一种抗核抗体联合检测试剂盒的制作方法

1.本技术涉及医学检测的技术领域，更具体地涉及一种抗核抗体联合检测试剂盒。


背景技术：

2.抗核抗体(antinuclear antibody，ana)，又称抗核酸抗原抗体，是一组对细胞核内的dna、rna、蛋白或这些物质的分子复合物产生的自身抗体。按细胞核内各个分子的性能不同，可将各ana分为抗dna抗体、抗组蛋白抗体、抗非组蛋白抗体以及抗核仁抗体等。每一大类又因不同抗原特性而再分为许多种类。因此，ana在广义上是一组各有不同临床意义的自身抗体，更确切的名称应为抗核抗体谱。ana主要存在于igg，也见于igm、iga，甚至igd及ige中。
3.抗核抗体谱检测的抗体包括：
4.(1)抗dsdna抗体：抗双链dna(dsdna)抗体是系统性红斑狼疮(sle)的特异性抗体，与疾病的活动度密切相关。除抗sm抗体外，抗dsdna抗体作为sle的一个血清学指标，根据检测方法以及疾病活动度的不同，抗dsdna抗体的阳性率为20-90％。同时，抗dsdna抗体也可能见于其它自身免疫性疾病和感染性疾病，极少数情况下出现于健康人群。
5.(2)抗smd1抗体：抗smith(sm)抗体对sle具有较高的特异性，患者中抗sm抗体的阳性检出率为5-40％，抗sm抗体被认为同抗dsdna抗体一起参与疾病的致病过程，但是，抗sm抗体的敏感性较低。而sm核心抗原中smd1的83—119号肽段对于sle具有最佳的敏感性和特异性。
6.相对而言，抗smd1抗体的敏感性为68％，远高于抗sm抗体的敏感度(32％)。同时，抗smd1抗体联合抗dsdna抗体的敏感性可达79％，高于抗sm抗体联合抗dsdna抗体的敏感度(67％)。
7.(3)抗核小体(nucleosomes)抗体：抗nucleosomes抗体也是sle的特异性指标，患者中抗nucleosomes抗体的阳性率达到50-95％，抗nucleosomes抗体联合抗dsdna抗体可提高sle的检出率。
8.(4)抗组蛋白(histones)抗体：抗histones抗体会出现在多种自身免疫性疾病中，且抗组蛋白(histones)抗体是药物诱导性狼疮的特异性抗体。若检测出抗histones抗体呈阴性，则可以排除药物诱导性狼疮。但是，若检测出抗histones抗体呈阳性，则可能为多种自身免疫疾病。系统性红斑狼疮患者中抗histones抗体的阳性率为30-70％，类风湿性关节炎患者中抗histones抗体的阳性率为5-50％，自身免疫性肝炎患者和系统性硬化症患者中抗histones抗体的阳性率也有35％，在其他自身免疫性疾病中抗histones抗体也会表现出阳性。
9.(5)抗ss-a/ro 60抗体：在原发性干燥综合症患者中抗ss-a/ro 60抗体的阳性率70～90％；抗ss-a/ro 60抗体也可见于系统性红斑狼疮，在系统性红斑狼疮中抗ss-a/ro 60抗体的阳性率为20-60％；在新生儿红斑狼疮中抗ss-a/ro 60抗体的阳性率为100％，且抗ss-a/ro 60抗体可经胎盘传给胎儿，从而引起胎儿的炎症反应和新生儿先天性心脏传导
阻滞。
10.(6)抗ss-a/ro 52抗体：抗ss-a/ro 52抗体是自身免疫性疾病中是一个非特异性指标，在多种自身免疫性疾病中均可表现出阳性。
11.(7)抗ss-b/la抗体：抗ss-b/la抗体是干燥综合征的标志性抗体，原发性干燥综合征中抗ss-b/la抗体的阳性率为40％；抗ss-b/la抗体也会在系统性红斑狼疮患者中表现出阳性。在干燥综合征中，抗ss-a抗体和抗ss-b抗体通常会同时出现。
12.(8)抗着丝点(cenp-b)抗体：抗cenp-b抗体是局限性皮肤型硬化症的标志性抗体，阳性率为13.4-45.1％，抗cenp-b抗体的出现预示着预后良好。
13.(9)抗拓扑异构酶ⅰ(scl 70)抗体：抗scl 70抗体是弥漫性皮肤型硬化症的标志性抗体，阳性率为18-59.5％，抗scl 70抗体可作为预后不良的生物标志物，出现快速进展的皮肤增厚、肾危象、胃窦血管扩张(gave)和癌症。
14.(10)抗组胺酰trna合成酶(jo-1)抗体：抗jo-1抗体是肌炎特异性抗体，抗jo-1抗体是抗合成酶抗体中的阳性率最高的一种，阳性率为22-30％。
15.(11)抗pm-scl抗体：抗pm-scl抗体是肌炎相关自身抗体，阳性率为5-10％，也可在合并的结缔组织病和系统性硬化症中表现出阳性。
16.(12)抗u1-snrnp抗体：在混合性结缔组织病(mctd)患者中存在高滴度的抗u1-snrnp抗体。在肌炎患者中抗u1-snrnp抗体的阳性率为10-15％，也可在合并的结缔组织病、系统性硬化症和系统性红斑狼疮中表现出阳性。
17.(13)抗核糖体p蛋白抗体：抗核糖体p蛋白抗体是sle的相关抗体，阳性率为6-20％，与sle的神经系统、肾脏和肝脏的受累相关。
18.(14)抗增殖性细胞核抗原(pcna)抗体：抗pcna抗体也是sle的相关抗体，阳性率为5-10％。
19.(15)抗线粒体m2(ama-m2)抗体：高效价的抗ama-m2抗体是原发性胆汁性胆管炎的标志，对原发性胆汁性胆管炎(pbc)具有良好的敏感度和特异性。
20.上述抗核抗体在临床症状前就会出现，部分自身抗体还参与了疾病的进展，且某一种自身免疫性疾病可检测出多种抗核抗体，一种抗核抗体也可能涉及多种相关的自身免疫性疾病。
21.目前，对于上述自身抗体的检测大多为单一自身抗体的单独检测。然而，由于自身免疫性疾病的发病机制与免疫机能密切相关，且病症种类较多，还可能同时存在多种病症。故仅针对单一自身抗体的检测结果不能准确定位自身免疫性疾病的病症。由于上述自身抗体的检测为单独检测，要想获得多种自身抗体的检测结果，需要分别检测，故会花费较长的周期。


技术实现要素：

22.本技术提供一种抗核抗体联合检测试剂盒，能够同时15种抗核抗体进行定性和定量检测，且准确率较高。
23.本技术提供的一种抗核抗体联合检测试剂盒，采用如下的技术方案：
24.一种抗核抗体联合检测试剂盒，所述试剂盒包括：
25.由dsdna抗原、smd1抗原、nucleosome抗原、histones抗原、ss-a/ro 60抗原、ss-a/
ro 52抗原、ss-b/la抗原、cenp-b抗原、scl70抗原、jo-1抗原、pm-scl抗原、u1-snrnp抗原、核糖体p蛋白抗原、pcna抗原、ama-m2抗原分别包被的荧光编码微球的混合液；
26.利用荧光素标记的二抗溶液；样本稀释液；微球清洗液；
27.所述dsdna抗原为噬菌体pm2dna；
28.所述噬菌体pm2dna的核苷酸序列如seq id no：1所示。
29.本技术选择噬菌体pm2dna作为dsdna抗原制备试剂盒中的混合液，能够有效提高阴性、阳性检测结果的准确性。相比于当dsdna抗原选择diarect、human-lia、human-elisa以及sigma时，选择选择噬菌体pm2dna作为dsdna抗原具有更高的阳性符合率和阴性符合率。因此，选择噬菌体pm2dna作为dsdna抗原，能够有效提高检测结果的准确性。
30.本技术的试剂盒主要包括混合液和二抗溶液。混合液中包含由dsdna抗原、smd1抗原、nucleosome抗原、histones抗原、ss-a/ro 60抗原、ss-a/ro 52抗原、ss-b/la抗原、cenp-b抗原、scl70抗原、jo-1抗原、pm-scl抗原、u1-snrnp抗原、核糖体p蛋白抗原、pcna抗原、ama-m2抗原分别包被的荧光编码磁性微球；在进行抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体定量联合检测的过程中，先将待测样本与混合液反应，通过混合液中的dsdna抗原、smd1抗原、nucleosome抗原、histones抗原、ss-a/ro 60抗原、ss-a/ro 52抗原、ss-b/la抗原、cenp-b抗原、scl70抗原、jo-1抗原、pm-scl抗原、u1-snrnp抗原、核糖体p蛋白抗原、pcna抗原、ama-m2抗原分别与待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体间接与荧光编码磁性微球结合。
31.利用荧光素标记的二抗溶液中包含抗人igg抗体。在待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体间接与荧光编码磁性微球结合后，再利用荧光素标记抗人igg抗体与待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体识别和结合，从而完成对待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的荧光标记。再利用流式细胞仪对待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体进行检测，获得待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体各
自对应的荧光信号强度，再根据利用校准品制备的标准曲线中抗体相对浓度与荧光信号强度的关系，以检测获得的待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体各自对应的荧光信号强度为基础，找到与之对应的抗体相对浓度，从而获得待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体各自对应的浓度，完成对待测样本中抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的相对浓度检测。
32.试剂盒中除了包括混合液和二抗溶液外，还包括校准品和缓冲液。校准品为含有抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的标准浓度溶液，通过利用上述试剂盒检测不同浓度的标准溶液的荧光信号强度，从而获得抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体与荧光信号强度的标准曲线。因此，利用本技术的试剂盒，可同时检测获得待测样本中抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的相对浓度。
33.所述样本稀释液为包含1％的bsa的1xpbs。
34.所述微球清洗液为包含1％的吐温-20的1xpbs。
35.优选的，所述dsdna抗原为环状噬菌体pm2dna。
36.噬菌体pm2dna有噬菌体pm2线性dna和噬菌体pm2环状dna，当dsdna抗原为环状噬菌体pm2dna时的阳性符合率高于当dsdna抗原为线状噬菌体pm2dna时的阳性符合率。因此，dsdna抗原进一步优选为噬菌体pm2环状dna。
37.u1-snrnp 68/70kd为u1-snrnp 68kd和u1-snrnp 70kd的化合物。
38.优选的，所述u1-snrnp抗原中rnp a、u1-snrnp c、u1-snrnp 68/70kd的重量比为(1-30)：(1-30)：(1-30)。
39.优选的，所述u1-snrnp抗原中rnp a、u1-snrnp c、u1-snrnp 68/70kd的重量比为(5-20)：(10-30)：(10-30)。
40.在一个具体的实施方式中，所述u1-snrnp抗原中rnp a、u1-snrnp c、u1-snrnp68/70kd的重量比可以是5：(10-30)：(10-30)、5：(20-30)：(10-30)、5：20：(20-30)、5：20：20。
41.在一个具体的实施方式中，所述u1-snrnp抗原中rnp a、u1-snrnp c、u1-snrnp68/70kd的重量比可以是30：30：30、10：20：30、10：20：20、10：30：20。
42.在一个具体的实施方式中，所述u1-snrnp抗原中rnp a、u1-snrnp c、u1-snrnp68/70kd的重量比可以是5：10：10、5：20：30、5：20：20、5：30：20。
43.经过试验分析可知，当rnp a、u1-snrnp c或u1-snrnp 68/70kd的添加比例为(5-20)：(10-30)：(10-30)，检测结果中阳性符合率为83.33％以上。尤其是，当rnp a、u1-snrnp c或u1-snrnp 68/70kd的添加比例为5：20：20时，检测结果中阳性符合率能够达到100％。因此，在进行rnp a、u1-snrnp c或u1-snrnp 68/70kd配合作为u1-snrnp抗原时，通过降低rnp a的添加量，可以有效提高检测结果中的阳性符合率，从而提高检测结果的准确性。
44.优选的，所述二抗溶液中，包含抗人igg抗体，抗人igg抗体的浓度为10-50μg/ml。
45.在一个具体的实施方式中，所述二抗溶液中，抗人igg抗体的浓度为10-30μg/ml。
46.通过采用上述技术方案，经过试验分析，制备二抗溶液的过程中，将荧光素标记的抗人igg抗体浓度控制在上述范围内，相同抗体相对浓度下检测获得的荧光信号强度的变化梯度基本一致；当荧光素标记的抗人igg浓度为5μg/ml时，抗体相对浓度在高点值时检测获得的荧光信号强度较低，而当荧光素标记的抗人igg的浓度为60μg/ml时，抗体相对浓度在0点值时检测获得的荧光信号强度过高。由此可知，将溶液b中荧光素标记的抗人igg抗体浓度控制在上述范围内时，能够获得较为稳定的荧光信号强度，故最终获得的待测样本中抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体相对浓度较准确。因此，将二抗溶液中荧光素标记的抗人igg抗体的浓度控制在10-50μg/ml的范围内。
47.优选的，所述荧光编码微球为磁性荧光编码微球。
48.本技术利用磁性荧光编码微球配合全自动一起使用，无需手工操作，减轻了试验人员的工作负担。
49.优选的，所述荧光素包括藻红蛋白(pe)、pe-cy7、异硫氰酸荧光素(fitc)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物(percp)、别藻青蛋白(apc)、alexa fluo488。
50.通过采用上述方案，本技术中用到的荧光素如上所述，利用上述荧光素均可以对抗人igg抗体进行荧光标记。
51.藻红蛋白是从红藻中分离纯化的一种荧光蛋白，是一种新型荧光标记染料，因为其具有强烈的荧光，很好的吸光性能和很高的量子产量，在可见光谱区有很宽的激发及发射范围，故在免疫荧光、免疫组化、流式细胞仪检测等抗体的荧光标记和活体成像中有着广泛的应用。pe-cy7是一种基于藻红蛋白的偶联荧光染料。
52.异硫氰酸荧光素是生化试剂，也是医学诊断药品，主要用于荧光抗体技术中的荧光染料，能和各种抗体蛋白结合，结合后的抗体不丧失与一定抗原结合的特异性，并在碱性溶液中具有强烈的绿色荧光，用于医学、农学和畜牧等多方面，可对由细菌病毒和寄生虫等所致疾病进行快速诊断。alexa fluo488是一种小分子荧光染料，激发及发射波长与异硫氰酸荧光素类似，但光稳定性更强。
53.多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物是从横烈甲纲门中分离出来的，它具有非常高的淬灭系数、高量子能效和很大的斯托克位移。percp属于活体荧光成像蛋白标记染料，能产生更高、耐光性更好的荧光，相对短波长的青蓝素染料而言，活体荧光成像蛋白标记染料是青蓝素染卓料越的替代品。percp通常用于荧光免疫标记，另外，percp还用于多色彩细胞的
流式细胞分析，故percp可以和fitc、pe和其他荧光物质一同用于多色彩分析中。
54.本技术提供的试剂盒的检测方法如下：
55.(1)利用样本稀释液对待测样本进行稀释，获得稀释样；
56.(2)将步骤(1)获得的稀释样与混匀液a混合，37℃反应20min，获得抗体-抗原-微球复合物；
57.(3)利用微球清洗液对步骤(2)获得的抗体-抗原-微球复合物进行清洗，并去除微球清洗液；
58.(4)将步骤(3)清洗后的抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液混匀，37℃反应20min，获得标记后的二抗-抗体-抗原-微球复合物；
59.(5)利用微球清洗液对步骤(4)获得的二抗-抗体-抗原-微球复合物进行清洗，并去除微球清洗液；
60.(6)利用微球清洗液对步骤(5)清洗后的二抗-抗体-抗原-微球复合物重悬，进行上样检测，并分析检测结果。
61.利用上述试剂盒及其检测方法，对待测样本进行检测，具体包括待测样本与混合液的反应，将待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体与荧光编码磁性微球上dsdna抗原、smd1抗原、nucleosome抗原、histones抗原、ss-a/ro 60抗原、ss-a/ro 52抗原、ss-b/la抗原、cenp-b抗原、scl70抗原、jo-1抗原、pm-scl抗原、u1-snrnp抗原、核糖体p蛋白抗原、pcna抗原、ama-m2抗原结合，获得抗体-抗原-微球复合物，从而实现待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的定位；然后将抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液反应，利用二抗溶液中荧光素标记的抗人igg抗体与定位在荧光编码磁性微球上的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体反应，进行抗原抗体结合反应，从而完成待测样本中待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的荧光标记，获得二抗-抗体-抗原-微球复合物；最后，二抗-抗体-抗原-微球复合物进行定容，获得检测液，并利用流式细胞仪对检测液进行检测，获得待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体各自对应的荧光信号强度，再根据利用检测校准品获得的抗原抗体相对浓度与荧光信号强度关系的标准曲线，以检测获得的待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗
体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体各自对应的荧光信号强度为基础，找到与之对应的抗原抗体相对浓度，从而获得待测样本中的待测抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体各自对应的浓度，完成对待测样本中抗lkm-1抗体、抗lc-1抗体、抗sla抗体、抗ama-m2抗体、抗sp100抗体、抗gp210抗体和抗asma抗体抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的相对浓度检测。
62.待测样本与混合液的反应时间可以是10-30min。经过试验分析，待测样本与混合液的反应时间控制在上述范围内时，检测获得的抗lkm-1抗体、抗lc-1抗体、抗sla抗体、抗ama-m2抗体、抗sp100抗体、抗gp210抗体和抗asma抗体的抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体荧光信号强度呈现持续增长的趋势；当待测样本与混匀液a反应时间小于上述范围时，检测获得的抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的荧光信号强度小于反应时间处于上述范围内时检测获得的抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的荧光信号强度；当待测样本与混合液的反应时间大于上述范围时，检测获得的抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的荧光信号强度增长趋势已减缓，且基本不变。因此，为了能够获得更加准确的待测样本中抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的信息，待测样本与混合液的反应时间选择控制在10-30min的范围内。
63.优选的，待测样本与混合液的反应时间为20min。
64.抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应时间可以是10-30min。经过试验分析，抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应时间控制在上述范围内时，检测获得的抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的荧光信号强度呈现持续增长的趋势；当抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应时间小于上述范围时，检测获得的抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗
u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的荧光信号强度小于反应时间处于上述范围内时检测获得的抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的荧光信号强度；当抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应时间大于上述范围时，检测获得的抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的荧光信号强度增长趋势已减缓，且基本不变。因此，为了能够获得更加准确的待测样本中抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的信息，抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应时间选择控制在10-30min的范围内。
65.优选的，抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应时间为20min。
66.优选的，混合液与待测样本、抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应温度为37
±
1℃。
67.经过试验分析，反应温度为37℃时，检测获得的抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的荧光信号强度均大于孵育温度为室温(18-25℃)时检测获得的抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的荧光信号强度。因此，为了能够获得更加准确的待测样本中抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的信息，孵育温度选择控制在37
±
1℃的范围内。
68.优选的，所述待测样本为全血样本。
69.优选的，所述待测样本为血清或血浆样本。
70.优选的，待测样本与混合液的添加比例为：每1μl待测样本对应加入50-500个抗原包备的荧光编码磁性微球。
71.优选的，待测样本的添加量为10-100μl。优选为50μl。
72.通过采用上述技术方案，经过试验分析，将待测样本与混合液的添加比例控制在上述范围内，能够保证最终检测获得较为准确的荧光信号强度，从而获得较为准确的抗体相对浓度。同理，将待测样本的添加量控制在上述范围内时，能够保证最终检测获得较为准确的荧光信号强度，从而获得较为准确的抗原抗体相对浓度。
73.综上所述，本技术具有以下有益效果：
74.本技术提供的试剂盒能够单次同时完成待测样本中抗dsdna抗体、抗smd1抗体、抗nucleosome抗体、抗histones抗体、抗ss-a/ro 60抗体、抗ss-a/ro 52抗体、抗ss-b/la抗
体、抗cenp-b抗体、抗scl70抗体、抗jo-1抗体、抗pm-scl抗体、抗u1-snrnp抗体、抗核糖体p蛋白抗体、抗pcna抗体、抗ama-m2抗体的定性和定量检测。即通过一次检测，得出15个检测指标的检测结果。相比相关技术中的线性免疫印迹法只能提供定性/半定量检测结果，酶联免疫吸附法则是只能定量检测，本技术提供的试剂盒能够同时实现定性和定量检测。
具体实施方式
75.本技术提供了一种抗核抗体联合检测试剂盒，所述试剂盒包括：由dsdna抗原、smd1抗原、nucleosome抗原、histones抗原、ss-a/ro 60抗原、ss-a/ro 52抗原、ss-b/la抗原、cenp-b抗原、scl70抗原、jo-1抗原、pm-scl抗原、u1-snrnp抗原、核糖体p蛋白抗原、pcna抗原、ama-m2抗原分别包被的荧光编码微球的混合液；利用荧光素标记的二抗溶液；样本稀释液；微球清洗液。其中，dsdna抗原为噬菌体pm2dna。噬菌体pm2dna的核苷酸序列如seq id no：1所示。进一步地，dsdna抗原为环状噬菌体pm2dna。
76.其中，smd1抗原为smd1核心83-119号肽段。smd1抗原的氨基酸序列如seq id no：2所示。
77.上述u1-snrnp抗原中rnp a、u1-snrnp c、u1-snrnp 68/70kd的重量比为(1-30)：(1-30)：(1-30)。进一步地，u1-snrnp抗原中rnp a、u1-snrnp c、u1-snrnp 68/70kd的重量比为(5-20)：(10-30)：(10-30)。
78.上述荧光编码微球为磁性荧光编码微球。上述二抗溶液中，包含抗人igg抗体，抗人igg抗体的浓度为10-50μg/ml。上述荧光素包括藻红蛋白(pe)、异硫氰酸荧光素(fitc)、多甲藻黄素-叶绿素-蛋白复合物(percp)、别藻青蛋白(apc)。上述试剂盒的待测样本为全血样本或血清、血浆样本。上述混合液与待测样本的反应时间为10-30min。上述混合液与待测样本反应后的物质与二抗溶液的反应时间为10-30min。上述待测样本与混合液的添加比例为：每1μl待测样本对应加入50-500个抗原包备的荧光编码磁性微球。上述混合液与待测样本、抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液的反应温度为37
±
1℃。
79.其中，dsdna抗原制备方法如下：
80.用噬菌体dna提取试剂盒，提取噬菌体pm2dna；然后通过pcr克隆选定的基因片段，pcr克隆出的基因片段如seq id no：1所示，即为噬菌体pm2线状dna；
81.将噬菌体pm2线状dna构建到pcdna质粒中，即获得噬菌体pm2环状dna。
82.以下结合制备例1-25、实施例1-20、对比例1-4以及检测试验对本技术作进一步详细说明。
83.制备例
84.制备例1
85.本制备例提供了一种由dsdna抗原、smd1抗原、nucleosome抗原、histones抗原、ss-a/ro 60抗原、ss-a/ro 52抗原、ss-b/la抗原、cenp-b抗原、scl70抗原、jo-1抗原、pm-scl抗原、u1-snrnp抗原、核糖体p蛋白抗原、pcna抗原、ama-m2抗原分别包被的荧光编码微球的混合液。
86.本制备例中，dsdna抗原的种类为噬菌体pm2线状dna。
87.该混合液的制备方法具体包括以下步骤：
88.(1)预处理：
89.获取微球：分别取100μl荧光编码磁性微球悬浮液(约1
×
107个微球)于15个离心管中，并将15个离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；
90.微球洗涤与重悬：分别向15个离心管中加入200μl微球洗涤液，涡旋10s，并将离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；继续重复洗涤两次；分别向15个离心管中加100μl微球洗涤液重悬微球，涡旋10s以混匀微球，获得15个微球重悬液a。
91.(2)活化：
92.活化微球：分别向15个微球重悬液a中加入10μl活化剂溶液，涡旋10s后，室温下避光反应20-30min，并将15个离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；
93.活化后微球的洗涤与重悬：分别向15个离心管中加入200μl微球洗涤液，涡旋10s，并将15个离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；继续重复洗涤两次；分别向15个离心管中加入100μl微球洗涤液重悬微球，涡旋10s以混匀微球，获得715个微球重悬液b。
94.(3)包被：
95.微球包被：分别向15个微球重悬液b中加入dsdna抗原、smd1抗原、nucleosome抗原、histones抗原、ss-a/ro 60抗原、ss-a/ro 52抗原、ss-b/la抗原、cenp-b抗原、scl70抗原、jo-1抗原、pm-scl抗原、核糖体p蛋白抗原、pcna抗原、ama-m2抗原，加入量均为30μg，继续加入u1-snrnp抗原；涡旋混匀后，室温下避光反应24h；将反应后的15个离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；其中，u1-snrnp抗原中rnp a、u1-snrnp c、u1-snrnp 68/70kd三者的添加量分别为30μg、0μg、0μg。
96.包被后封闭：分别向15个离心管中加入等体积的封闭液，进行封闭反应，室温下避光封闭4h，将反应后的15个离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液。
97.包被后微球的洗涤与重悬：分别向15个离心管中加入200μl微球保存缓冲液，涡旋10s，将15个离心管置于磁力架，进行磁性吸附，分离弃去上清液；继续重复洗涤两次；分别向15个离心管中加入1ml微球保存缓冲液重悬微球，涡旋10s以混匀微球，获得15种荧光编码磁性微球重悬液。
98.(4)保存：分别将15种荧光编码磁性微球重悬液置于2-8℃避光保存；将15种荧光编码磁性微球重悬液按等重量混合，即为混合液。
99.制备例2-14
100.制备例2-14分别提供了一种由dsdna抗原、smd1抗原、nucleosome抗原、histones抗原、ss-a/ro 60抗原、ss-a/ro 52抗原、ss-b/la抗原、cenp-b抗原、scl70抗原、jo-1抗原、pm-scl抗原、u1-snrnp抗原、核糖体p蛋白抗原、pcna抗原、ama-m2抗原分别包被的荧光编码微球的混合液。
101.上述制备例的不同之处在于：u1-snrnp抗原中rnp a、u1-snrnp c、u1-snrnp68/70kd三者的添加量。
102.上述制备例提供的混合液u1-snrnp抗原中三种抗原原料的添加量如表1所示。
103.表1 制备例1-14的混合液u1-snrnp抗原中三种抗原原料的加入量
[0104][0105][0106]
制备例15-19
[0107]
制备例15-19分别提供了一种由dsdna抗原、smd1抗原、nucleosome抗原、histones抗原、ss-a/ro 60抗原、ss-a/ro 52抗原、ss-b/la抗原、cenp-b抗原、scl70抗原、jo-1抗原、pm-scl抗原、u1-snrnp抗原、核糖体p蛋白抗原、pcna抗原、ama-m2抗原分别包被的荧光编码微球的混合液。
[0108]
制备例15-19与制备例1的不同之处在于：dsdna抗原所选择的种类。具体如表2所示。
[0109]
表2 制备例15-20中dsdna抗原的种类
[0110]
制备例dsdna抗原的种类dsdna来源11噬菌体pm2-环状噬菌体dna15噬菌体pm2-线状噬菌体dna16diarect来源于细菌17human-lia来源于细菌18human-elisa合成dna(puc18)19sigma来源于小牛胸腺
[0111]
制备例20
[0112]
本制备例提供了一种利用荧光素标记的二抗溶液。该利用荧光素标记的二抗溶液的制备方法具体包括以下步骤：
[0113]
1.配制pbs-tnp溶液，配方如下：
[0114]
将na2hpo4·
12h2o 2.9g、kh2po
4 0.2g、nacl 8g、kcl 0.2g、di h2o 0.9l混合，并加入t-20 0.2ml、pc-300 0.5ml、bsa 1g；调ph至7.4，然后利用无菌水定容至1l。
[0115]
2.将配制好的pbs-tnp溶液，将用荧光素标记的二抗溶液以1：10000的比例稀释，使终浓度为5ug/ml。
[0116]
制备例21-24
[0117]
制备例21-24分别提供了利用荧光素标记的二抗溶液。制备例21-24与制备例20的
不同之处在于：利用荧光素标记的二抗溶液的终浓度。具体如表3所示。
[0118]
表3 制备例20-24中利用荧光素标记的二抗溶液的终浓度
[0119]
制备例终浓度(ug/ml)2052110222023302450
[0120]
实施例
[0121]
实施例1-19
[0122]
实施例1-19分别提供了一种抗核抗体联合检测试剂盒。实施例1-19的不同之处在于其中的混合液和利用荧光素标记的二抗溶液。具体如表4所示。
[0123]
上述提供的人自身免疫性疾病检测试剂盒的组分如下：
[0124]
由dsdna抗原、smd1抗原、nucleosome抗原、histones抗原、ss-a/ro 60抗原、ss-a/ro 52抗原、ss-b/la抗原、cenp-b抗原、scl70抗原、jo-1抗原、pm-scl抗原、u1-snrnp抗原、核糖体p蛋白抗原、pcna抗原、ama-m2抗原分别包被的荧光编码微球的混合液；利用荧光素标记的二抗溶液；样本稀释液；微球清洗液。
[0125]
表4 实施例1-19中混合液和二抗溶液的种类
[0126][0127]
对比例
[0128]
对比例1-4
[0129]
对比例1-4分别提供了一种抗核抗体联合检测试剂盒。对比例1-4与实施例1的不同之处在于组分中的混合液。具体如表5所示。
[0130]
表5 对比例1-4中混合液和二抗溶液的种类
[0131][0132]
检测试验一
[0133]
分别利用上述实施例1-14、16-19提供的一种抗核抗体联合检测试剂盒进行待测样本的检测。待测样本的类型和数量分别如表6所示。
[0134]
上述一种抗核抗体联合检测试剂盒的检测方法如下：
[0135]
(1)利用样本稀释液对待测样本进行稀释，获得稀释样；
[0136]
(2)将步骤(1)获得的稀释样与混匀液a混合，37℃反应20min，获得抗体-抗原-微球复合物；
[0137]
(3)利用微球清洗液对步骤(2)获得的抗体-抗原-微球复合物进行清洗，并去除微球清洗液；
[0138]
(4)将步骤(3)清洗后的抗体-抗原-微球复合物与二抗溶液混匀，37℃反应20min，获得标记后的二抗-抗体-抗原-微球复合物；
[0139]
(5)利用微球清洗液对步骤(4)获得的二抗-抗体-抗原-微球复合物进行清洗，并去除微球清洗液；
[0140]
(6)利用微球清洗液对步骤(5)清洗后的二抗-抗体-抗原-微球复合物重悬，进行上样检测，并分析检测结果。
[0141]
检测结果如表6、表7所示。
[0142]
表6 利用实施例1-14、实施例16-19提供的试剂盒的u1-snrnp检测结果
[0143]
[0144][0145]
表7 实施例1-14、实施例16-19提供的试剂盒的检测结果分析
[0146]
[0147][0148]
结合表6和表7可知，实施例1-3的阳性符合率较低，尤其是实施例1和实施例3的阳性符合率，说明单独使用rnp a、u1-snrnp c或u1-snrnp 68/70kd作为u1-snrnp抗原时，会明显导致检测结果不准确。尤其是单独使用u1-snrnp c作为u1-snrnp抗原时，还会检测到明显的假阴性。
[0149]
通过实施例4-6的检测结果可知，当rnp a、u1-snrnp c或u1-snrnp 68/70kd的添加比例为30：30：30时，检测结果中阳性符合率为83.33％，而当rnp a、u1-snrnp c或u1-snrnp 68/70kd的添加比例为20：20：20或10：10：10时，检测结果中阳性符合率仅能达到为66.67％或50.00％，阳性符合率较低。因此，当rnp a、u1-snrnp c或u1-snrnp 68/70kd的添加量需要一致时，优选的三者的添加量均为30μg。
[0150]
进一步地，通过实施例7-14的检测结果可知，当rnp a、u1-snrnp c或u1-snrnp68/70kd的添加比例为(5-20)：(10-30)：(10-30)，检测结果中阳性符合率为83.33％以上。尤其是，当rnp a、u1-snrnp c或u1-snrnp 68/70kd的添加比例为5：20：20时，检测结果中阳性符合率能够达到100％。因此，在进行rnp a、u1-snrnp c或u1-snrnp 68/70kd配合作为u1-snrnp抗原时，通过降低rnp a的添加量，可以有效提高检测结果中的阳性符合率，从而提高检测结果的准确性。
[0151]
通过实施例11与实施例16-19的检测结果可知，二抗溶液的浓度对测试结果有较大影响，且通过对比检测结果中的阳性符合率，可知将二抗溶液的浓度控制在10-30ug/ml
时，阳性符合率达到100％，而当二抗溶液的浓度小于10ug/ml或大于30ug/ml时，阳性符合率均小于100％。因此，选择将二抗溶液的浓度控制在10-30ug/ml的范围内。
[0152]
检测试验二
[0153]
分别利用上述实施例11、实施例15以及对比例1-4提供的试剂盒进行待测样本的检测。检测方法如“检测试验一”所示。待测样本的类型、数量以及检测结果如表8、表9所示。
[0154]
表8 利用实施例11、实施例15以及对比例1-4提供的试剂盒的检测结果
[0155][0156]
表9 实施例11、实施例15以及对比例1-4提供的试剂盒的检测结果分析
[0157][0158][0159]
结合表8和表9，通过对比实施例11和实施例15的检测结果可知，当dsdna抗原为环状噬菌体pm2dna时的阳性符合率高于当dsdna抗原为线状噬菌体pm2dna时的阳性符合率。因此，进一步优选dsdna抗原为环状噬菌体pm2。
[0160]
通过对比实施例11、实施例15与对比例1-4的检测结果可知，当dsdna抗原为噬菌体pm2dna时的阳性符合率、阴性符合率均大于当dsdna抗原为diarect、human-lia、human-elisa以及sigma的阳性符合率、阴性符合率。因此，选择噬菌体pm2dna作为dsdna抗原。
[0161]
本具体实施例仅仅是对本技术的解释，其并不是对本技术的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本技术的权利要求范围内都受到专利法的保护。