一种β-阿朴-8的制作方法

一种
β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的检测方法
技术领域
1.本发明涉及分析化学技术领域，特别涉及一种β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的检测方法。


背景技术：

2.β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯简称为阿朴酯，是类胡萝卜素中一种含氧的阿朴胡萝卜素类化合物，主要为青草、紫花苜蓿、绿色蔬菜和柑橘类水果中的阿朴胡萝卜素醛的代谢产物，其结构式见图1，分子式为c
32h44
o2，分子量460.7，易溶于氯仿，微溶于植物油，极难溶于水和甘油，对氧和光极不稳定。阿朴酯是一种高效的类胡萝卜素添加剂，其着色效率显著高于β-阿朴-8
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胡萝卜素醛和万寿菊提取物，常应用于饲料工业中，对禽类皮肤、脚胫、皮下脂肪、蛋黄的着色有显著效果，是我国允许使用的禽饲料添加剂，与辣椒红、β-阿朴-8
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胡萝卜素醛、斑蝥黄或叶黄素配合使用时，总量不超过80mg/kg。
3.国标检测β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯主要以分光光度法，在实际应用过程中常用检测方法为超高效液相色谱法，是采用超高效液相色谱-串联质谱法，但超高效液相色谱法检测成本高，流程复杂，因此急需研究一种β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的检测方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于克服现有技术中采用超高效液相色谱法成本高、流程复杂的问题，提供一种β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的检测方法，该方法采用简单的样品预处理配合高效液相色谱法，对饲料或添加剂中阿朴酯的含量进行快速、准确测定，可有效帮助饲料中着色剂使用的监测与评估，确保饲料质量安全。
5.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
6.一种β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的检测方法，包括以下步骤：
7.(1)待测样品溶液、标准工作液配制
8.称取xag饲料或xbg添加剂于100ml容量瓶管中，加入2-10ml水，涡旋混匀；加入 15-30ml甲基叔丁基醚，振荡混匀；加入甲醇后振荡混匀；用甲醇定容至100ml，摇匀后静置，得到待测样品溶液；
9.用体积比为15-30：70-85的甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液配制不同浓度的β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯标准工作液；
10.(2)高效液相色谱分析
11.利用高效液相色谱仪对步骤(1)得到的待测样品溶液和标准工作液进行检测，并记录色谱图；
12.(3)标准曲线绘制和β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯含量计算
13.根据不同浓度β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯标准工作液的色谱图分析得到峰面积，将峰面积和对应的质量浓度进行线性回归分析，得到标准曲线线性回归方程；
14.对待测样品溶液的色谱图分析得到峰面积，代入标准曲线线性回归方程，得到待
测样品溶液中β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯的质量浓度，再计算得到饲料或添加剂中β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯含量；β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯计算公式为：
[0015][0016]
式中，w为饲料或添加剂中β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的含量，x为待测样品溶液中β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的质量浓度，v为配制待测样品溶液所用的溶液的体积，m为饲料或添加剂的质量。
[0017]
进一步地，步骤(1)中，对于饲料样品的待测样品溶液，进行浓缩，具体操作为：从 100ml容量瓶中取5ml上清液溶液于离心管，用氮吹仪吹干，移取1ml体积比为15-30：70-85 的甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液复溶，过滤，得到饲料样品的待测样品溶液。
[0018]
更进一步地，称取饲料的质量为2.0g。
[0019]
进一步地，步骤(1)中，对于添加剂样品的待测样品溶液，进行稀释，具体操作为：从 100ml容量瓶中取5ml上清液溶液于100ml容量瓶中，用体积比为15-30：70-85的甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液定容，过滤，得到添加剂样品的待测样品溶液。
[0020]
更进一步地，称取添加剂的质量为0.05g。
[0021]
进一步地，高效液相色谱仪条件为：采用c30柱，检测波长为466nm，柱温为30～35℃，流动相为15-30：70-85的甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液；洗脱的流速为0.8～1.5ml/min。c30 柱是在硅胶基质上键合了c30功能团的反相色谱柱，增加了固定相的疏水性，该产品对于类胡萝卜素等几何异构体的分离十分有效。该法采用c30色谱柱能够很好地分离叶黄素、玉米黄质、斑蝥黄、β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯等。
[0022]
更进一步地，柱温为35℃，流动相为体积比15：85的甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液；洗脱的流速为1.0ml/min，进样量为50μl；运行时间20min。
[0023]
进一步地，标准曲线线性回归方程为：y＝479.074865x-1.4006713，y为β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯峰面积，x为待测样品溶液中β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的质量浓度，相关系数 r2＝1.00000。
[0024]
进一步地，步骤(1)中，饲料待测样品溶液的饲料质量浓度为100mg/ml，添加剂待测样品溶液的添加剂质量浓度为0.025mg/ml。
[0025]
进一步地，饲料中β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯含量的检测下限为0.15mg/kg。
[0026]
更进一步地，饲料中β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯含量定量检测浓度为0.4mg/kg。
[0027]
与现有技术相比，本发明的有益效果：
[0028]
本发明公开β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯检测方法采用先水溶解提取，再用甲基叔丁基醚
‑ꢀ
甲醇混合溶液萃取的前处理，对于阿朴酯选择性好，待测溶液杂质含量少、干扰少，配合常规的高效液相色谱分析便可测定饲料或添加剂中β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯的含量。经实验验证，本发明方法检出限为0.15mg/kg，定量限为0.40mg/kg，各项技术指标均符合要求，同时也能检测饲料或添加剂中叶黄素、玉米黄质或斑蝥黄的含量。同时方法前处理操作简单，准确度高，重现性好，其灵敏度和精密度均能满足实际应用的需要，适用于饲料中阿朴酯含量的批量检测，对完善饲料中色谱检测方法有一定借鉴价值。
附图说明：
[0029]
图1为β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯结构式；
[0030]
图2为以正己烷为提取液β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的色谱图；
[0031]
图3为以二氯甲烷为提取液β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的色谱图；
[0032]
图4为以环己烷为提取液β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的色谱图；
[0033]
图5为以甲醇为提取液β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的色谱图；
[0034]
图6为以体积比30:70甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液为提取液β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的色谱图；
[0035]
图7为标准曲线线性回归方程；
[0036]
图8为蛋鸡料1#中分离叶黄素、玉米黄质、斑蝥黄、β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的色谱图；
[0037]
图9为饲料样品空白加标回收色谱图；
[0038]
图10为饲料0.4mg/kg加标回收色谱图。
具体实施方式
[0039]
下面结合试验例及具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0040]
实施例1
[0041]
a、仪器与试剂
[0042]
高效液相色谱仪(agilent 1260infinity ii)；紫外检测器(1260mwd)；离心机(蜀科)；全自动浓缩仪(reekoautoeva)；hy-6双层调速振荡器；微孔有机滤膜(0.22μm，上海安普)；涡旋仪。
[0043]
β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯标准品(纯度≥98.6％，carote nature)；甲基叔丁基醚(色谱纯)、甲醇(色谱纯)；三氯甲烷、正己烷、环己烷(分析纯)。
[0044]
b、混匀方式确定
[0045]
β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯在生产中，采用水溶性基质包被，为了打开饲料中阿朴酯的包被层，首先将样品置于适量的水中进行溶解，再使用提取液提取。在使用提取液提取时，分别采用振荡和超声两种方式进行混匀，试验中发现采用超声均匀易使溶液温度升高，混匀时间不能设置较长，因此本实施例采用振荡的混匀方式。
[0046]
c、提取液确定
[0047]
本实施例采用称取空白饲料样品2.0g，在饲料空白样品中添加指定量的β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯标准溶液，再分别采用正己烷、三氯甲烷、环己烷、甲基叔丁基醚、甲基叔丁基醚
‑ꢀ
甲醇混合溶液、甲醇、甲醇-乙酸乙酯-正己烷的混合溶液为提取液，对样品进行萃取后检测β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯的含量，再计算回收率，在试验过程中每种提取液制备3组平行样。图2-6分别为以正己烷、三氯甲烷、环己烷、甲基叔丁基醚和甲醇混合溶液、甲醇、乙酸乙酯和正己烷的混合溶液为提取液的β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯的色谱图，表1为β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯的回收率。结果表明三氯甲烷和甲基叔丁基醚-甲醇萃取干扰较少、回收率高。但三氯甲烷为有毒有害水污染物质，且属于第二类易制毒试剂，不易获
得，因此选择甲基叔丁基醚-甲醇为提取液。同时优化不同比例的甲基叔丁基醚-甲醇提取溶剂，表1展示了提取液中甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液中甲基叔丁基醚比例为10％-70％的回收率，从数据中可以看出当甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液中甲基叔丁基醚比例不小于15％时，回收率大于90％，满足对β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯的测试要求，且表2中给出了甲基叔丁基醚比例为15％-70％的甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液作为提取液测试叶黄素和玉米黄质的峰面积，从数据可以看出随着甲基叔丁基醚比例的增加，叶黄素、玉米黄质的提取效率逐步降低。兼顾几种色素同时检测的方式，同时考虑到甲基叔丁基醚挥发性强、毒性大、不易与水互溶等特性，从安全角度出发，甲基叔丁基醚的比例不宜过高，因此选择体积比为15-30：70-85的甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液作为提取液。
[0048]
表1采用不同提取液β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的回收率
[0049][0050]
表2采用不同比例甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液其他色素的提取效率
[0051][0052]
d、紫外吸收波长确定
[0053]
β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯在正己烷中紫外最大吸收波长为466nm，参考其他资料，波长分别采用466、452、472nm对2.0mg/l阿朴酯标准溶液进行测定，结果显示检测峰面积没有明显变化，本实施例选用466nm作为检测波长。
[0054]
e、色谱柱确定
[0055]
c30柱是在硅胶基质上键合了c30功能团的反相色谱柱，加了固定相的疏水性，该产品对于类胡萝卜素等几何异构体的分离十分有效。本发明采用c30色谱柱能够很好地分离β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯。
[0056]
一种β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的检测方法，包括以下步骤：
[0057]
(1)待测样品溶液、标准工作液配制
[0058]
称取2.0饲料或0.05g添加剂于100ml容量瓶管中，加入2-10ml水，涡旋混匀2min；加入30ml甲基叔丁基醚，振荡混匀10min；加入甲醇后，摇床振荡混匀30min；用甲醇定容至100ml，摇匀后静置，得到待测样品溶液。
[0059]
对于饲料样品的待测样品溶液，还需要进行浓缩，具体操作为：从100ml容量瓶中取5ml 上清液溶液于离心管，用氮吹仪45℃吹干，移取1ml体积比为30：70的甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液复溶，过滤，得到饲料样品的待测样品溶液。过滤是采用0.22μm有机滤膜过滤，不过滤有杂质，易造成色谱柱堵塞，影响检测。
[0060]
对于添加剂样品的待测样品溶液，进行稀释，具体操作为：从100ml容量瓶中取5ml上清液溶液于100ml容量瓶中，用体积比为30：70的甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液定容，过滤，得到添加剂样品的待测样品溶液。
[0061]
完全转移β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯1.0mg于25ml容量瓶中，加入7ml甲基叔丁基醚溶解，并用甲醇定容成25ml，得到40μg/ml阿朴酯标准液，-18℃保存。移取不同体积40μg/ml 阿朴酯标准液，用体积比为30：70的甲基叔丁基醚-甲醇混合溶液逐级稀释，分别配制成0.04、 0.1、0.2、1.0、2.0、10.0μg/ml阿朴酯标准液。
[0062]
本实施例的溶液配制过程均在通风橱内避光进行。
[0063]
(2)高效液相色谱分析
[0064]
利用高效液相色谱仪对步骤(1)得到的上述待测样品溶液和不同浓度标准工作液进行检测，并记录色谱图。
[0065]
高效液相色谱仪条件为：采用c30柱(250
×
4.6mml.d.s-5μm)，检测波长为466nm，
柱温为35℃，流动相为体积比为15：85的甲基叔丁基醚和甲醇混合溶液，洗脱的流速为 1.0ml/min，进样量为50μl；运行时间20min。
[0066]
(3)标准曲线绘制和β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯含量计算
[0067]
根据不同浓度β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯标准工作液的色谱图分析得到峰面积，将峰面积和对应的质量浓度进行线性回归分析，阿朴酯浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准曲线线性回归方程。结果表明，在浓度为0.04～10mg/l范围内，阿朴酯的色谱峰面积与浓度呈良好的线性关系，标准曲线线性回归方程为：y＝479.074865x-1.4006713，y为β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯峰面积，x为待测样品溶液中β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯的质量浓度，相关系数 r2＝1.00000，标准曲线见图7。
[0068]
对待测样品溶液的色谱图分析得到峰面积，代入标准曲线线性回归方程，得到待测样品溶液中β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的质量浓度，再计算得到饲料或添加剂中β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯含量；β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯计算公式为：
[0069][0070]
式中，w为饲料或添加剂中β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯的含量，x为待测样品溶液中β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯的质量浓度，v为配制待测样品溶液所用的溶液的体积，m为饲料或添加剂的质量，在本实施例中，对于饲料样品，配置成100ml溶液后，取5ml浓缩成1ml，则对于添加剂样品，配置成100ml溶液后，取5ml稀释成100ml，则则
[0071]
对不同的饲料样品和不同添加剂样品采用上述的方法进行检测，得到β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯含量如下表3所示。
[0072]
表3不同的饲料样品和不同添加剂中β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯含量
[0073][0074]
从上表2的数据可以看出，采用本发明方法检测出10％阿朴酯添加剂中阿朴酯含量的含量基本为10％。对于饲料样品，能检测出阿朴酯、叶黄素、玉米黄质和斑蝥黄的含量，其中510肉小鸡中未添加斑蝥黄。其中图8为蛋鸡料1#中分离叶黄素、玉米黄质、斑蝥黄、β-阿朴-8
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胡萝卜素酸乙酯的色谱图。家禽本身不能合成色素，只有带有含氧功能基的类胡萝卜素包括叶黄素、番茄红素、斑蝥黄、阿朴酯等才有着色效果。因此，研究叶黄素类着色剂对黄鸡着色效果，以及对蛋鸡蛋黄着色和叶黄素沉积效果，对于指导生产实践，改善产品品质具有重要的指导意义。
[0075]
为了测试方法的准确度与精密度，本发明准确称取空白饲料样品2.0g，采用在空白饲料样品中添加适量的β-阿朴-8
′‑
胡萝卜素酸乙酯标准溶液，分别使试样中阿朴酯添加量为0.4、 1.0、10.0mg/kg 3个水平，每个水平做6个重复样品，根据检测量与理论添加量计算回收率和rsd，考察方法的准确度与精密度。测试数据如下表4所示，可知阿朴酯的回收率分别为 98.5％、99.8％、86.0％，rsd为2.87％、4.73％、4.66％，表明该方法的准确度和精密度较好。
[0076]
表4不同添加量阿朴酯的回收率
[0077]
添加量(mg/kg)平均回收率(％)rsd(％)0.498.52.871.099.84.731086.04.66
[0078]
为了测试本发明方法的检出限、定量限，取空白样品做基质加标，以3倍信噪比(s/n＝3) 所对应样品中阿朴酯的浓度为检出限，以10倍信噪比(s/n＝10)所对应样品中阿朴酯的浓度为定量限，得出检出限为0.15mg/kg；定量限为0.4mg/kg。样品空白与0.4mg/kg加标回收如图9、图10所示。
[0079]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。