尿液或尿液外泌体中肌肉来源6磷酸果糖激酶及其多肽片段在糖尿病中的应用的制作方法

本发明涉及尿液或尿液外泌体中肌肉来源6磷酸果糖激酶及其多肽片段的新用途，具体涉及尿液或尿液外泌体中肌肉来源6磷酸果糖激酶及其多肽片段在糖尿病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。

背景技术：

1、糖尿病是一种以葡萄糖和脂肪代谢紊乱、血浆葡萄糖水平增高为特征的，由遗传与环境因素共同作用而产生的代谢性内分泌疾病。近年来，全球人口糖尿病发病率增长迅速，已成为21世纪最具挑战的世界性健康问题。随着生活水平的提高和生活方式的转变，我国糖尿病的发病率呈快速上升趋势，统计结果表明目前我国糖尿病患者数量位居世界第二，预计至2040年国内糖尿病人口将高达6.42亿。

2、糖尿病高血糖可以导致碳水化合物、蛋白质以及脂肪的代谢紊乱，从而引起神经、肾脏及心血管等多系统并发症，这些都为公众健康问题带来了巨大的隐患。糖尿病发病较为隐匿，多数患者发现不及时，往往因出现并发症的临床表现才得以确诊。除此之外，糖尿病患者病程较长，需长期甚至终身监测血糖，反复抽血有创检查给患者造成诸多不便。但是，糖尿病患者若未给予及时诊治，随着病情进展常出现全身多个脏器损害，严重者甚至因并发症而致残和死亡。综上所述，糖尿病不仅给患者造成不便和痛苦，也会给患者家庭与社会带来沉重的负担。为提高糖尿病患者的生活质量，解决患者的切实问题，研究一种无创、方便、快捷、易重复的糖尿病检查方法极为必要。

3、肌肉来源6磷酸果糖激酶 (atp-pfk )是糖代谢中的关键酶，在机体糖代谢中起着至关重要的作用，是人体糖酵解中的重要一步。在本研究中糖尿病患者尿液或尿液外泌体中肌肉来源6磷酸果糖激酶含量较健康人组出现表达下调，含量降低。

4、与常用的临床血液样本相比，尿液可以完全无创、连续、大量收集；没有稳态调节，可累积更多种类、更大幅度的变化，机体的很多病理生理变化可能体现在尿液中。一些激素和细胞因子等分子量相对较小的蛋白多肽入血后，会很快被排泄进入尿液，这些蛋白和多肽在尿液中被检测到的概率比在血中大很多；尿液收集之前，尿中可能的蛋白降解过程已经完成，所以尿蛋白可在较长时间内保持稳定。为减轻糖尿病患者多次采血的痛苦，本实验在前期方法学摸索的基础上，期望通过尿液蛋白或多肽研究，实现用无痛、方便、快捷、易重复的尿液检测辅助糖尿病患者的诊断及病情监测，也为进一步尿液多肽检测试剂盒的研究奠定基础。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种尿液或尿液外泌体中肌肉来源6磷酸果糖激酶及其多肽片段在制备用于糖尿病诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。

2、优选地，所述尿液或尿液外泌体中肌肉来源6磷酸果糖激酶的氨基酸序列包括seqid no.1所示（mtheehhaak tlgigkaiav ltsggdaqgm naavravvrv giftgarvff vhegyqglvdggdhikeatw esvsmmlqlg gtvigsarck dfreregrlr aaynlvkrgi tnlcviggdg sltgadtfrsewsdllsdlq kagkitdeea tkssylnivg lvgsidndfc gtdmtigtds alhrimeivd aitttaqshqrtfvlevmgr hcgylalvts lscgadwvfi pecppdddwe ehlcrrlset rtrgsrlnii ivaegaidkngkpitsedik nlvvkrlgyd trvtvlghvq rggtpsafdr ilgsrmgvea vmallegtpd tpacvvslsgnqavrlplme cvqvtkdvtk amdekkfdea lklrgrsfmn nwevykllah vrppvsksgs htvavmnvgapaagmnaavr stvrigliqg nrvlvvhdgf eglakgqiee agwsyvggwt gqggsklgtk rtlpkksfeqisanitkfni qglviiggfe aytgglelme grkqfdelci pfvvipatvs nnvpgsdfsv gadtalnticttcdrikqsa agtkrrvfii etmggycgyl atmaglaaga daayifeepf tirdlqanve hlvqkmkttvkrglvlrnek cnenyttdfi fnlyseegkg ifdsrknvlg hmqqggsptp fdrnfatkmg akamnwmsgkikesyrngri fantpdsgcv lgmrkralvf qpvaelkdqt dfehripkeq wwlklrpilk ilakyeidldtsdhahlehi trkrsgeaav）、seq id no.2所示 (mtheehhaak tlgigkaiav ltsggdaqgmnaavravvrv giftgarvff vhegyqglvd ggdhikeatw esvsmmlqlg gtvigsarck dfreregrlraaynlvkrgi tnlcviggdg sltgadtfrs ewsdllsdlq kagkitdeea tkssylnivg lvgsidndfcgtdmtigtds alhrimeivd aitttaqshq rtfvlevmgr hcgylalvts lscgadwvfi pecppdddweehlcrrlset rtrgsrlnii ivaegaidkn gkpitsedik ngsrmgveav mallegtpdt pacvvslsgnqavrlplmec vqvtkdvtka mdekkfdeal klrgrsfmnn wevykllahv rppvsksgsh tvavmnvgapaagmnaavrs tvrigliqgn rvlvvhdgfe glakgqieea gwsyvggwtg qggsklgtkr tlpkksfeqisanitkfniq glviiggfea ytgglelmeg rkqfdelcip fvvipatvsn nvpgsdfsvg adtalnticttcdrikqsaa gtkrrvfiie tmggycgyla tmaglaagad aayifeepft irdlqanveh lvqkmkttvkrglvlrnekc nenyttdfif nlyseegkgi fdsrknvlgh mqqggsptpf drnfatkmga kamnwmsgkikesyrngrif antpdsgcvl gmrkralvfq pvaelkdqtd fehripkeqw wlklrpilki lakyeidldtsdhahlehit rkrsgeaav)、seq id no.3所示 (mhkdefhlkf fmcviqsrql vrtpqrtageastssmlipk pppktdilks ldtmddpdtv gsipvfktew imtheehhaa ktlgigkaia vltsggdaqgmnaavravvr vgiftgarvf fvhegyqglv dggdhikeat wesvsmmlql ggtvigsarc kdfreregrlraaynlvkrg itnlcviggd gsltgadtfr sewsdllsdl qkagkitdee atkssylniv glvgsidndfcgtdmtigtd salhrimeiv daitttaqsh qrtfvlevmg rhcgylalvt slscgadwvf ipecppdddweehlcrrlse trtrgsrlni iivaegaidk ngkpitsedi knlvvkrlgy dtrvtvlghv qrggtpsafdrilgsrmgve avmallegtp dtpacvvsls gnqavrlplm ecvqvtkdvt kamdekkfde alklrgrsfmnnwevyklla hvrppvsksg shtvavmnvg apaagmnaav rstvrigliq gnrvlvvhdg feglakgqieeagwsyvggw tgqggsklgt krtlpkksfe qisanitkfn iqglviiggf eaytgglelm egrkqfdelcipfvvipatv snnvpgsdfs vgadtalnti cttcdrikqs aagtkrrvfi ietmggycgy latmaglaagadaayifeep ftirdlqanv ehlvqkmktt vkrglvlrne kcnenyttdf ifnlyseegk gifdsrknvlghmqqggspt pfdrnfatkm gakamnwmsg kikesyrngr ifantpdsgc vlgmrkralv fqpvaelkdqtdfehripke qwwlklrpil kilakyeidl dtsdhahleh itrkrsgeaa )；或由seq id no:1~3所示的氨基酸序列衍生的，且与seq id no:1~3所示的氨基酸序列具有相同功能的氨基酸序列。

3、优选地，所述制剂为糖尿病患者尿液或尿液外泌体中肌肉来源6磷酸果糖激酶及其多肽片段检测试剂盒。

4、优选地，所述试剂盒包括抗原抗体反应的免疫方法及其试剂盒如能够特异性结合肌肉来源6磷酸果糖激酶及其多肽片段的适配体抗体或抗体片段中的一种或多种。

5、优选地，所述检测方法包括直接检测肌肉来源6磷酸果糖激酶及其多肽片段的质谱等方法及其相关试剂盒。

6、优选地，所述检测方法包括直接检测肌肉来源6磷酸果糖激酶及其多肽片段的相关核酸检测等方法及其相关试剂盒。

7、优选地，所述试剂盒还包括选自下组的成分：固相载体，稀释液，对照品，标准品，质控品，检测抗体，第二抗体、第二抗体稀释液，发光试剂，洗涤液、显色液、终止液中的任意一种或几种的组合。

8、优选地，所述标准品包括肌肉来源6磷酸果糖激酶标准品、人源化标签抗体标准品；较佳地，所述质控品包括：肌肉来源6磷酸果糖激酶质控品、人源化标签抗体质控品；较佳地，所述固相载体包括：微粒、微球、玻片、试纸条、塑料珠、液相芯片、微孔板或亲和膜等以及同等功能的其他载体。

9、优选地，所述固相载体的材质为聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺、纤维素中的任意一种及具有类似功能的载体。

10、发明人首先收集了健康人、糖尿病患者的尿液标本，参照人类尿液蛋白质组计划(human urine proteome project，hkupp)和欧洲肾脏和尿液蛋白质组（european kidneyand urine proteomics, eurokup）标准操作程序对尿液外泌体的提取，通过透射电子显微镜、外泌体纳米微粒追踪检测及蛋白免疫印迹对尿液外泌体进行鉴定，通过液相二级质谱技术（liquid chromatography tandem mass spectrometry，lc-ms/ms)，采用数据非依赖性扫描模式（data-independent acquisition，dia），通过定量值校正/计算绝对定量值、差异分析及目标蛋白全局聚类分析对数据进行处理。将糖尿病组和正常对照组在质谱中得到的数据进行定量计算，最终获得差异蛋白肌肉来源6磷酸果糖激酶。

11、本发明通过研究证实与健康人相比，尿液或尿液外泌体中肌肉来源6磷酸果糖激酶及其多肽片段在糖尿病患者中呈低表达，与临床诊断有较好的一致性。从而提出检测尿液或尿液外泌体中肌肉来源6磷酸果糖激酶及其多肽片段可用于糖尿病的诊断、鉴别诊断、病情程度判断、治疗效果评价、监测、预后评估及机理研究等制剂的应用。

12、本发明发挥尿液标本获取无创、可大规模重复取样、保存方便的优势，利用尿液标本检测尿液或尿液外泌体中肌肉来源6磷酸果糖激酶及其多肽片段。

13、为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。