马流产沙门氏菌病4种致病病原菌通用型间接ELISA抗体检测试剂盒及其应用

马流产沙门氏菌病4种致病病原菌通用型间接elisa抗体检测试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种elisa抗体检测试剂盒及其应用，特别涉及一种可检测马流 产沙门氏菌病4种致病病原菌的通用型间接elisa抗体检测试剂盒及其应用。本 发明属于医药技术领域。


背景技术：

2.沙门氏菌病是一种重要的细菌性疾病，给养猪业、禽业、鸽业、马、驴等产业带来巨大的经济损失。马流产沙门氏菌病(equine abortus salmonellosis)，又称为马副伤寒(equi parathphoid)，是由马流产沙门氏菌(salmonella abortus equi s.abortus equi)、鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium s.typhi)、都柏林沙门氏菌 (s.dublin)、肠炎沙门氏菌(s.enteritidis)等引起的以马属动物流产为特征的传染病。其中马流产沙门氏菌的最主要病原，先前也有报道鼠伤寒沙门氏菌单独或与马流产沙门氏菌混合感染导致驴流产及驴驹腹泻(崔思列,李春盛.驴驹鼠伤寒沙门氏菌病调查研究报告.兽医科技杂志,1983,(02):10-16)，而都柏林沙门氏菌、 肠炎沙门氏菌引起的马驴流产并不多见，鲜有报道。
3.关于马流产沙门氏菌病诊断血清学方法，主要有试管凝集试验、微量凝集试验、elisa等，本发明人所在团队前期建立了马流产沙门氏菌微量凝集试验(mat)，并利用微量凝集检测方法对151份马血清样品进行了检测，流产暴发区马流产沙门氏菌抗体阳性检出率高于试管凝集试验法，因此敏感性更高；国外研究人员利用脂多糖(lps)建立ielisa抗体检测方法用于马流产沙门氏菌抗体检测，具有较好敏感性，但特异性仍需要进一步评估。
4.所以，目前没有关于马流产沙门氏菌病通用型的elisa血清学诊断方法，传 统的试管凝集试验敏感性低，微量凝集试验虽然敏感性得到了提升，但是由于肉 眼观察凝集现象本身也限制了敏感性的进一步提高，所以，急需建立一种敏感性 高、特异性好的且可同时检测马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏 菌、肠炎沙门氏菌抗体的通用型elisa方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种可检测马流产沙门氏菌病4种致病病原菌(马流 产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌)的通用型间接 elisa抗体检测试剂盒及其应用。
6.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
7.获得体外表达的候选蛋白是建立间接elisa检测血清抗体的先决条件，本发 明首先利用马流产沙门氏菌阳性血清、阴性血清分别与马流产沙门氏菌全菌抗原 进行免疫共沉淀(pulldown)试验，筛选出马流产沙门氏菌优势抗原——外膜重 组蛋白a(outer membrane proteina，ompa)，通过序列比对，该蛋白氨基酸序 列与同属鼠伤寒沙门氏菌、都
柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌同源性99.43-100％， 具有很好的保守性；其次本发明根据抗原性分析对优势抗原编码基因进行分段表 达，设计3对引物，利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)扩 增沙门氏菌优势抗原基因并将其分别克隆至原核表达载体pet28a，成功构建了 pet28a-ompa1、pet28a-ompa2、pet28a-ompa33个重组质粒。sds-page结果 表明，在24℃、0.6mm iptg诱导5h下，含有pet28a-ompa1、pet28a-ompa2、pet28a-ompa3的重组菌均获得了表达，其中重组ompa1和ompa2蛋白以包涵体 形式表达，重组ompa3蛋白以可溶性形式表达；westernblot显示，重组蛋白 ompa3可与马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌 阳性血清发生特异性反应，证明重组ompa3蛋白具有良好的反应原性，可以作为 沙门氏菌属抗血清检测用抗原；以ompa3蛋白作为包被抗原建立了间接elisa (ielisa)方法，确定的最佳反应条件如下：最佳包被抗原浓度为1μg/ml，待检 血清(1:200)37℃作用1h，酶标抗马二抗(1:10000稀释)，tmb在37℃孵育10min， 待检血清od450》0.143判定为阳性，特异性试验结果显示，该包被抗原与常见马 传染病阳性血清无交叉反应。通过对沙门氏菌静脉注射感染马的血清样品进行抗 体检测，ielisa可以持续监测抗体阳性到116天，相比微量凝集(69天)多监测 了47天，因此ielisa具有更好地敏感性。利用建立的ielisa方法对来自8个不同 养殖场的180份血清样品进行抗体检测，其抗体平均阳性检出率为63.3％，比微量 凝集阳性检出率高53.9％。
8.在上述研究的基础上，本发明提出了一种马流产沙门氏菌病4种致病病原菌 通用型间接elisa抗体检测试剂盒，所述的试剂盒中含有截短表达的沙门氏菌外 膜重组蛋白a(outer membrane proteina，ompa)包被的酶标板，所述的截短 表达的沙门氏菌外膜重组蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。
9.其中，优选的，所述的4种致病病原菌为马流产沙门氏菌(salmonella abortusequi s.abortus equi)、鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium s.typhi)、都柏林沙门氏菌 (s.dublin)以及肠炎沙门氏菌(s.enteritidis)。
10.其中，优选的，截短表达的沙门氏菌外膜重组蛋白a的包被抗原浓度为 1μg/ml，取100ul/孔包被96孔酶标板4℃过夜。
11.其中，优选的，所述的试剂盒中还含有hrp标记的抗马igg二抗，封闭液、 稀释液、显色液以及终止液。
12.其中，优选的，所述的封闭液为5％w/w的脱脂乳，在37℃封闭1.5h，所述 的稀释液为5％w/w的脱脂乳或5％w/wbsa，待检血清使用5％w/w的脱脂乳1:200 稀释，37℃作用1h，hrp标记的抗马igg二抗使用5％w/w bsa1:10000稀释， 37℃作用30min，所述的显色液为tmb显色液，37℃作用10min。
13.进一步的，本发明还提出了所述的试剂盒在制备检测马流产沙门氏菌病4种 致病病原菌试剂中的应用。
14.其中，优选的，所述的4种致病病原菌为马流产沙门氏菌(salmonella abortusequi s.abortus equi)、鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium s.typhi)、都柏林沙门氏菌 (s.dublin)以及肠炎沙门氏菌(s.enteritidis)。
15.其中，优选的，所述的试剂为间接elisa抗体检测试剂。
16.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
17.本发明利用pull down技术成功筛选到了马流产沙门氏菌病4种病原的共同优 势
抗原，明确了该抗原的检测特异性范围，并将其克隆到表达载体通过截短分段 表达实现了该ompa蛋白的可溶性表达，建立了马流产沙门氏菌病4种致病病原菌 通用型间接elisa抗体检测试剂盒以及相应的ompaielisa抗体诊断方法，实验 证明，使用该试剂盒建立的方法具有特异性强、敏感性高的优点，将成为马流产 沙门菌病抗体检测的一种有效工具，也为未来疫苗研发的抗体监测奠定了方法学 基础。
附图说明
18.图1为马流产沙门氏菌优势抗原的筛选；
19.其中，m:蛋白分子质量标准；1：纯化的马流产沙门氏菌阳性血清的igg抗 体；2：纯化的马流产沙门氏菌阴性血清的igg抗体；3：proteina/g magnetic beads +马流产沙门氏菌阳性血清igg抗体+马流产沙门氏菌抗原复合物；4：proteina/g magnetic beads+马流产沙门氏菌阴性血清igg抗体+马流产沙门氏菌抗原复合物； 5：马流产沙门氏菌抗原。
20.图2为目的基因的扩增；
21.其中，m:dm2000 dnamarker；1-2:ompa1；3-4：ompa2；5-6：ompa3。
22.图3为ompa蛋白的sds-page鉴定；
23.其中，m：蛋白分子质量标准；1：ompa1蛋白诱导后的上清；2：ompa1 蛋白诱导后的沉淀；3：ompa2蛋白诱导后的上清；4：ompa2蛋白诱导后的沉 淀；5：ompa3蛋白诱导后的上清；6：ompa3蛋白诱导后的沉淀。
24.图4为ompa3蛋白的westernblot鉴定；
25.其中，m：蛋白分子质量标准；1：马流产沙门氏菌阳性血清；2：鼠伤寒沙 门氏菌阳性血清；3：都柏林沙门氏菌阳性血清；4：肠炎沙门氏菌阳性血清；5： 沙门氏菌阴性血清。
26.图5为对感染马及对照马血清中马流产沙门氏菌抗体的监测结果。
27.其中，a.微量凝集实验(mat)检测结果；b.间接elisa(ielisa)检测结 果。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描 述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分，而不是全部的实施例，基于本 发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所 有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.实施例1
30.1材料与方法
31.试验于2018年3月至2022年3月在中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽 医生物技术国家重点实验室，由马传染病与慢病毒病研究创新团队进行。
32.1.1质粒和菌株及样品
33.马流产沙门氏菌菌种180316.h.aes.g(其菌种保藏编号为：cgmccno.18341，该菌种已记载在公开号为cn111100817a，发明名称为“马流产沙门氏 菌马源株及其在制备马流产沙门氏菌灭活疫苗中的应用”的专利申请中)由哈尔 滨兽医研究所马传染病与慢病毒创新团队分离鉴定并提供，原核表达宿主菌 rosetta(de3)购自tiangen，pet28a载体由本实验室保存；180份临床样品 来自8个不同的牧场，130份沙门氏菌阴性血清、感染马及对照马
共58份血清由 本实验室制备及保存。马传染性贫血病毒(equine infections anemin virus，eiav)、 马流感病毒(equine innuenza virus，eiv)、马疱疹病毒(equine herpes virus，ehv)、 马动脉炎病毒(equine arteritis virus，eav)、马泰勒虫(theileria equi,t.equi)、驽 巴贝斯虫(babesia caballi，b.caballi)马链球菌(streptococcus equi)、大肠杆菌 (escherichia coli)、马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙 门氏菌等阳性血清及沙门氏菌阴性血清由本实验室保存。
34.1.2主要试剂
35.iptg购自宝生物工程(大连)有限公司；dnamarkerdl 2000，t4 dna 连接酶，购自上海生工生物工程有限公司；琼脂糖为promega公司产品，兔源马 流产沙门氏菌阳性血清购自中国兽医药品监察所；细菌基因组dna提取试剂盒 购自tiangen。proteina/g magnetic beads(mce)，hrp标记的抗马igg二 抗(kpl)。
36.1.3马流产沙门氏菌优势抗原的筛选
37.首先对马流产沙门氏菌阳性、阴性血清进行igg抗体纯化，利用0.45μm滤 膜分别将2ml马流产沙门氏菌阳性血清和阴性血清进行过滤处理，抗体纯化按 照hitrap protein g hp(ge)说明书进行操作。其次制备马流产沙门氏菌抗原复 合物，在生物安全柜中取8ml处于对数期的马流产沙门氏菌新鲜菌液，4℃， 10000r/mim离心2min后收集菌体，然后加入2ml无菌pbs重悬，离心弃上 清，充分清洗菌体2次。然后加入1.5-2ml无菌pbs重悬，进行超声破碎。功 率39％，工作时间3s，间歇时间5s，再工作5min。最后将细菌裂解物，4℃， 10000r/min离心2min，取上清，利用bca法测定蛋白浓度，并稀释蛋白浓度 至1mg/ml备用。然后参照徐志超发表的方法(徐志超.鸡白痢沙门氏菌优势抗 原细菌铁蛋白诱导产生ifn-β的分子机理.2016:125)对马流产沙门氏菌抗体与抗 原进行pull-down试验；最后对质谱结果进行分析。
38.1.4ompa基因的克隆
39.根据质谱分析结果参考序列，将ompa基因利用以下引物进行扩增，反应体 系20μl：2
×
taq mastermix，10μl；上下游引物，1μl；ddh20，6μl；马流产 沙门氏菌基因组为模板，2μl；反应条件为：预变性95℃5min；95℃变性30s， 58℃退火30s，72℃延伸30s(600bp以内延伸30s、600-1000bp延伸60s、 1000-1500bp延伸90s)，共35个循环；72℃终延伸10min；待pcr反应结束 后，取7μlpcr产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳分析。依据gel extraction kit琼 脂糖凝胶dna回收试剂盒说明书，纯化回收特异的dna条带。pet28a载体和 目的片段分别用bamh i和xhoi i进行双酶切，回收纯化基因和线性化的pet-28a。 用t4 dna连接酶连接ompa基因和线性化的pet-28a，将连接产物转化入rosetta， 涂布于卡那抗性的lb固体培养基，37℃，培养16h。对阳性克隆菌落提取质粒， 经过pcr方法鉴定阳性质粒送库美生物进行测序，测序正确后质粒命名为 pet28a-ompa1、pet28a-ompa2、pet28a-ompa3。
40.表1p cr扩增引物
41.[0042][0043]
1.5 ompa蛋白的表达与纯化
[0044]
将pet28a-ompa1、pet28a-ompa2、pet28a-ompa3的阳性菌落，接种于5ml 含有1μg/ml卡那青霉素(kanamycin,kan)抗性的新鲜lb液体培养基中，在37℃ 下170r/min震荡培养16h，以1:100比例接种于kan/lb液体培养基中，37℃170 r/min培养，等到菌液od
600nm
为0.3-0.4左右时，加入终浓度为0.6mm的iptg， 24℃进行诱导表达。诱导后，取4ml菌液，进行富集菌体并加入1.5ml pbs进 行超声破碎，38％功率，超5s停5s，工作时长2min；破碎后，4℃、12000r/min 离心5min，上清备用。沉淀同样用等量pbs冲洗两遍，再用等量pbs重悬。分 别取40μl上清样品和沉淀重悬样品并各加入10μl 5x sds-page loadingbuffer混合均匀，95℃煮沸5min，利用4-12％或12％的蛋白胶进行sds-page； 电泳结束后，用于考马斯亮蓝染色，分析蛋白的表达情况。参照刘聪的实验方法 对可溶性蛋白进行纯化(刘聪.马nlrp3激活系统的建立及其在eiav感染调控 炎症反应研究中的初步应用[d].中国农业科学院,2019.)，并对可溶性蛋白ompa3 进行western blot分析，分别以马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门 氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清和沙门氏菌阴性血清为一抗(1:200稀释)，hrp标 记的抗马igg为二抗(1:5000)进行western blot分析，验证蛋白的反应原性和 广谱性。
[0045]
1.6 ompa间接elisa(ompa ielisa)方法的建立
[0046]
用棋盘法确定最佳ompa3蛋白包被浓度和血清样品、酶标二抗(hrp标记 抗马igg二抗)的稀释倍数。用磷酸盐缓冲液将重组ompa3蛋白稀释成1μg/ml、 0.5μg/ml及0.25μg/ml，取100ul/孔包被96孔酶标板4℃过夜，将马流产沙门 氏菌阳性、阴性血清按1:200-1:1600进行2倍倍比系列稀释，酶标二抗做1:8000、 1:10000、1:12000、1:15000稀释，进行间接elisa，加入tmb，作用10min酶 标仪检测od
450nm
值。选取p/n值最大(p/n为阳性血清与阴性血清在相同稀释 度下od
450nm
值的比值)，且满足阴性血清od
450nm
《0.1时的抗原包被浓度、血清 稀释度、酶标二抗稀释度为最佳反应条件。利用建立的间接elisa方法对130 份马流产沙门氏菌阴性血清进行检测，计算全部阴性血清od
450nm
的平均值(x) 和标准差(sd)，并确定x+3sd作为该方法检测临床马流产沙门氏菌抗体阳性和 阴性的临界值。
[0047]
1.7 ompa ielisa方法的特异性、敏感性检测
[0048]
利用建立的ielisa检测马流产沙门氏菌、马传染性贫血病病毒、马流感病 毒(h7n7、h3n8)、马动脉炎病毒、马疱疹病毒(i型、ii型、iii型、iv型、 vii型)、马泰勒虫、驽巴贝斯虫、马腺疫链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门 氏菌、肠炎沙门氏菌等病原的阳性血清，同时设立阴性血清对照，重复2个孔， 验证该方法的特异性。选取马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、 肠炎沙门氏菌阳性血清，对阳性血清先进行2倍系列稀释，然后再利用ompaielisa方法评估4种血清的的检测敏感性，其中血清检测阳性时的最大稀释度即 为检测效价。
[0049]
1.8 ompa ielisa监测马流产沙门氏菌感染后马血清中的抗体水平。
0.018)通过生物学统计分析方法计算出临床血清检测时阳性和阴性血清的临界值 (x+3sd)为0.143，当临床血清od
450nm
值大于临界值则判为阳性，低于临界值 则判为阴性。
[0066]
2.7特异性鉴定结果
[0067]
利用建立的ompaielisa方法对马流产沙门氏菌、马传染性贫血病病毒、 马流感病毒(h7n7、h3n8)、马动脉炎病毒、马疱疹病毒(i型、ii型、iii型、 iv型、vii型)、马腺疫链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门 氏菌等阳性血清检测，结果显示，只有马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏 林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清的检测结果为阳性，而其他病原阳性血清检 测结果均为阴性。
[0068]
2.8敏感性鉴定结果
[0069]
利用建立的ompaielisa方法对马流产沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏 林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌标准阳性血清进行效价测定，结果表明，马流产沙门 氏菌、鼠伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、肠炎沙门氏菌阳性血清效价均可以达 到16。
[0070]
2.9人工感染动物血清的抗体监测
[0071]
利用mat和建立的ompaielisa方法，对感染马及对照马进行抗体检测。 mat结果表明(图5a)，在以静脉10
10
cfu/ml感染马时，mat第四天抗体即 可出现阳性，7-12天达到顶峰，12天后抗体水平逐渐下降，维持抗体阳性至69 天，之后抗体转阴性。ompaielisa结果表明(图5b)，第7天抗体转为阳性， 比mat晚3天。第13-20天，达到顶峰。之后不断下降。ompaielisa维持到 116天仍为阳性水平。
[0072]
2.10临床样品检测
[0073]
对来自8个农场的180份血清进行检测，mat结果表明，对于有流产流行的 4个农场抗体阳性检出率为7％—42.9％，而非流产流行区抗体阳性检出率0％。 而本发明建立的ompaielisa方法，对于有流产流行4个农场，其抗体阳性检 出率为42.9-100％，而非流产流行区，抗体阳性检出率为0％，结果如表2。同时 对检测结果进行统计，结果表明，微量凝集和ompaielisa检测结果均为阳性 的样品份数是14，检测结果均为抗体阴性的是66份，其中ompaielisa比微量 凝集多检出97份，结果如表3。
[0074]
表2临床样本的检测
[0075]
[0076][0077]
表3两种方法检测结果的比较
[0078]