精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法及ELISA检测试剂盒与流程

精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法及elisa检测试剂盒
技术领域
1.本发明专利涉及一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法及elisa检测试剂盒。


背景技术：

2.293细胞是人肾上皮细胞系，有多种衍生株，比如hek293，293t/17等，来源都是人胚胎肾细胞，也常被称作“工具细胞”，实验中常使用它来进行，慢病毒包装生产及滴度测定，细胞转染，条件培养基制作，蛋白表达验证等试验。其在生物制品产业化应用价值优点如下：1)293细胞比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株，多用于瞬时转染表达重组蛋白；2)生长快，生长密度高，转染效率和外源蛋白表达量较高，遗传背景清楚，生理代谢稳定；3)贴壁培养、微载体培养、无血清悬浮培养三种方式均可用于293细胞的大规模培养；4)具有很高的质粒转染效率和对保持外源基因的高稳定性；5)对外界微环境较为敏感，可用于药物发现及细胞毒性测试。
3.293中重组表达生产某些蛋白质，这些蛋白质产品中有许多是用于人类和动物的治疗剂，因此，必须高度提纯。这些产品的制造和纯化过程中，存在来自293宿主细胞蛋白(hcp)杂质的可能性。这些杂质会降低治疗药物的疗效，并导致不良的毒性或免疫反应，因此需要将hcp杂质降至最低水平。
4.hcp又称宿主细胞蛋白，是生物制品的关键质量属性，影响着生物制品的质量、安全性与有效性。夹心法elisa检测试剂盒是检测hcp残留的金标准。然而，这种方法高度依赖于试剂盒中hcp抗体对于总宿主细胞蛋白的覆盖率。若elisa检测中使用的抗体覆盖率不足，可能在最终产品中漏检某些残留的hcp，进而可能在用药患者中引起免疫反应和其他药物安全性问题。美国药典ups 1132对hcp抗体覆盖率检测提出了新的要求，建议使用2d-sds-page/western或dige方案对elisa检测试剂盒中hcp抗体进行覆盖率验证。
5.本试剂盒采用微量滴度板免疫酶联免疫测定(elisa)方法。该方法使用的抗体是经过dige法检测过的高覆盖率抗体，平台特异性的hcp抗体覆盖率越高，对hcp的定量越准确，因此，本发明是针对293宿主细胞蛋白(hcp)残留进行更加精确的快速评估。


技术实现要素：

6.本发明的目的是提供一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法。
7.一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的方法，其特征在于其步骤包括：
8.(1)选取目标293宿主细胞，进行培养表达，获取293宿主细胞蛋白；
9.(2)用293宿主细胞蛋白免疫动物，获得抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体；
10.(3)利用准确的覆盖率检测方法对纯化后的抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体进检
测；
11.(4)选择其中覆盖率最高的多克隆抗体，采用elisa法检测样本中残留的293宿主细胞蛋白。
12.优选的，步骤(1)中所述的目标293宿主细胞为atcc-crl-1573、atcc-acs-4500、atcc-crl-3216。
13.优选的，步骤(2)中的动物选择家兔。
14.优选的，步骤(2)中免疫次数为5次，分别为在第0、14、28、42、56天进行，其中最后一次免疫为冲击免疫。
15.优选的，步骤(3)中的检测方法为蛋白质荧光差异双向电泳法。
16.本发明还公开了一种精确定量检测生物医药制品中残留293宿主细胞蛋白的elisa检测试剂盒，其特征在于含有上述筛选出的抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体。
17.优选的，所述试剂盒包括：
18.包被有上述筛选出的抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体的elisa微孔板；
19.步骤(1)获得的293宿主细胞蛋白；
20.生物素标记的上述筛选出的抗293宿主细胞蛋白多克隆抗体；
21.标记物hrp偶联的链霉素(抗生物素的蛋白)；
22.elisa洗液浓缩液；
23.elisa稀释液；
24.elisa显色底物tmb；
25.终止液。
26.本发明利用含有高覆盖率的293hcp抗体的elisa试剂盒来定量检测生物医药制品中残留的293hcp蛋白，检测结果可信度高，效率高，能够同时对多个样本进行检测，检测灵敏度高。
附图说明
27.图1. 293全蛋白2d dige技术凝胶图。
28.图2.用cy3标记的293宿主细胞全蛋白dige凝胶图。
29.图3. cy5检测抗293hcp抗体dige凝胶图。
30.图4.本发明检测试剂盒的293全蛋白标准曲线。
具体实施方式
31.下面结合实施例及对比例对本发明作进一步详细、完整地说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量，除非特别说明。
32.以下实施例的实验中所用到的动物、仪器设备、试剂及其配制等均来自市售。
33.293细胞株：atcc-crl-1573、atcc-acs-4500、atcc-crl-3216
34.细胞培养基：高糖的dmem培养基，yeasen公司
35.高压均质机：ats ah-1500
36.高速冷冻离心机：thermo heraeus mutifuge x1r
37.弗氏完全佐剂：sigma公司
38.弗氏不完全佐剂：sigma公司
39.亲和层析protein g介质：seplife公司
40.ief等电聚焦电泳仪；cytiva ettan
tm ipgphor
tm 3
41.多功能激光成像仪：cytiva amersham typhoon
42.本发明中所使用的其它生物试剂和化学试剂，如无特别说明，均为分析纯或分析纯以上级别。
43.实施例1兔抗293宿主细胞全蛋白抗体的制备
44.1.293宿主细胞全蛋白的制备
45.细胞培养收获：取上述3种细胞株各1支，将细胞接种到细胞培养瓶中，加入含10％小牛血清的培养基，适宜的培养液后置37
±
1℃培养。待复苏细胞生长成致密单层后用胰酶消化293细胞进行传代扩增，置35
±
1℃培养25天收获。用胰酶进行消化，以3500rpm、4℃离心30分钟，收集细胞沉淀。作为裂解蛋白制备样品源备用。
46.细胞破碎：将上述培养获得细胞株的细胞体混合，加入4℃预冷的0.01m pbs缓冲溶液(ph：7.4)500ml，于磁力搅拌器上搅拌至完全混匀。采用高压均质机(ats ah-1500)高压破碎以上细胞体混悬液，调节均质阀，控制破细胞压力为500bar。重复以上高压破碎过程3-4遍。高速冷冻离心机(thermo heraeus mutifuge x1r)离心澄清破细胞液，设定条件10000rpm，20min，8℃，离心分离，收集离心后的上清液。用0.01m pbs缓冲溶液将上清液稀释至蛋白浓度1mg/ml，用0.22um滤膜过滤除细胞，分装后-80℃保存；制得293宿主细胞全蛋白。
47.2.动物免疫程序
48.取4只兔进行动物免疫，分别进行5次免疫，采用抗原与佐剂等体积混合，乳化采用注射器混合法：将等量的弗氏佐剂和抗原溶液分别吸入两个注射器内，两注射器之间以一细胶管相连，注意排净空气，然后交替推动针管，直至形成粘稠的乳剂为止，即为乳化充分。乳化充分后，免疫动物。初免采用弗氏完全佐剂，随后的免疫都采用弗氏不完全佐剂。免疫当中进行梯度免疫实验，剂量为a组平行2只(1mg/兔子)，b组平行2只(2mg/兔子)采用背部皮下多点注射。
49.具体免疫程序为：初免(0天，弗氏完全佐剂)，抗原为293宿主细胞全蛋白；二免至五免(14/28/42天，弗氏不完全佐剂)，抗原为293宿主细胞全蛋白；三免之后，每只兔子都需要进行效价检测，实时监控血清效价；
50.表1免疫兔终血清效价
[0051][0052]
五免(56天，对倍体积生理盐水冲击免疫)，抗原为293宿主细胞全蛋白。59天处死、采血，血清纯化，具体步骤为将血清加0.01m pbs缓冲溶液(ph：7.4)稀释十倍，过亲和层析柱protein g，用0.1m ph2.8的甘氨酸缓冲液洗脱获得。后分别得到不同免疫量的兔子抗
293宿主蛋白多克隆抗体。
[0053]
表2纯化后获得抗体蛋白含量
[0054][0055]
实施例2抗293宿主细胞蛋白抗体效价测定
[0056]
采用elisa法检测抗体效价，具体为：
[0057]
包被：采用包被液(0.01m pbs缓冲液，ph7.4)将293宿主细胞全蛋白稀释至5ug/ml，100ul/孔，37℃包被2h。除去包被液，用pbs溶液洗涤3次。
[0058]
封闭：每孔加入0.3ml封闭液(5％脱脂奶粉+pbs)于37℃保温2小时；再除去封闭液，pbs溶液洗涤三次。
[0059]
加样：将上述纯化获得的兔抗293宿主蛋白抗体分别稀释至1mg/ml，再依次梯度10倍稀释，稀释缓冲液为0.1m pbs。每孔加入100ul，于37℃保温1小时，除去抗体溶液，pbs溶液洗涤3次。
[0060]
比色及结果计算：然后向每孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的酶标二抗(hrp标记的羊抗兔)100ul，37℃保温0.5小时后除去酶标液，pbs溶液洗涤3次。然后向每孔中加入100ul tmb显色液，室温避光作用15分钟后加2m h2so4 0.05ml终止液终止反应，并用酶标比色仪测定od450值，并计算抗体效价，抗体效价值如表3所示。
[0061]
表3动物抗体效价值
[0062][0063]
实施例3抗293宿主细胞全蛋白抗体覆盖率的检测
[0064]
3.1第一向等电聚焦
[0065]
1)从-20℃冰箱取出2条13cm胶条，放置ipg泡胀盘，室温平衡20min。
[0066]
2)将293hcp样品处理，先转移至5kda超滤管,12000rpm离心30min/次，离心三次，每次离心结束后用水化液补足，使用超微量分光光度计，280nm初步定量。
[0067]
3)计算样本蛋白的上样体积，移至1.5ml离心管，利用1m naoh,冰上调节蛋白溶液ph为8.5左右，13cm胶条用4ul 0.1nm染料标记，涡旋离心，冰上避光孵育30min,然后用1ul,10mmol/l赖氨酸，涡旋瞬离，冰上15min,终止标记，然后按照13cm胶条的优化上样量用水化液补至250ul，用枪将混合好的溶液小心加入胶条槽中。
[0068]
4)用镊子夹住ipg胶条碱性端将胶条的保护膜撕下，胶面朝下，先将ipg胶条酸性端朝胶条槽的尖端(正极)方向放入胶条槽中慢慢下压胶条，避免产生气泡，最后放下ipg胶条碱性端，使水化液浸湿整个胶条，放置过夜(胶条标记+为酸性端，标记—为碱性端)。
amersham typhoon)检查二维电泳跑胶情况(图1)；
[0086]
3.3western blot实验，分析293宿主细胞全蛋白抗体的覆盖率
[0087]
3.3.1western blot实验步骤如下：
[0088]
1)电泳完成后小心拔出凝胶，放入已经配置好的转移液中。分别裁剪与凝胶大小一致的滤纸和pvdf膜，并放置于转移液中,pvdf膜使用前需要通过甲醇激活5s。
[0089]
2)打开湿转转印仪盖，按照滤纸-膜-凝胶-滤纸的顺序，从下到上放置，消除气泡放上盖子，100v恒压转印3h。
[0090]
3)取出膜在pbst中洗涤1次，在5％的脱脂奶粉(用pbst配制)中封闭1h后，使用1％脱脂奶粉(用pbst配置)稀释1：1000的兔抗293hcp抗体并敷上，4度孵育过夜。兔抗293hcp抗体来源为a组-2，b组-1，效价较高的实验兔血清。
[0091]
4)次日从4℃冰箱取出膜，摇床上温育1h后倒掉一抗，在pbst中洗涤3次，每次5min。
[0092]
5)使用pbst以1:4000稀释荧光二抗，并在室温避光孵育1h。
[0093]
6)取出膜在pbst中避光洗涤3次，每次5min。
[0094]
7)使用双模式多光谱激光成像系统(cytiva amersham typhoon)在仪器上扫描pvdf膜，并拍照保存图2-3。
[0095]
8)结果通过melanie 9分析评估抗体的覆盖率，选择出覆盖率最高的兔抗293宿主细胞抗体。表7为两组抗体覆盖率数据，根据覆盖率结果选择a组-2抗体进行后续实验。
[0096]
表7两组抗体覆盖率检测结果
[0097]
抗体13cm凝胶总蛋白数覆盖率a组-256384％b组-155480％
[0098]
实施例4抗293宿主细胞抗体标记生物素
[0099]
1.取2mg抗293宿主细胞抗体，已经溶解在ph 7.4的0.01m pbs缓冲液中。(tris或其他含胺缓冲液中的蛋白质必须转换成合适的缓冲液)
[0100]
2.生物素试剂溶液配制:将2.0mg nhs-biotin试剂溶解在590μl二甲基亚砜(dmso)的溶剂中。
[0101]
3.在蛋白溶液中加入适量的10mm生物素试剂溶液。
[0102]
4.在室温下孵育30分钟。
[0103]
5.蛋白质标记已经完成，之后通过透析纯化所标记的蛋白质以获得最佳的性能和稳定性，可以通过elisa对标记的蛋白质进行初步测试确定了蛋白质的适当功能和标记；
[0104]
5.elisa对标记的蛋白质进行初步测试步骤如下
[0105]
6.包被：用包被液(0.05mnahco3，ph9.6)将兔抗293宿主细胞抗体稀释至5ug/ml、4ug/ml、3ug/ml、2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml，100ul/孔,各两列微孔反应板，4℃包被过夜。除去包被液，用pbs溶液洗涤3次。
[0106]
7.封闭：每孔加入0.3ml封闭液(5％bsa+pbs)于37℃保温2小时。除去包被液，pbs溶液洗涤3次。
[0107]
8.加样：将上述获得的293宿主细胞全蛋白样品稀释至50ng/ml，稀释缓冲液为含2％bsa的pbs，一列各孔加入100ul稀释样品，另一列单加稀释缓冲液的孔作为阴性对照。于
37℃保温1小时，除去抗体溶液，pbs溶液洗涤两次。
[0108]
9.生物素标记抗293宿主细胞抗体加样：将生物素标记抗体稀释至8ug/ml、4ug/ml、2ug/ml、1ug/ml,100ul/孔，37℃保温0.5小时后除去生物素标记抗体，pbst溶液洗涤3次。
[0109]
10.标记物hrp偶联链霉素(抗生物素的蛋白)加样：每孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的hrp偶联的抗生物素的蛋白100ul，37℃保温0.5小时后除去酶标液，pbs溶液洗涤3次。
[0110]
11.比色及结果计算：每孔中加入100ul tmb显色液，室温避光作用15分钟后加2m h2so
4 0.05ml终止液终止反应，并用酶标比色仪测定od450值。表8为整理的检测数值，根据检测数据确定包被抗体浓度1ug/ml以及生物素标记的抗体的最适浓度2ug/ml。
[0111]
表8 293hcp elisa试剂盒包被浓度及检测抗体浓度摸索结果
[0112]
[0113][0114]
实施例5双抗体夹心法测定293宿主蛋白含量范围
[0115]
根据上步所确定的包被抗体和检测抗体的工作浓度，本实验在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置不同浓度的标准品梯度，并通过双抗夹心elisa法检测反应值，以确定最佳的标准品浓度梯度，实验结果如表9所示。本次实验每一个标准品浓度设置3个复孔，表中od为平均值,具体实验步骤如下：
[0116]
包被：用包被液(0.05mnahco3，ph9.6)将兔抗293宿主细胞抗体稀释至2.5ug/ml，100ul/孔,4℃包被过夜。除去包被液，用pbst溶液洗涤3次。
[0117]
封闭：每孔加入0.3ml封闭液(5％bsa+pbs)于37℃保温2小时。除去包被液，pbs溶液洗涤3次。
[0118]
标准品加样：将上述获得的293宿主细胞全蛋白样品稀释至100ng/ml、50ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.5ng/ml、0.75ng/ml、0.375ng/ml，稀释缓冲液为含2％bsa的pbs，各孔加入100ul稀释样品，单加稀释缓冲液的孔作为阴性对照。于37℃保温1小时，除去抗体溶液，pbs溶液洗涤两次。
[0119]
生物素标记抗293宿主细胞抗体加样：每孔加入实施例4中的最适浓度的生物素标记抗体100ul,37℃保温0.5小时后除去生物素标记抗体，pbst溶液洗涤3次。
[0120]
标记物hrp偶联链霉素(抗生物素的蛋白)加样：每孔加入用稀释缓冲液以1：5000稀释的hrp偶联的抗生物素的蛋白100ul，37℃保温0.5小时后除去酶标液，pbs溶液洗涤3次。
[0121]
比色及结果计算：每孔中加入100ul tmb显色液，室温避光作用15分钟后加2m h2so4 0.05ml终止液终止反应，并用酶标比色仪测定od450值。表9为整理的检测数值，应用该方法检测293宿主蛋白的检测范围在100-0.78ng/ml。
[0122]
表9
[0123][0124][0125]
实施例6 293hcp elisa试剂盒标准曲线的相关性
[0126]
根据前两步确定的包被抗体和检测抗体的工作浓度，以及他们所能检测的标准品浓度范围，在保持包被抗体浓度和检测抗体浓度不变的前提下，设置七个不同浓度的标准
品梯度。每个浓度作一个平行样，以尽可能减少实验操作误差的干扰。采用实施例6所述试剂盒，按照实施例5所述的方法在同一块板条上elisa检测检测反应值，并以此绘制标准曲线。标准品浓度及对应的反应值如表10所示。
[0127]
表10 293hcp标准曲线数据
[0128][0129]
由表数据，分析发现，数据具有明显的梯度，复孔之间差异很小，可以满足elisa的实验需求。利用用线性拟合法绘制标准曲线，如图4所示。由图4可知，标准曲线r2为0.9969，可信度较高。
[0130]
以下对elisa检测试剂盒的功能性分析作进一步的说明：
[0131]
实施例7 293hcp elisa试剂盒回收率分析
[0132]
以293hcp作为样本，利用0.01mol/l pbs稀释hcp，使其终浓度为25ng/ml。本次实验共重复三次，每次实验设置三个复孔。
[0133]
采用实施例6所述试剂盒，按照实施例5所述的方法在同一块板条上elisa检测，根据本试剂盒所获得的标准曲线和样本的od计算样本浓度，并与起始浓度25ng/ml比较，计算回收率。回收率计算方法如下：
[0134]
回收率＝样本计算浓度/样本实际浓度x 100％。
[0135]
elisa检测后，根据本试剂盒所获得的标准曲线和样本的od计算样本浓度和回收率结果如表11所示。本次实验共重复三次，表中od为三次实验的平均值。
[0136]
表1 293hcp elisa试剂盒回收率分析结果
[0137]
平均od回算浓度(ng/ml)回收率(％)0.74431.188104％0.71829.62898.8％0.69828.43294.8％
[0138]
回收实验结果表明，回收率在90％-105％之间，平均值为99.23％，回收率较高。说明本试剂盒具有很好的准确度。
[0139]
实施例8 293hcp elisa试剂盒特异性分析
[0140]
以纯化后的vero、毕赤酵母(yeast)和cho的宿主细胞蛋白hcp作为检测样本，采用实施例6所述试剂盒，按照实施例5所述的方法在同一块板条上检测，以评估本试剂盒的特异性。本实验共重复三次。
[0141]
分别取550ng/ml的cho hcp、480ng/ml的vero hcp、450ng/ml的毕赤酵母(yeast)hcp各200μl，每孔100μl,加到包被并封闭好的试剂盒孔内。每个样本做一个复孔，进行夹心法elisa实验，检测各待测样本与试剂盒的交叉反应程度，结果如表12所示(表中所有od均
为三次实验的平均值)。
[0142]
表12 293hcp elisa试剂盒特异性分析
[0143]
样本种类平均od回算浓度(ng/ml)交叉反应性(％)cho hcp0.18670.3830.07vero hcp0.18110.0980.02yeast hcp0.19921.0210.22
[0144]
实验结果表明cho细胞、vero细胞、毕赤酵母宿主细胞蛋白对elisa反应的干扰程度非常小，与试剂盒之间基本无交叉反应。说明本试剂盒有很好的特异性，能特异性的与293宿主细胞蛋白反应，且不受上述细胞hcp的干扰。
[0145]
实施例9. 293hcp elisa试剂盒精密度分析
[0146]
采用实施例6所述试剂盒，按照实施例5所述的方法在同一块板条上检测25ng/ml标准品10孔的od450，重复试验三次，计算批内变异系数(cv％),平均为6.35％。
[0147]