；苯丙胺类药物纯品原料为甲基苯丙胺，3,4亚甲基二氧基乙基苯丙胺，3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺，替苯丙胺，麻黄碱和苯丙胺共6种。
[0072]
(2)将采集的头发样本使用纯水、色谱级甲醇各洗涤3次，室温下干燥后剪切成小于2cm小段；
[0073]
(3)将剪切后的头发样本浸泡在药物-二甲基亚砜溶液中制备标准物质，浸泡24-26天后，将头发样本取出；优化方案中浸泡时间为25天。头发标准物质制备浸泡时间的选择：在头发标准物质制备过程中采用由密到疏的原则，在6个不同的时间点分别取样，使用lc-ms/ms进行分析。当头发中的药物浓度达到最大值时，取出头发样本。
[0074]
(4)取出头发样本，使用足够体积的甲醇充分清洗；以去除外部污染，以最后一次清洗液检测结果呈阴性为准。
[0075]
(5)洗涤后的头发样本在真空干燥箱中于24或26℃下干燥47或49h，使用球磨机研磨粉碎成深褐色粉末，粒径《5mm；
[0076]
(6)粉碎后的头发样本在真空干燥箱中干燥22或26h，经混和仪混合22或26h，混匀后装瓶。装入棕色密封玻璃瓶(2ml amb sv 11mm crimp，usa)，每瓶约100mg，保存。
[0077]
以上苯丙胺类药物纯品原料(甲基苯丙胺，3,4亚甲基二氧基乙基苯丙胺，3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺，替苯丙胺和麻黄碱)、苯丙胺、二甲基亚砜溶液、蒸馏水及头发样本质量比为30：5：500：500：400。
[0078]
实施例3
[0079]
称量约30mg甲基苯丙胺，3,4亚甲基二氧基乙基苯丙胺，3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺，替苯丙胺，麻黄碱和5mg苯丙胺置于1000ml瓶中，加入500ml二甲基亚砜溶液(含0.02mol
·
l-1
盐酸)，500ml蒸馏水，超声10min，使之混合均匀，将约40g成人头发浸泡其中，室温下放置。浸泡25天后，倒出浸泡液，头发用甲醇充分清洗4次，取第4次清洗液备用。清洗后的头发样本在室温干燥24h，在真空干燥箱中25℃下干燥48h，使用球磨机剪切粉碎至小于5mm粉末。使用混合仪混合24h，混合均匀后装瓶(约150瓶，每瓶100mg)，室温下避光保存。如图8所示。
[0080]
实施例4
[0081]
一种苯丙胺类药物头发标准物质的应用，步骤如下：
[0082]
(1)将检测样品、头发标准物质与空白样品经过相同的前处理操作后，吸取样品提取液进样分析；
[0083]
前处理操作具体为：准确称取制备的头发标准物质，加入等量的甲基苯丙胺-d5内标溶液，加入hcl，在40℃下超声50min，提取液在45℃下氮气蒸发至干，残留物用甲醇复溶，15000xg高速离心5min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析；其中用量上各原料以体积重量计，比头发标准物质：甲基苯丙胺-d5内标溶液：hcl：甲醇＝7.5：50：1：500。甲基苯丙胺-d5内标溶液质量浓度为1.0ng
·
mg-1
，hcl质量浓度为0.01mol
·
l-1
。
[0084]
(2)采用gc-ms/ms或(和)lc-ms/ms进行定性分析。
[0085]
gc-ms/ms法中，采用scan模式提取特征离子，根据保留时间和特征离子相结合进行定性分析，若检测样品中存在与头发标准物质相同的特征离子为2个及以上，保留时间rsd小于3.0％，而空白样本中只检测出内标物的特征离子，未检测出目标物特征离子，则说明检测样品中含有苯丙胺类药物，定性结果准确可靠；scan模式又称全扫描模式，是常用的定性分析检测模式，具有检测碎片信息多，定性准确的特点。
[0086]
lc-ms/ms法，采用mrm模式，若检测样品中存在与头发标准物质相同的mrm离子对为2对或2对以上，保留时间与对照品溶液中相应化合物的色谱峰保留时间比较，保留时间rsd小于3.0％，而空白样品只检测出内标物的mrm离子对，未检出目标物mrm离子对，说明检测样品中含有苯丙胺类药物。mrm模式是lc-ms/ms法中常用的检测模式，主要用于定量分析。基于头发样本基质的复杂性和样品溶液中药物的极低浓度，采用mrm模式，结合特征离子进行定性分析。对于复杂样品来说，mrm模式具有选择性好和灵敏度高的特点。
[0087]
本实例中采用单因素实验优化头发样本的前处理过程。单因素实验是常用的样品前处理条件优化方法，具有实验次数少，实验效率高等特点。
[0088]
具体的gc-ms/ms法和lc-ms/ms法的操作步骤如下：
[0089]
gc-ms/ms法：色谱柱：db-5ms色谱柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)；柱温：80℃(1min)-10℃/min-250℃(2min)-20℃/min-300℃(2min)；载气为氦气，流量：1.0ml/min；进样口温度：280℃；进样量1μl；分流进样，分流比：10:1；溶剂延迟时间4.0min。电子轰击电离源(ei)；电子能量70ev；离子源温度：230℃；接口温度：250℃；检测模式为：scan/sim。采用选择离子监测模式(sim)按照样品的出峰时间分时间段进行定量分析。第1组监测：5.0min-6.0min。监测m/z 44，91，117，65；第2组监测：6.1min-7.0min。监测m/z 58，91，56；第3组监测：8.5min-13.0min。监测m/z 72，135，136，77，58，59，44，51，105。
[0090]
lc-ms/ms法：仪器：waters tqs三重四级杆液质联用仪；色谱柱：acquity tm uplc hss t3(100mm
×
2.1mm，1.8μm，waters公司)；流动相a：10mmol/l乙酸铵(含0.1％甲酸)；流动相b：乙腈，梯度洗脱；流速：0.2ml/min；柱温：30℃；进样量：2μl；离子源：电喷雾电离-正离子模式(esi+)，温度：150℃；检测方式：多反应监测(mrm)；毛细管电压：1.52kv；脱溶剂气温度：600℃；脱溶剂气流速：800l/h；锥孔气流速：150l/h。
[0091]
依据苯丙胺类药物的结构特点，分析了酸水解法(0.1mol
·
l-1
hcl)、碱水解法(0.1mol
·
l-1
naoh)、甲醇超声水解法对毛发中药物浓度的影响。
[0092]
结果表明，与碱水解法和甲醇超声提取相比，酸水解法后毛发中的药物浓度更高。50℃恒温水浴浸泡24h与50℃超声提取30min，药物浓度相当。实验过程中为了缩短分析时
间，决定采用稀盐酸超声提取法。采用单因素变量法考察了不同提取温度、不同提取时间、不同的液料比和不同的hcl浓度对药物浓度的影响，初步确定合理的实验各因素与水平。
[0093]
结果表明，毛发中的药物浓度随着提取温度的增加而逐渐增加，当提取温度在40℃时，继续提高温度，药物浓度基本不变，有的药物浓度(如mdma)有所下降。推测高温可能会破坏头发的结构，使头发中的其他物质一起溶出，竞争抑制了药物的溶出。头发中的药物浓度随提取时间的增加而增加，当提取时间达到50min时，提取的药物浓度趋向稳定。提取溶剂的增加，有利于头发与溶剂充分接触，当提取溶剂达到2ml时，药物浓度基本不变。盐酸浓度也会影响药物的浓度，ma、mdea、mdma和麻黄碱在盐酸浓度为0.01mol
·
l-1
～1.0mol
·
l-1
范围内时，药物浓度基本不变，当盐酸的浓度增加时，药物浓度显著降低。综合考虑，盐酸的最适浓度为0.01mol
·
l-1
。毛发中6种苯丙胺类化合物的最佳提取条件为：提取溶剂：0.01mol
·
l-1
盐酸，提取温度40℃，提取时间50min，液料比100:1。如图9-图13所示。
[0094]
实施例5
[0095]
头发标准物质的定性分析。
[0096]
将制备的头发标准物质与平行操作的空白头发样本提取液和第4次清洗液作对照，采用gc-ms/ms和lc-ms/ms对制备的头发标准物质进行定性分析。
[0097]
采用gc-ms/ms法进样分析，gc-ms/ms法具体操作步骤如下：
[0098]
仪器：安捷伦7890a-7000b三重四级杆气质联用仪；色谱柱：db-5ms色谱柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)；进样口温度：280℃；柱温：80℃(1min)-10℃/min-250℃(2min)-20℃/min-300℃(2min)；载气为氦气，纯度≥99.999％，流量:1.0ml/min；样品浓度：5ppm溶于甲醇，进样量1μl；分流进样，分流比：10:1；溶剂延迟时间4min。电子轰击电离源(ei)；电子能量70ev；离子源温度：230℃；接口温度：250℃；scan模式，扫描范围：m/z 50～450。
[0099]
结果表明，头发标准物质中含有2对及以上特征离子，保留时间rsd值《0.5％，说明定性结果准确可靠。6种苯丙胺类药物的特征离子如下：甲基苯丙胺：m/z 58，91，56；3,4亚甲基二氧基乙基苯丙胺：m/z 72，135，136，77；3,4-亚甲二氧基甲基苯丙胺：m/z 58，77，59，135；替苯丙胺：m/z 44，136，77，51；麻黄碱：m/z 58，77，105；苯丙胺：m/z 44，91，117，65。如图14和图16-图19中所示。
[0100]
表5对照品溶液与头发标准物质的保留时间表(gc-ms/ms)
[0101][0102]
*：定量离子
[0103]
lc-ms/ms的分析条件：仪器：waters tqs三重四级杆液质联用仪；色谱柱：acquity tm uplc hss t3(100mm
×
2.1mm，1.8μm，waters公司)；流动相a：10mmol/l乙酸铵(含0.1％甲酸)；流动相b：乙腈，梯度洗脱；流速：0.2ml/min；柱温：30℃；进样量：2μl；离子源：电喷雾
电离-正离子模式(esi
+
)，温度：150℃；检测方式：多反应监测(mrm)；毛细管电压：1.52kv；脱溶剂气温度：600℃；脱溶剂气流速：800l/h；锥孔气流速：150l/h；结果表明，空白头发样本提取液和第4次清洗液只检测出了添加的内标物甲基苯丙胺-d5，未检测出苯丙胺类药物，制备的候选头发标准物质中检测出了苯丙胺类药物，排除了外部干扰。将制备的头发标准物质中目标物的两对定性离子对的色谱峰，保留时间与标准溶液中相应化合物的色谱峰保留时间比较，rsd均小于0.5％，符合定性分析的要求。说明阳性结果正确可靠，制备的头发标准物质中含有6种苯丙胺类药物。
[0104]
表6 lc-ms/ms梯度洗脱程序表
[0105][0106][0107]
表7 lc-ms/ms苯丙胺类药物质谱参数
[0108][0109]
*：定量离子
[0110]
表8对照品溶液与头发标准物质的保留时间表(lc-ms/ms)
[0111][0112]-：未检出
[0113]
实施例6
[0114]
以下为相关的试验，以此来说明本发明中检测方法具有高的灵敏度、准确性好。
[0115]
苯丙胺类药物头发标准物质的均匀性检验。
[0116]
采用lc-ms/ms和gc-ms/ms法对制备的头发标准物质进行均匀性检验。根据jjg 1343—2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》的要求，对制备的头发标准物质进行均匀性检验。
[0117]
从分装好的头发标准物质中随机抽取11个样品瓶，采用lc-ms/ms和gc-ms/ms法测定每份样品中6种苯丙胺类药物的含量，每个样品测定3次。采用f检验法判断标准物质的均匀性，若计算得到的f
测得值
小于f
0.05(组间自由度，组内自由度)
，则判断其均匀性合格。
[0118]
gc-ms/ms定量分析方法：采用选择离子监测模式(sim)进行定量分析。
[0119]
第1组监测：5.0min-6.0min。监测m/z 44，91，117，65；第2组监测：6.1min-7.0min。监测m/z 58，91，56；第3组监测：8.5min-13.0min。监测m/z 72，135，136，77，58，59，44，51，105。采用内标工作曲线法进行定量分析，准确称取制备的头发标准物质(约100mg)，加入等量的甲基苯丙胺-d5内标溶液(5.0ng
·
mg-1
，100μl)，加入2ml 0.01mol
·
l-1
hcl，在40℃下超声50min，提取液在45℃下氮气蒸发至干，残留物用400μl甲醇复溶，15000xg高速离心5min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。每份样品测定3次。根据各样品中目标物与内标定量离子对的峰面积比值，按照公式计算出制备的头发标准物质中目标物的质量浓度。
[0120]
lc-ms/ms定量分析方法：采用mrm模式进行定量分析。
[0121]
色谱柱：acquity tm uplc hss t3(100mm
×
2.1mm，1.8μm，waters公司)；流动相a：10mmol
·
l-1
乙酸铵(含0.1％甲酸)；流动相b：乙腈；梯度洗脱程序：0-4min：15％b-28％b；4-5min：28％b；5-10min：28％b-30％b；10-13min：30％b-45％b；13-13.5min：45％b-95％b；13.5-14.5min：95％b-15％b；14.5-20min：15％b；流速：0.2ml/min；柱温：30℃；进样量：2μl；离子源：电喷雾电离-正离子模式(esi
+
)，温度：150℃；检测方式：多反应监测(mrm)；毛细管电压：1.52kv；脱溶剂气温度：600℃；脱溶剂气流速：800l/h；锥孔气流速：150l/h；其他质谱参数见表7。
[0122]
结果表明，gc-ms/ms中，6种苯丙胺类药物的f
测得值
《f
0.05(10,22)
＝2.30；lc-ms/ms中，6种苯丙胺类药物的f
测得值
《f
0.05(10,22)
＝2.30。说明制备的头发标准物质均匀性良好。对gc-ms/ms和lc-ms/ms方法的均匀性结果进行了f检验，结果表明f
测得值
《f
临界值
＝3.982，说明两种方法
的精密度不存在显著性差异。对gc-ms/ms和lc-ms/ms方法的均匀性结果进行了t检验，结果表明t
测得值
《t
临界值
＝2.086，说明两种方法的平均值不存在显著性差异。所建立的gc-ms/ms和lc-ms/ms方法适用于头发样本中苯丙胺类药物的分析。
[0123]
表9 6种苯丙胺类药物均匀性检验结果
[0124][0125][0126]-：未检出
[0127]
表10 gc-ms/ms与lc-ms/ms结果比较，单位为ng
·
mg-1
[0128][0129]-：未检出
[0130]
gc-ms/ms方法学验证：
[0131]
检出限和定量限：在空白头发中加入一系列低浓度的6种苯丙胺类药物混标溶液，
进行gc-ms/ms分析，通过3倍信噪比和10倍信噪比确定检测限(limit ofdetection，lod)和定量限(limit of quantitation，loq)，6种药物的检测限和定量限如下表。结果表明，gc-ms/ms法中，当6种苯丙胺类药物的浓度为0.02～0.05ng
·
mg-1
时，s/n值》3，各个化合物的特征离子峰值明显；当6种苯丙胺类药物的浓度为0.08～0.20ng
·
mg-1
时，s/n值》10，符合定量分析要求。
[0132]
线性与范围：预先配制一系列浓度不同的标准溶液，向标准溶液加入等量的甲基苯丙胺-d5内标溶液，组成混合标准溶液进行分析。每个浓度水平平行测定3次，以目标物与内标定量离子对的峰面积比(y)为纵坐标、目标物质量浓度(x)为横坐标进行线性回归，绘制标准曲线。结果表明，gc-ms/ms中，6种苯丙胺类药物在0.5～5.0ng
·
mg-1
浓度范围内线性关系良好，相关系数》0.999，在标准曲线的最低浓度点时，9种药物的信噪比》10，符合定量分析的要求。
[0133]
日内和日间精密度实验：制备头发提取液，采用gc-ms/ms进行定量分析，连续进样测定6次，计算日内精密度。结果表明，gc-ms/ms中，rsds《8.0％(n＝6)。连续测定5天，日间精密度为rsds《20.0％(n＝30)，说明建立的gc-ms/ms方法重复性良好。
[0134]
稳定性实验：制备头发提取液，并在制备后的不同时间(1、24、48、72、96小时)进样，评估样品的稳定性。结果表明，gc-ms/ms中，rsds《20.0％。苯丙胺类药物头发提取液在室温下96小时内具有良好的稳定性。
[0135]
回收率和基质效应：准确称取9份空白头发样本(约100mg)，按照低、中、高浓度水平，分别加入苯丙胺类药物，每个浓度平行配制3份。使用loctrl、medctrl和hictrl(n＝3)确定回收率。每个样品重复测定3次，记录峰面积值，按照回归方程，计算不同浓度下的回收率。结果表明，gc-ms/ms中的loctrl、medctrl和hictrl的平均回收率分别为85.46-105.3％、90.31-118.7％、91.66-118.3％，rsds≤3.6％。说明方法的准确度较好。
[0136]
通过分析低、中、高浓度的标准溶液在空白头发基质和纯甲醇溶液中得到的峰面积之比来评价基质效应。结果表明，gc-ms/ms中基质效应《20％，rsd《15％，符合分析要求。(me％＝(a/b-1)*100％，a：样品在头发基质中的峰面积；b：样品在甲醇中的峰面积；)
[0137]
lc-ms/ms定量分析方法：采用多反应监测模式(mrm)进行定量分析。根据内标工作曲线法进行定量分析，准确称取制备的头发标准物质(约15mg)，加入等量的甲基苯丙胺-d5内标溶液(1.0ng
·
mg-1
，100μl)，加入2ml 0.01mol
·
l-1
hcl，在40℃下超声50min，提取液在45℃下氮气蒸发至干，残留物用1000μl甲醇复溶，15000xg高速离心5min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤后进样分析。采用lc-ms/ms进行分析，每份样品测定3次。根据各样品中目标物与内标定量离子对的峰面积比值，按照公式计算出制备的头发标准物质中目标物的质量浓度。
[0138]
lc-ms/ms方法学验证：
[0139]
检出限和定量限：通过3倍信噪比和10倍信噪比确定检测限和定量限。结果表明，lc-ms/ms中，6种苯丙胺类药物的检测限为0.05～5.0pg
·
mg-1
，定量限为0.30～20.0pg
·
mg-1
，表明仪器灵敏度较好。该方法的检出限远低于《涉毒人员毛发样本检测规范》中规定的阈值，符合毛发中毒品的检测要求。
[0140]
线性与范围：预先配制一系列浓度不同的6种标准溶液，向标准溶液加入等量的甲基苯丙胺-d5内标溶液，组成混合标准溶液进行分析，采用内标工作曲线法进行定量分析。
结果表明，lc-ms/ms中，6种苯丙胺类药物在60.0～500.0pg
·
mg-1
浓度范围内线性关系良好，相关系数》0.999，符合定量分析要求。
[0141]
日内和日间精密度实验：制备头发提取液，采用lc-ms/ms进行定量分析，连续进样测定6次，计算日内精密度。结果表明，lc-ms/ms中，rsds《5.0％(n＝6)。连续测定5天，日间精密度为rsds《5.0％(n＝30)。
[0142]
通过分析低、中、高浓度的标准溶液在空白头发基质和纯甲醇溶液中得到的峰面积之比来评价基质效应。结果表明，lc-ms/ms中基质效应《20％，rsd《15％，符合分析要求。相关结果如图15和图20中所示。
[0143]
表11 6种苯丙胺类化合物的检测限和定量限
[0144][0145]
表12苯丙胺类药物的线性与范围
[0146][0147]
表13苯丙胺类药物重复性实验结果
[0148][0149][0150]
表14苯丙胺类药物稳定性实验结果
[0151][0152]
表15苯丙胺类药物的回收率与基质效应
[0153][0154]
实施例7
[0155]
苯丙胺类药物头发标准物质定值分析。
[0156]
苯丙胺类药物头发标准物质中6种苯丙胺类药物含量的定值由单一实验室采用。lc-ms/ms和gc-ms/ms 2种方法对各药物的含量进行定值。具体方法如实施例
[0157]
由均匀性检验结果可知，制备的头发样品中6种苯丙胺类药物的浓度为1.011-3.917ng
·
mg-1
，rsds《5.6％。
[0158]
实施例8
[0159]
苯丙胺类药物头发标准物质的稳定性检验。
[0160]
苯丙胺类化合物头发标准物质的稳定性检验包括60℃避光14天短期稳定性实验和25℃
±
5℃避光12个月长期稳定性检验。
[0161]
以检测时间为自变量，以头发标准物质中苯丙胺类药物的含量为因变量进行线性回归，计算拟合直线的斜率(b1)、截距(b0)、标准偏差(s)和斜率不确定度s
(b1)
。若b1《t
·s(b1)
，表明直线斜率不显著，制备的头发标准物质稳定性良好。
[0162]
短期稳定性实验：在高温条件(60℃)下考察制备的标准物质的短期稳定性。具操作步骤为将制备好的头发标准物质置于烘箱中，设定温度60℃，在0、1、3、5、7、14天分别取出样品进行分析。使用lc-ms/ms考察制备的头发标准物质于0、1、3、5、7、14天内的稳定性。每次随机抽取3瓶样品，每个瓶子取一个子样(约15mg)，采用lc-ms/ms进行分析，每个样品测定3次，计算平均值，把3个瓶子的测量结果平均值作为检测结果。
[0163]
长期稳定性实验：在常温储存条件(25℃
±
5℃)下考察标准物质的长期稳定性，使用lc-ms/ms考察制备的头发标准物质在0、1、2、3、5、12个月内的稳定性。
[0164]
实施例9
[0165]
头发标准物质中6种苯丙胺类药物含量定值结果的不确定度评定。
[0166]
具体操作步骤如下：
[0167]
(1)建立数学模型。头发中9种芬太尼类药物的含量测定公式为：式中:x为头发样品中芬太尼类药物的含量，ng/mg；y为头发提取液中芬太尼类药物与内标定量离子对的峰面积比；a为线性方程的截距；b为线性方程的斜率；m1为复溶溶剂的质量，mg；m2为头发样品的质量，mg。
[0168]
(2)分析不确定度来源。结合数学模型和测定方法，对头发中9种芬太尼类药物测定结果有影响的各种不确定度分量的来源进行分析，具体引入的不确定度来源有标准溶液配制引入的不确定度、标准曲线拟合引入的不确定度、测量重复性引入的不确定度、样品前处理引入的不确定度和分析仪器引入的不确定度。
[0169]
(3)对头发标准物质中6种苯丙胺类药物的不确定度分量分别进行评定，计算标准不确定度和扩展不确定度。
[0170]
本发明中采用浸泡法制备了一种含有苯丙胺类药物的头发样本，该头发样本中含有苯丙胺、甲基苯丙胺、mdea、mdma、mda和麻黄碱，共6种苯丙胺类药物。对制备的头发样本进行f检验可知，制备的头发样本均匀性良好。后续对其进行研究，有望为法庭科学滥用药物检测量值溯源提供参考。采用单因素变量法优化了头发样本的前处理过程，采用酸水解结合超声法对头发样本进行提取，其操作过程简便快捷。建立的头发中苯丙胺类药物的lc-ms/ms和gc-ms/ms分析方法，具有高灵敏度、高准确度和高特异性。方法中，药物的检测限低至0.05pg
·
mg-1，可以满足头发中痕量药物的分析检测要求。将lc-ms/ms和gc-ms/ms的测定结果相关联进行分析。结果表明两种分析方法的偏差《15％，均适用于分析头发中的苯丙胺类药物。
[0171]
上述实施/试验例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。