基于微球的血小板聚集功能检测质控品及质控方法

1.本发明涉及血液检测领域，特别涉及一种基于微球的血小板聚集功能检测质控品及质控方法。


背景技术：

2.血小板在止凝血过程中起到非常重要的作用，聚集功能是血小板的一个重要生理特性，是指血小板与血小板之间的黏附，显示活化的血小板相互作用成团的特征，是血小板参与止血和血栓形成过程的重要因素之一。血小板的聚集功能的测定对于临床上诊断血栓前状态和血栓性疾病具有重要意义，是评价血液凝血功能的一项重要指标。
3.血小板聚集功能的检测原理是在prp或全血种加入诱导剂，使血小板聚集，进而使血液浊度发生相应改变，根据记录曲线计算出血小板聚集的程度和速度。目前，血小板聚集功能检测的方法有很多，主要有过滤压力法、比浊法、剪切诱导血小板聚集测定法、散射性粒子检测法、全血电阻抗法、血小板计数和微量反应板法等。
4.通常测定的是采血后3h内新鲜血浆中的血小板的聚集功能，由于标本的特殊性，不能长期保存，国内暂时没有商品化的质控品，有些实验室自制正常人新鲜的富血小板血浆作为室内质控物，但是，自制质控品存在难以标准化，重复性差，批内cv较大等缺点，不适合推广使用。国外试剂由于进口因素供货周期较长、价格昂贵、保质期短等缺点，因此，临床工作中迫切需要一种更为理想、稳定的、开放型、价格合理血小板聚集功能的质控品。


技术实现要素：

5.本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于微球的血小板聚集功能检测质控品及质控方法。
6.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于微球的血小板聚集功能检测质控品，该质控品通过以下方法制备得到：
7.1)制备表面修饰有羧基的微球；
8.2)微球表面标记：将微球表面羧基进行活化，然后偶联与激活剂对应的特异性受体，得到所述质控品；
9.使用时，将所述质控品分散形成稳定的悬浮液，当加入激活剂后，质控品与激活剂会发生凝集反应，进而使体系的浊度发生变化，由此实现血小板聚集功能检测的质量控制。
10.优选的是，所述微球为直径在2～6μm的聚苯乙烯微球。
11.优选的是，所述步骤1)具体包括：
12.1-1)将triton-x305、pvp、ambn、乙醇、苯乙烯混匀，在氮气气氛中，加热搅拌反应；
13.1-2)将丙烯酸、苯乙烯、乙醇加入到步骤1-1)得到的产物中，混匀，搅拌反应；
14.1-3)将步骤1-2)得到的产物洗净，烘干，得到表面修饰有羧基的微球。
15.优选的是，所述步骤1)具体包括：
16.1-1)将5g triton-x305、10g pvp、5g ambn、200g乙醇、10g苯乙烯加入圆底烧瓶
中，超声混匀，在氮气气氛中，加热搅拌反应；
17.1-2)将5g丙烯酸、10g苯乙烯、200g乙醇加入到步骤1-1)得到的产物中，混匀，搅拌反应；
18.1-3)将步骤1-2)得到的产物使用旋转蒸发仪蒸干，用乙醇洗净，放入真空干燥箱烘干，得到表面修饰有羧基的微球。
19.优选的是，所述步骤2)具体包括：
20.2-1)将步骤1)制得的微球分散在水中，制得a溶液；
21.2-2)将n-羟基琥珀酰亚胺、edc和mes缓冲液混合，得到b溶液；
22.2-3)将b溶液加入到a溶液中，超声混匀，震荡，加入pbs-t清洗，离心分离，加入与激活剂对应的特异性受体，震荡，得到所述质控品。
23.优选的是，所述步骤2)具体包括：
24.2-1)将步骤1)制得的微球分散在水中，制得a溶液，a溶液中微球的浓度为10mg/ml；
25.2-2)将2g n-羟基琥珀酰亚胺、1g edc和10ml mes缓冲液混合，得到b溶液；其中，mes缓冲液的ph为6.0；
26.2-3)将b溶液加入到1ml a溶液中，超声混匀30秒，置于震荡器上30分钟后取下，加入pbs-t清洗，离心分离，然后加入1ml浓度为10μg/ml的与激活剂对应的特异性受体(如胶原抗体、花生四烯酸抗体、adp抗体等)，置于震荡器上震荡3h，得到所述质控品；其中，pbs-t的ph为7.4。
27.本发明还提供一种基于微球的血小板聚集功能检测质控方法，包括以下步骤：
28.s1、采用如上所述的质控品制备模拟富血小板血浆溶液；
29.s2、向模拟富血小板血浆溶液中加入与质控品上标记的特异性受体对应的激活剂(胶原、花生四烯酸、adp)，通过质控品与激活剂发生凝集反应，使体系的浊度发生变化，由此实现血小板聚集功能检测的质量控制。
30.优选的是，所述步骤s1具体为：取权利要求1-6中任意一项所述的质控品，加入procelin 300、pbs和tween20，充分混匀。
31.优选的是，所述步骤s1具体包括：取权利要求1-6中任意一项所述的质控品，加入质量分数为0.05％的procelin 300、浓度为0.02m的pbs和质量分数为0.05％的tween20，充分混匀。
32.优选的是，所述步骤s2具体包括：向模拟富血小板血浆溶液中加入与质控品上标记的特异性受体对应的激活剂，磁力搅拌，通过质控品与激活剂发生凝集反应，使体系的浊度发生变化，使用紫外分光光度计测试体系的透光率曲线，得到模拟血小板聚集的聚集曲线，并进一步获得至少包括聚集率、最大聚集率在内的参数，由此实现血小板聚集功能检测的质量控制。
33.本发明的有益效果是：
34.本发明提供的基于微球的血小板聚集功能检测质控品制备简单、成本低、方便使用，且性能稳定，可获得更可靠的检测结果，能够克服常规血液质控品不便保存、成本昂贵、重复性差、质控范围大等问题；
35.本发明提供的基于微球的血小板聚集功能检测质控方法，利用粒径均一的微球偶
联受体/抗体，加入激活剂，模拟血小板聚集时产生的浊度变化，通过仪器采集到稳定的信号，从而实现质控；方法简便，检测结果可靠性高。
附图说明
36.图1为本发明的实施例1制得的微球的sem图；
37.图2为本发明的实施例2中得到的模拟血小板聚集的聚集曲线；
38.图3为诱导剂诱导血小板聚集曲线图。
具体实施方式
39.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
40.应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
41.实施例1
42.本实施例的一种基于微球的血小板聚集功能检测质控品，其通过以下方法制备得到：
43.1)制备表面修饰有羧基的微球；
44.1-1)将5g triton-x305、10g pvp、5g ambn、200g乙醇、10g苯乙烯加入圆底烧瓶中，超声混匀，在氮气气氛中，加热搅拌反应；
45.1-2)将5g丙烯酸、10g苯乙烯、200g乙醇加入到步骤1-1)得到的产物中，混匀，搅拌反应；
46.1-3)将步骤1-2)得到的产物使用旋转蒸发仪蒸干，用乙醇洗净，放入真空干燥箱烘干，得到表面修饰有羧基的微球。该微球为直径在2～6μm的聚苯乙烯微球。
47.参照图1为本实施例制得的微球的sem图，可以看出制得的微球直径均匀，为2.24μm左右。
48.2)微球表面标记：将微球表面羧基进行活化，然后偶联与激活剂对应的特异性受体，得到所述质控品；具体步骤为：
49.2-1)将步骤1)制得的微球分散在水中，制得a溶液，a溶液中微球的浓度为10mg/ml；
50.2-2)将2g n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、1g edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和10ml mes缓冲液混合，得到b溶液；其中，mes缓冲液的ph为6.0；
51.2-3)将b溶液加入到1ml a溶液中，超声混匀30秒，置于震荡器上30分钟后取下，加入pbs-t清洗，离心分离，然后加入1ml浓度为10μg/ml的与激活剂对应的特异性受体(胶原抗体)，置于震荡器上震荡3h，得到所述质控品；其中，pbs-t的ph为7.4。
52.使用时，将所述质控品分散形成稳定的悬浮液，当加入激活剂(胶原)后，质控品与激活剂会发生凝集反应，进而使体系的浊度发生变化，由此实现血小板聚集功能检测的质量控制。
53.实施例2
54.一种基于微球的血小板聚集功能检测质控方法，包括以下步骤：
55.s1、取权利要求1-6中任意一项所述的质控品，加入质量分数为0.05％的procelin 300、浓度为0.02m的pbs和质量分数为0.05％的tween20(ph＝7.4)，充分混匀。该质控品中的特异性受体为胶原抗体。
56.s2、向模拟富血小板血浆溶液中加入激活剂(胶原诱导剂)，磁力搅拌，通过质控品与激活剂发生凝集反应，使体系的浊度发生变化，使用紫外分光光度计测试体系的透光率曲线，得到模拟血小板聚集的聚集曲线，如图2，并进一步获得聚集率、最大聚集率等参数，由此实现血小板聚集功能检测的质量控制。
57.图3为诱导剂诱导血小板聚集曲线图[许文荣.临床血液学[m].北京:人民卫生出版社,2011.333-333.]，左侧一列(normal)为健康受试者血小板聚集曲线，gt、bss和amd分别为血小板无力症、巨血小板综合征和花生四烯酸代谢缺陷症；可以看出，本实施例所示图2可模拟健康受试者血小板聚集曲线，从而达到血小板聚集测试质控的作用。
[0058]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。