一种家用型宫颈癌筛查试剂卡的制作方法

1.本技术属于免疫学技术领域，具体涉及一种家用型宫颈癌筛查试剂卡。


背景技术：

2.宫颈癌是最为常见的妇科恶性肿瘤之一，据统计，原位癌高发年龄为30-35岁左右，浸润癌高发年龄为45-55岁左右，且近年来宫颈癌的发病有年轻化的趋势。定期进行宫颈癌筛查有助于使宫颈癌和癌前病变得以在早期发现和治疗，降低宫颈癌的发病率和死亡率。
3.细胞癌变表现为细胞无限制增殖，即细胞周期调控失控。正常的p16蛋白对癌症有抑制作用。但是p16的表达异常（如突变、缺失、甲基化失活）则会使其抑癌作用消失，研究调查表明，在hpv感染的样本中，有约42% p16表达阳性，这其中有一部分后续发展为了宫颈癌，所以，p16蛋白在宫颈癌预测中有重要作用。一般结合ki-67结果，做出判断。
4.人的细胞分裂方式为有丝分裂，有丝分裂一般分为休整期（g0）、分裂间期（g1、s、g2）、分裂期（m）。ki-67是一种与细胞周期相关的蛋白，在除g0期外均有表达，当细胞进入休整期后，ki-67会迅速降解掉，所以，在正常分裂的细胞中ki-67表达量极少或呈阴性。当细胞发生癌变，开始无限增殖的时候，细胞跳过g0期无限循环分裂增殖，ki-67蛋白无法降解，造成ki-67蛋白堆积，表达量上升。有研究表明，ki-67在nilm、cinⅰ、cinⅱ、cin
ꢀⅲ
、scc中阳性率分别为14.3%、30%、96.9%、100%、100%，可见ki-67蛋白随宫颈上皮内瘤变增生程度的加重逐步呈现增加的趋势。
5.目前，宫颈癌的检测主要包含：tct检测、免疫组化检测、pcr检测、阴道镜检测等四个方面，但上述四种检测方法均存在各自的缺陷。tct检测：取样过程、样本处理方法复杂，检测时对检测人员及设备专业要求高。免疫组化检测：该方法的专业性较高，实验时间长，由于各种因素会导致组间存在差异，重复性相对较差，且费用较高。pcr检测：其检测的目标为hpv病毒及分型，优点是准确度高，但是对操作人员技术要求高，流程复杂，实验费用较高。阴道镜检测：对患者身体伤害较大，专业要求高，费用较高。总而言之，以上技术存在专业要求高、流程复杂、耗时长、对使用场地要求高、价格昂贵等缺点，均不适用于家用型。
6.因此，有必要开发一种操作简单、耗时短、费用低的检测方式，使检测者在家即可完成整个取样检测流程，结果简单易懂，无需检测者自身具备相关的专业知识。


技术实现要素：

7.为了解决上述问题，本技术公开了一种家用型宫颈癌筛查试剂卡，该试剂卡分别采用p16点膜抗体溶液和ki-67点膜抗体溶液喷点在硝酸纤维素膜上获得p16检测线和ki-67检测线，通过对两条检测线检测结果合并进行分析，可以对多种身体状况进行评估，可提高检测的准确性，另外，该试剂卡的使用方法简单、结果简单易懂，使用者可直接在家进行检测，更能保护患者隐私，有效的降低了患者在生理、心理以及经济上的负担。
8.本技术提供一种家用型宫颈癌筛查试剂卡，采用如下的技术方案：
一种家用型宫颈癌筛查试剂卡，包括底板、样品垫、乳胶结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，所述检测线包括p16检测线和ki-67检测线，所述p16检测线、ki-67检测线和质控线彼此平行，所述p16检测线和ki-67检测线分别通过将p16点膜抗体的溶液和ki-67点膜抗体的溶液喷点在硝酸纤维素膜上获得。
9.作为优选，所述的家用型宫颈癌筛查试剂卡，采用如下方法制备而成：蓝色乳胶颗粒标记生物素；红色乳胶颗粒标记p16标记抗体和ki-67标记抗体；乳胶结合垫的制备；硝酸纤维素膜的制备；样品垫的制备；试剂卡的组装；样本处理液的制备。
10.作为优选，所述蓝色乳胶颗粒标记生物素的步骤具体为：用pbs把蓝色乳胶颗粒稀释成1%的终浓度，加入生物素使其终浓度为0.1mg/ml，4℃反应过夜；加入浓度为1%的bsa封闭1h，离心，去上清，沉淀用含0.1% bsa的pbs复溶，置于4℃备用。
11.作为优选，所述红色乳胶颗粒标记p16标记抗体和ki-67标记抗体的步骤包括：红色乳胶颗粒标记p16标记抗体：用pbs把红色乳胶颗粒稀释成1%的终浓度，加入p16标记抗体使其终浓度为0.5 mg/ml，4℃反应过夜；加入浓度为1%的bsa封闭1h，离心，去上清，沉淀用含0.1%bsa的pbs复溶，置于4℃备用；红色乳胶颗粒标记ki-67标记抗体：用pbs把红色乳胶颗粒稀释成1%的终浓度，加入ki-67标记抗体使其终浓度为0.5 mg/ml，4℃反应过夜；加入浓度为1%的bsa封闭1h，离心，去上清，沉淀用含0.1%bsa的pbs复溶，置于4℃备用。
12.作为优选，所述乳胶结合垫的制备步骤包括：p16乳胶结合垫的制备：用含0.1%bsa的pbs将蓝色乳胶颗粒标记生物素和红色乳胶颗粒标记p16标记抗体按一定比例混合稀释，分别将蓝色乳胶颗粒稀释成0.2%的终浓度，将红色乳胶颗粒稀释成0.2 %的终浓度，用机器喷点在聚酯膜上，37℃烘干3小时，密封好置于室温备用；ki-67乳胶结合垫的制备：用含0.1%bsa的pbs将蓝色乳胶颗粒标记生物素和红色乳胶颗粒标记ki-67标记抗体按一定比例混合稀释，蓝色乳胶颗粒稀释成0.2%的终浓度，红色乳胶颗粒稀释成0.2 %的终浓度，用机器喷点在聚酯膜上，37℃烘干3小时，密封好置于室温备用。
13.作为优选，所述硝酸纤维素膜的制备步骤包括：硝酸纤维素膜的封闭：配制膜封闭液，将硝酸纤维素膜浸泡于膜封闭液中2小时，37℃烘干2小时，密封好置于室温备用；抗体稀释和喷点：配制检测线稀释液，用pbs将链霉亲和素稀释至2 mg/ml，用检测线稀释液分别将p16点膜抗体、ki-67点膜抗体进行稀释，p16点膜抗体稀释至0.3 mg/ml，ki-67点膜抗体稀释至0.3 mg/ml；用点膜机分别将以上稀释后的链霉亲和素和点膜抗体喷点在封闭后的硝酸纤维素膜上的质控区和测试区的p16、ki-67位置，得到质控线、p16检测线和ki-67检测线，37℃烘干3小时，密封好置于室温备用。
14.作为优选，所述膜封闭液包括：4-8 g/l的tris、1-3 g/l的bsa、4-8 g/l的聚乙烯吡咯烷酮和20-30 g/l的蔗糖；所述检测线稀释液包括：0.01m的pbs、2-3 g/l的聚乙烯醇、2-3 mg/l的吐温-20、175-195 mg/l的edta和12-18 g/l的海藻糖。
15.发明人在实验中发现，膜封闭液中用缓冲液tris和表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮配合保护剂bsa和蔗糖可有效解决检测时背景泛红的现象，有助于提高特异性；另外，在检测线稀释液中用具有乳化作用的聚乙烯醇、具有增容作用的吐温-20、络合剂edta和保护剂海藻糖可以有效提高试剂条的检测灵敏度和稳定性。
16.作为优选，所述膜封闭液包括：5g/l的tris、1.5g/l的bsa、5g/l的聚乙烯吡咯烷酮和25g/l的蔗糖；所述检测线稀释液包括：0.01m的pbs、2.5g/l的聚乙烯醇、2.5 mg/l的吐温-20、186mg/l的edta和15g/l的海藻糖。
17.发明人在实验中发现，采用上述配方份膜封闭液和检测线稀释液具有更优的提高灵敏度、降低底板背景的作用。
18.作为优选，所述样品垫的制备步骤具体为：用50mm 磷酸盐缓冲液（0.5% caseina，0.5% peg8000）浸泡样本垫2 h，置于37 ℃真空干燥6 h；所述试剂卡的组装步骤具体为：将硝酸纤维素膜粘贴在底板上，在硝酸纤维素膜靠近检测线的一端依次叠加粘贴乳胶结合垫和样品垫，在硝酸纤维素膜靠近质控线的一端叠加粘贴吸收垫，然后切成相应宽度装入塑料卡中，待用。
19.作为优选，所述样本处理液的制备步骤具体为：称取nacl 9g、edta-4na 6g和tritonx-100 8ml溶于0.8l的纯化水中，完全溶解后定容至1l。
20.本技术具有如下的有益效果：（1）本技术的家用型宫颈癌筛查试剂卡，分别采用p16点膜抗体溶液和ki-67点膜抗体溶液喷点在硝酸纤维素膜上获得p16检测线和ki-67检测线，通过对两条检测线检测结果合并进行分析，可以对多种身体状况进行评估，可提高检测的准确性，另外，该试剂卡的使用方法简单、结果简单易懂，使用者可直接在家进行检测，更能保护患者隐私，有效的降低了患者在生理、心理以及经济上的负担。
21.（2）本技术以缓冲液tris和表面活性剂聚乙烯吡咯烷酮配合保护剂bsa和蔗糖作为膜封闭液，可有效解决检测时背景泛红的现象，有助于提高特异性；并采用具有乳化作用的聚乙烯醇、具有增容作用的吐温-20、络合剂edta和保护剂海藻糖作为检测线稀释液，可以有效提高试剂条的检测灵敏度和稳定性；二者配合可以有效提高试剂卡的检测灵敏度，获得干净的底板背景。
附图说明
22.下面结合附图和实施例对本技术进一步说明。
23.图1是本技术的家用型宫颈癌筛查试剂卡的结构示意图。
具体实施方式
24.现在结合实施例对本技术作进一步详细的说明。
25.如图1所示，家用型宫颈癌筛查试剂卡包括底板、样品垫、乳胶结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线包括p16检测线和ki-67检测线，p16检测线、ki-67检测线和质控线彼此平行，p16检测线和ki-67检测线分别通过将p16点膜抗体的溶液和ki-67点膜抗体的溶液喷点在硝酸纤维素膜上获得。
26.本技术中提到的百分比浓度均为质量百分比浓度；本技术中所用的pbs均为浓度0.01m、ph 7.4的pbs缓冲液；本技术中所用的bsa为牛血清白蛋白。
27.家用型宫颈癌筛查试剂卡的制备：蓝色乳胶颗粒标记生物素：用pbs（0.01m、ph 7.4）把蓝色乳胶颗粒稀释成1%的终浓度，加入生物素使其终浓度为0.1mg/ml，4℃反应过夜；加入浓度为1%的bsa封闭1h，离心，去上清，沉淀用含0.1% bsa的pbs复溶，置于4℃备用。
28.红色乳胶颗粒标记p16标记抗体和ki-67标记抗体：红色乳胶颗粒标记p16标记抗体：用pbs（0.01m、ph 7.4）把红色乳胶颗粒稀释成1%的终浓度，加入p16标记抗体使其终浓度为0.5 mg/ml，4℃反应过夜；加入浓度为1%的bsa封闭1h，离心，去上清，沉淀用含0.1%bsa的pbs复溶，置于4℃备用；红色乳胶颗粒标记ki-67标记抗体：用pbs把红色乳胶颗粒稀释成1%的终浓度，加入ki-67标记抗体使其终浓度为0.5 mg/ml，4℃反应过夜；加入浓度为1%的bsa封闭1h，离心，去上清，沉淀用含0.1%bsa的pbs复溶，置于4℃备用。
29.乳胶结合垫的制备：p16乳胶结合垫的制备：用含0.1%bsa的pbs将蓝色乳胶颗粒标记生物素和红色乳胶颗粒标记p16标记抗体按一定比例混合稀释，分别将蓝色乳胶颗粒稀释成0.2%的终浓度，将红色乳胶颗粒稀释成0.2 %的终浓度，用机器喷点在聚酯膜上，37℃烘干3小时，密封好置于室温备用；ki-67乳胶结合垫的制备：用含0.1%bsa的pbs将蓝色乳胶颗粒标记生物素和红色乳胶颗粒标记ki-67标记抗体按一定比例混合稀释，蓝色乳胶颗粒稀释成0.2%的终浓度，红色乳胶颗粒稀释成0.2 %的终浓度，用机器喷点在聚酯膜上，37℃烘干3小时，密封好置于室温备用。
30.硝酸纤维素膜的制备：硝酸纤维素膜的封闭：配制膜封闭液，将硝酸纤维素膜浸泡于膜封闭液中2小时，37℃烘干2小时，密封好置于室温备用；抗体稀释和喷点：配制检测线稀释液，用pbs将链霉亲和素稀释至2 mg/ml，用检测线稀释液分别将p16点膜抗体、ki-67点膜抗体进行稀释，p16点膜抗体稀释至0.3 mg/ml，ki-67点膜抗体稀释至0.3 mg/ml；用点膜机分别将以上稀释后的链霉亲和素和点膜抗体喷点在封闭后的硝酸纤维素膜上的质控区和测试区的p16、ki-67位置，得到质控线、p16检测线和ki-67检测线，37℃烘干3小时，密封好置于室温备用。图1所示为p16检测线在前，ki-67检测线在后的设置方式，在具体制备过程中，也可以ki-67检测线在前，p16检测线在后。
31.样品垫的制备：用50mm 磷酸盐缓冲液（0.5% caseina，0.5% peg8000）浸泡样本垫2 h，置于37 ℃真空干燥6 h。
32.试剂卡的组装：将硝酸纤维素膜粘贴在底板上，在硝酸纤维素膜靠近检测线的一端依次叠加粘贴两个乳胶结合垫（p16乳胶结合垫和ki-67乳胶结合垫）和样品垫，在硝酸纤
维素膜靠近质控线的一端叠加粘贴吸收垫，然后切成相应宽度装入塑料卡中，待用。如图1所示，p16乳胶结合垫和ki-67乳胶结合垫的前后顺序与p16检测线和ki-67检测线的前后顺序相互对应。如果硝酸纤维素膜上的ki-67检测线在前，p16检测线在后，则相应地将ki-67乳胶结合垫设置在前，将p16乳胶结合垫设置在后。
33.样本处理液的制备：称取nacl 9g、edta-4na 6g和tritonx-100 8ml溶于0.8l的纯化水中，完全溶解后定容至1l。
34.家用型宫颈癌筛查试剂卡的应用：使用者在家自行用自采宫颈刷收集宫颈脱落细胞，然后将附着有宫颈脱落细胞的宫颈刷放入样本处理液中，震荡混合后加到试剂卡的加样区（样品垫上），在毛细作用下标本向吸收垫一端层析，将乳胶结合垫上的乳胶抗体结合物复溶并继续层析到硝酸纤维素膜上。若标本中含有p16蛋白，则在p16检测线位置形成红色乳胶*p16标记抗体-p16蛋白-p16点膜抗体复合物，出现一条红色的条带；若标本中含有ki-67蛋白，则在ki-67检测线位置形成红色乳胶*ki-67标记抗体-ki-67蛋白-ki-67点膜抗体复合物，出现一条红色的条带；若标本中不含p16或ki-67蛋白，则不能形成复合物，不出现条带。不论标本中是否含有p16或ki-67蛋白，质控区的链霉亲和素均能捕获蓝色乳胶*生物素，形成蓝色乳胶*生物素-链霉亲和素复合物，质控线位置从而出现一条蓝色的条带。最后比较2条检测线，若ki-67阳性p16阴性，提示低危型hpv病变，如一部分lsils和几乎所有的尖锐湿疣；若p16阳性ki-67阴性，提示宫颈鳞状上皮低度病变；若ki-67和p16均阳性，则提示宫颈鳞状上皮高度病变；若二者均为阴性，则提示正常。
35.膜封闭液的制备：分别按照以下各个膜封闭液的要求称取各组分加入纯化水中溶解混匀得到膜封闭液：膜封闭液1：含tris 4 g/l、bsa 3 g/l、聚乙烯吡咯烷酮4 g/l及蔗糖30 g/l的溶液。
36.膜封闭液2：含tris 8 g/l、bsa 1 g/l、聚乙烯吡咯烷酮8g/l及蔗糖20 g/l的溶液。
37.膜封闭液3：含tris 5 g/l、bsa 1.5 g/l、聚乙烯吡咯烷酮5 g/l及蔗糖25 g/l的溶液。
38.膜封闭液4：含tris 5 g/l、bsa 1.5 g/l、聚乙烯吡咯烷酮5 g/l及蔗糖5 g/l的溶液。
39.膜封闭液5：含tris 5 g/l、bsa 1.5 g/l、聚乙烯吡咯烷酮5 g/l及蔗糖50 g/l的溶液。
40.膜封闭液6：含tris 5 g/l、bsa 1.5 g/l、聚乙烯吡咯烷酮2 g/l及蔗糖25 g/l的溶液。
41.膜封闭液7：含tris 5 g/l、bsa 1.5 g/l、聚乙烯吡咯烷酮20 g/l及蔗糖25 g/l的溶液。
42.膜封闭液8：含tris 5 g/l、bsa 1.5 g/l、聚乙烯吡咯烷酮5 g/l及海藻糖25 g/l的溶液。
43.膜封闭液9：含tris 5 g/l、bsa 1.5 g/l、聚乙烯吡咯烷酮5 g/l及葡聚糖25 g/l
的溶液。
44.膜封闭液10：含tris 5 g/l、bsa 1.5 g/l、聚乙烯醇5g/l及蔗糖25 g/l的溶液。
45.检测线稀释液的制备：分别按照以下各个检测线稀释液的要求称取各组分加入pbs缓冲液中溶解混匀得到检测线稀释液：检测线稀释液1：含聚乙烯醇 2 g/l、吐温-20 3 mg/l、edta 175 mg/l、海藻糖 18 g/l及pbs 0.01m的溶液。
46.检测线稀释液2：含聚乙烯醇 3 g/l、吐温-20 2 mg/l、edta 195 mg/l、海藻糖 12 g/l及pbs 0.01m的溶液。
47.检测线稀释液3：含聚乙烯醇 2.5 g/l、吐温-20 2.5 mg/l、edta 186 mg/l、海藻糖 15 g/l及pbs 0.01m的溶液。
48.检测线稀释液4：含聚乙烯醇 2.5 g/l、吐温-20 2.5 mg/l、edta 186 mg/l、海藻糖 5 g/l及pbs 0.01m的溶液。
49.检测线稀释液5：含聚乙烯醇 2.5 g/l、吐温-20 2.5 mg/l、edta 186 mg/l、海藻糖 25 g/l及pbs 0.01m的溶液。
50.检测线稀释液6：含聚乙烯醇 2.5 g/l、吐温-20 1 mg/l、edta 186 mg/l、海藻糖 15 g/l及pbs 0.01m的溶液。
51.检测线稀释液7：含聚乙烯醇 2.5 g/l、吐温-20 5 mg/l、edta 186 mg/l、海藻糖 15 g/l及pbs 0.01m的溶液。
52.检测线稀释液8：含吐温-20 2.5 mg/l、edta 186 mg/l、海藻糖15g/l及pbs 0.01m的溶液。
53.检测线稀释液9：含聚乙烯醇 2.5 g/l、吐温-20 2.5 mg/l、edta 186 mg/l、蔗糖 15 g/l及pbs 0.01m的溶液。
54.检测线稀释液10：含聚乙烯吡咯烷酮 2.5 g/l、吐温-20 2.5 mg/l、edta 186 mg/l、海藻糖 15 g/l及pbs 0.01m的溶液。
55.灵敏度检测：分别用上述膜封闭液和检测线稀释液交叉组合制备不同的家用型宫颈癌筛查试剂卡，用样本处理液将人宫颈癌细胞稀释至1
×
10
7 个/ml、1
×
10
5 个/ml，然后用所制备的家用型宫颈癌试剂卡进行检测，记录实验结果，每个浓度重复检测三次，分别见表1、表2。
56.表1 人宫颈癌细胞浓度为1
×
10
7 个/ml时的实验结果
表1续
表2人宫颈癌细胞浓度为1
×
105个/ml时的实验结果
表2续
结合表1和表2可以看出，膜封闭液1-3搭配检测线稀释液1-3时，能够对高浓度样本和低浓度样本的检测都获得较好的检测结果，灵敏度高，获得的底板背景干净。
57.其中，膜封闭液4和检测线稀释液5的组合中，虽然只是膜封闭液4中将膜封闭液3中的蔗糖替换为海藻糖，检测线稀释液5中将检测线稀释液3中的海藻糖替换为蔗糖，但检测的灵敏度变差，且存在背景干扰。这可能是由于蔗糖具有较高的玻璃化转变温度和粘度保护效果，不会给制剂本身带来其它方面的影响，用于膜封闭液中有利于获得干净的背景；海藻糖对蛋白的稳定、保护效果较蔗糖等其它糖类保护剂更好，所以将海藻糖放在检测线稀释液中效果更好。
58.其中，膜封闭液6和检测线稀释液6的组合中，虽然只是膜封闭液6中将膜封闭液3中的聚乙烯吡咯烷酮替换为聚乙烯醇，检测线稀释液6中将检测线稀释液3中的聚乙烯醇替换为聚乙烯吡咯烷酮，但低值时（人宫颈癌细胞浓度为1
×
10
5 个/ml）检测的灵敏度变差，且高值和低值情况下均存在背景干扰。这可能是由于聚乙烯吡咯烷酮是既具有亲水性、成膜性还具有生理相容性的表面活性剂，可以在保证底板背景干净的前提下不破坏吸附在膜上的抗体。而对于聚乙烯醇，其具有相容性、乳化性，通过实验发现，聚乙烯醇在检测线稀释液的性能作用上优于聚乙烯吡咯烷酮。
59.从膜封闭液4-7与其余检测线稀释液的组合情况来看，膜封闭液中蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮的过多或过少都会对背景或检测灵敏度造成一定的影响，因此需将其设定在一定范围内。从检测线稀释液4-7与其余膜封闭液的组合情况来看，检测线稀释液中海藻糖和吐温-20的过多或过少会对灵敏度有一定的影响，因此需设定在一定范围内。
60.特异性检测：检测以下浓度的干扰物和交叉物对宫颈癌试剂条的性能影响情况，见表3、表4。
61.表3表4从表3和表4可知，以上干扰物质及交叉物质各自浓度范围内，用本试剂条进行检测，p16、ki-67均不能检出，说明以上干扰物质及交叉物质各自浓度范围内不影响试剂的特异性。
62.稳定性检测：将以膜封闭液3和检测线稀释液3的组合所制备的家用型宫颈癌筛选试剂卡在37℃条件下放置，并分别于第1、3、6、9、12个月取出试剂条，用高值（1
×
10
7 个/
ml）、中值（1
×
10
6 个/ml）、低值（1
×
10
5 个/ml）三个浓度样本对试剂卡进行重复性检测试验，每个浓度检测3次，记录3次测量的检测线强度，记录成表，结果见表5：表5从表5可以看出，本技术所制备的试剂卡的稳定性良好。
63.本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项申请技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项申请的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。