一种基于分子印迹传感器的灭蝇胺残留快速检测方法

1.本发明涉及农药残留检测技术领域，具体的是一种基于分子印迹传感器的灭蝇胺残留快速检测方法。


背景技术：

2.灭蝇胺(cyromazine)是一种具有较强内吸、胃毒和触杀能力的昆虫生长调节剂类杀虫剂，目前被广泛用于豇豆、黄瓜和茄子等农作物的双翅目昆虫病虫害防治中。灭蝇胺本身对人类的毒性很低，但是其降解产物三氯氰胺被人体大量摄取后，会对肾脏造成不可逆的伤害，严重危害人类健康。
3.目前检测灭蝇胺残留使用较多且比较成熟的技术包括间接竞争酶联免疫吸附试(elisa)、高效液相色谱法(hplc)、气相色谱-串联质谱(gc-ms)、超高效液相色谱(uplc)、液相色谱-串联质谱(lc-ms/ms)等方法。上述方法虽然具有灵敏度、精确度高等特点，但是需要大型仪器设备支撑，同时操作程序繁琐耗时长以及需要熟练的操作技术，导致样品的检测成本较高，不能进行农残的快速检测。因此，本发明提出一种基于分子印迹传感器的灭蝇胺残留快速检测方法。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术中的缺陷，本发明实施例提供了一种基于分子印迹传感器的灭蝇胺残留快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.本技术实施例公开了：一种基于分子印迹传感器的灭蝇胺残留快速检测方法，包括以下步骤：
6.向电极上滴加80μl0.2％haucl4沉积液，在-0.25v下恒电位沉积180s，完成后取下电极用超纯水冲洗多余的氯金酸溶液，干燥备用；
7.向(1)中电极上滴加80μl灭蝇胺α-甲基丙烯酸聚合溶液，使之完全覆盖电极，并在
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1.0v的条件下恒电位沉积300s，聚合沉积完成后，用超纯水冲洗干燥；
8.向(2)电极表面滴加10μl 6μmol/l三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯溶液于电极表面，干燥12h；
9.向(3)中制备好的电极上滴加80μl 1％hcl溶液于电极上，在-0.4～0.8v电位区间下利用循环伏安法扫描30圈，将模板分子洗脱掉，完成后将电极取出并洗净干燥备用即制得分子印记传感器；
10.对制得的分子印记传感器进行表征及性能测试；
11.将准备好的样品洗净干燥，切碎打匀，称取30g匀浆加入30ml乙腈溶液于50ml离心管中，涡旋3min后，在8000r/min下离心5min，取上清液过滤待用，向上清液中加入对应量灭蝇胺原药配制成含1、2和3μmol/l灭蝇胺的样品溶液；
12.把分子印记传感器浸泡在不同浓度灭蝇胺的待测样液，静置20min干燥后，滴60μl 含5.0mmol/l k3fe(cn6)的0.1mol/l kcl溶液并用差分脉冲伏安法进行扫描，记录峰电流
值，每个样品每个浓度分别做三次记录，计算回收率和相对标准偏差(rsd)。
13.进一步的，步骤(5)中分子印记传感器的表征及性能测试包括：
14.传感器cv和eis表征，将自制的传感器浸入含5.0mmol/l k3fe(cn6)的0.1mol/l kcl溶液中，于-0.4～0.6v电位范围内进行循环伏安法(cv)扫描2圈，获取传感器的循环伏安图；使用交流阻抗法于10-1
～10-5
hz之间扫描获取传感器的电化学阻抗谱(eis)；
15.传感器扫描电镜表征，将自制的传感器在扫描电镜下扫描，获取传感器的扫描电镜图，对其表面进行观察和分析；
16.传感器性能dpv测试，在含5.0mmol/l k3fe(cn6)的0.1mol/l kcl溶液中，用自制的便携式传感器通过差分脉冲伏安法(dpv)对所制备的传感器进行扫描，将此时传感器的峰电流记为i0；后将上述传感器浸入到含有不同浓度灭蝇胺的pbs溶液(ph＝7.4)中，浸泡吸附20min 后取出干燥，用差分脉冲伏安法(dpv)进行扫描，将此时传感器的峰电流记为i。并按以下公式计算灭蝇胺对此传感器的抑制率(i％)。
[0017][0018]
其中，i0：未浸泡农药的传感器差分脉冲伏安法(dpv)峰电流；i：浸泡不同浓度农药的传感器差分脉冲伏安法(dpv)峰电流；i％：不同浓度灭蝇胺对此传感器的抑制率；
[0019]
重复性测试，将同一支传感器浸泡在含2μmol/l灭蝇胺的pbs溶液20min中，滴60μl 含5.0mmol/l k3fe(cn6)的0.1mol/l kcl溶液并用差分脉冲伏安法进行扫描，重复七次，记录峰电流值并计算相对标准偏差(rsd)；
[0020]
抗干扰性测试，选择与灭蝇胺具有相似结构的莠草津和异丙甲草胺两种农药作为抗干扰的农药。向1μmol/l灭蝇胺溶液中分别加入莠草津、异丙甲草胺配置成含5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、30μmol/l的灭蝇胺混合溶液，将此混合溶液作为干扰溶液。将传感器按梯度依次浸泡在上述溶液中20min，取出干燥后滴60μl含5.0mmol/l k3fe(cn6)的0.1mol/lkcl溶液并用差分脉冲伏安法(cv)进行扫描，记录峰电流值。
[0021]
本发明的有益效果如下：通过电化学的手段，结合分子印迹技术，采用电化学沉积的方法，使用氯金酸溶液修饰电极，以灭蝇胺为模板分子、α-甲基丙烯酸为功能单体、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯作为交联剂、hcl为洗脱剂，在特定条件下制备灭蝇胺的便携式分子印迹传感器，并将该方法应用于豇豆等农产品中灭蝇胺的快速分析检测。
[0022]
为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
附图说明
[0023]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024]
图1是在5.0mmol/l k3fe(cn6)的0.1mol/l kcl溶液中传感器的结构表征。
[0025]
图2是传感器扫描电镜图。
[0026]
图3是不同浓度灭蝇胺溶液标准曲线和抑制率曲线。
[0027]
图4是传感器重复性检验结果。
具体实施方式
[0028]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0029]
一种基于分子印迹传感器的灭蝇胺残留快速检测方法，包括分子印迹传感器的制备，向电极上滴加80μl0.2％haucl4沉积液，在-0.25v下恒电位沉积180s，完成后取下电极清洗干燥，继而在上述制成的电极上滴加80μl灭蝇胺与α-甲基丙烯酸聚合溶液，使之完全覆盖电极，并在-1.0v的条件下恒电位沉积300s，使电极表面同时聚合灭蝇胺和α-甲基丙烯酸，用超纯水冲洗干燥后，滴加10μl 6μmol/l三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯溶液于电极表面，干燥12h。滴加80μl 1％hcl溶液于电极上，利用循环伏安法扫描30次，电位区间为-0.4～0.8v，将模板分子洗脱掉，完成后将电极取出并清洗干燥；
[0030]
传感器的电化学表征及性能测试，传感器cv和eis表征，将自制的传感器浸入含 5.0mmol/l k3fe(cn6)的0.1mol/l kcl溶液中，于-0.4～0.6v电位范围内进行循环伏安法(cv) 扫描2圈，获取传感器的循环伏安图；使用交流阻抗法于10-1
～10-5
hz之间扫描获取传感器的电化学阻抗谱(eis)，结果见图1((a)循环伏安图(cv)a：裸电极cv(bare spce)； b：电沉积haucl4溶液后电极；c：聚合灭蝇胺分子聚合物后电极；d：洗脱后电极；e:非印迹传感器洗脱后电极(ck)。(b)电化学阻抗谱(eis)a：裸电极；b：电沉积haucl4溶液后电极；c：聚合灭蝇胺分子聚合物后电极；d：洗脱后电极)，图1a是对各个电极进行循环伏安法分析。结果显示：氯金酸沉积后的电极峰值相比于裸电极显著增大，表明氯金酸被成功修饰在电极表面，增加电极的导电能力，同时增大了峰电流。当灭蝇胺聚合物沉积到电极表面时，阻碍电子传输，导致峰电流减小。由于非印迹传感器的制备过程没有模板分子参与，无法交联增长聚合物链，导致分子间间隙变窄，电极导电能力减弱，因此其峰电流小。分子印迹传感器洗脱后的电流大于非印迹传感器洗脱后的电流，表明传感器表面的印迹位点对灭蝇胺分子的识别性能良好，图1b是分别对所制备的电极进行交流阻抗谱分析。结果显示：在氯金酸沉积后，电子的传输得到促进，阻抗谱半径显著减小。在聚合物沉积、洗脱后，阻抗谱半径增大，说明灭蝇胺α-甲基丙烯酸聚合物成功结合到传感器上；
[0031]
传感器扫描电镜表征将自制的传感器在扫描电镜下扫描，获取传感器的扫描电镜图，对其表面进行观察和分析，结果见图2(a：裸电极cv(bare spce)；b：电沉积haucl4溶液后电极；c：聚合灭蝇胺分子聚合物后电极；d：洗脱后电极)，经过氯金酸修饰的电极表面有许多小颗粒状的物质(图2b)，并且电极表面变得光滑，说明金粒子成功组装在传感器上；聚合物沉积交联后，可明显看到电极表面变得粗糙，并且还有一些块状凸起(图2c)，说明灭蝇胺与α-甲基丙烯酸成功沉积在传感器上，经过1％hcl洗脱后，电极表面变得平整光滑，表面块状物质减少(图2d)，说明灭蝇胺分子被成功洗脱；
[0032]
传感器性能dpv测试，在含5.0mmol/lk3fe(cn6)的0.1mol/l kcl溶液中，用自制的便携式传感器通过差分脉冲伏安法(dpv)对所制备的传感器进行扫描，将此时传感器的峰电流记为i0；后将上述传感器浸入到含有不同浓度灭蝇胺的pbs溶液(ph＝7.4)中，浸泡吸
附20min 后取出干燥，用差分脉冲伏安法(dpv)进行扫描，将此时传感器的峰电流记为i。并按以下公式计算灭蝇胺对此传感器的抑制率(i％)。
[0033][0034]
注：i0：未浸泡农药的传感器差分脉冲伏安法(dpv)峰电流；i：浸泡不同浓度农药的传感器差分脉冲伏安法(dpv)峰电流；i％：不同浓度灭蝇胺对此传感器的抑制率，结果见图3 (a：分子印迹传感器对不同浓度灭蝇胺的dpv曲线；b：分子印迹传感器对不同浓度灭蝇胺的抑制率曲线。注：0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0为不同浓度的灭蝇胺，其中浓度单位为μmol/l)，传感器的响应电流均随灭蝇胺浓度梯度的变化而改变，当灭蝇胺浓度增大，对应的响应电流相应降低。因此，在一定的浓度范围内，响应电流和农药浓度之间存在较好的线性关系；
[0035]
重复性测试，将同一支传感器浸泡在含2μmol/l灭蝇胺的pbs溶液20min中，滴60μ l含5.0mmol/l k3fe(cn6)的0.1mol/l kcl溶液并用差分脉冲伏安法进行扫描，重复七次，记录峰电流值并计算相对标准偏差(rsd)，结果见图4，连续重复七次测试，前六次测试的rsd 值为4.56％，且峰电流无明显衰减，到第七次时rsd值为7.54％，说明所制备的传感器在连续六次以内测试的结果准确性较好；
[0036]
抗干扰性测试，选择与灭蝇胺具有相似结构的莠草津和异丙甲草胺两种农药作为抗干扰的农药。向1μmol/l灭蝇胺溶液中分别加入莠草津、异丙甲草胺配置成含5μmol/l、10μ mol/l、20μmol/l、30μmol/l的灭蝇胺混合溶液，将此混合溶液作为干扰溶液。将传感器按梯度依次浸泡在上述溶液中20min，取出干燥后滴60μl含5.0mmol/l k3fe(cn6)的 0.1mol/l kcl溶液并用差分脉冲伏安法(cv)进行扫描，记录峰电流值，结果见表1、表2；
[0037][0038]
附表1抗干扰性检验结果
[0039]
[0040][0041]
附表2抗干扰性检验结果
[0042]
结果表明，1μmol/l灭蝇胺溶液与在1μmol/l灭蝇胺溶液中加入5μmol/l、10μmol/l、 20μmol/l莠去津和异丙甲草胺溶液的所得到的峰值电流相近。抑制率与原液的差值均小于 5％。上述结果说明，此分子印迹传感器具有良好的抗干扰性。
[0043]
待测样品的前处理，将购回的豇豆洗净干燥，切碎打匀，称取30g匀浆加入30ml乙腈溶液于50ml离心管中，涡旋3min后，在8000r/min下离心5min，取上清液过滤待用。向上清液中加入对应量灭蝇胺原药配制成含1、2和3μmol/l灭蝇胺的样品溶液；
[0044]
样品溶液测试，把制备好的传感器浸泡在不同浓度灭蝇胺的待测样液，静置吸附20min 后取出干燥，滴60μl含5.0mmol/l k3fe(cn6)的0.1mol/l kcl溶液并用差分脉冲伏安法进行扫描，记录峰电流值，每个样品每个浓度分别做三次重复，计算回收率和相对标准偏差 (rsd)，结果见表3；
[0045][0046]
附表3实际样品回收率结果
[0047]
结果表明，番茄豇豆的加标回收率范围分别为90.14％～101.67％、90.64％～101.10％，相对标准偏差均小于5％。表明该分子印迹传感器适合实际样品中灭蝇胺的分析检测。
[0048]
本发明中应用了具体实施例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。