一种获取泪液代谢指纹谱图的方法及筛选方法

1.本发明涉及生物科学技术领域，尤其涉及一种获取泪液代谢指纹谱图的方法及筛选方法。


背景技术：

2.青光眼是一种常见的视神经性病变，是导致不可逆失明的主要原因。根据世界卫生组织(who)的数据，全球有超过7600万人受到青光眼的影响，其中15％的人发生不可逆的失明。及时诊断对于预防视力障碍和延缓严重失明的进展至关重要。传统的青光眼检测方法需要结合多种检查进行诊断，如视力、视野、眼压和视神经成像，这些检查操作过程繁琐，并且需要经验丰富的医生，不适合大规模筛查使用。因此，世界青光眼协会报告称，发达国家和发展中国家分别有50％和90％的青光眼人群不知道已经患上青光眼。
3.在检测方法设计中，生物标志物和检测方法的选择是决定诊断性能的两个主要方面。对于生物标志物选择，生物体液中的基因组/蛋白质组/代谢水平的分子生物标志物是识别与病理过程相关的生物系统改变的有效指标，并且生物体液的获取具有最小的侵入性。基因组和蛋白质组生物标志物位于代谢通路的上游，通常能够反映的是生物系统的间接信息。相比之下，代谢生物标志物作为通路的终产物，可以直接表征疾病表型和进展。质谱是选择代谢生物标志物的基本工具。与传统的光谱法(例如，核磁共振、nmr)和生化方法不同，质谱可检测分子的精确质荷比，具有高分辨率(ppm)的优势。迄今为止，大多数使用气相色谱/液相色谱(gc/lc)对生物样品进行检测的方法，都需要对代谢物进行富集和纯化的处理程序，以解决分子丰度和样品复杂性问题。


技术实现要素：

4.有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是构建一种简单有效的检测方法，实现青光眼的及时诊断。
5.为实现上述目的，本发明第一方面提供了一种获取泪液代谢指纹谱图的方法，通过无机纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱对待测泪液进行检测，获取所述泪液代谢指纹谱图。
6.进一步地，包括如下步骤：
7.将所述待测泪液和无机纳米颗粒分别用去离子水稀释配制得到待测泪液样本和基质溶液；
8.在所述激光解吸电离飞行时间质谱的靶板上进行待测泪液样本点样，干燥后进行基质溶液点样，干燥；
9.点样结束后，采用激光解吸电离飞行时间质谱对待测泪液进行检测，获取所述泪液代谢指纹谱图。
10.本发明第二方面提供一种青光眼泪液代谢指纹谱图的筛选方法，包括如下步骤：
11.使用上述方法分别获取健康人群和青光眼人群的泪液代谢指纹谱图并进行模型
训练，获取预测模型；
12.使用上述方法获取待测人员的泪液代谢指纹谱图，将所述待测人员的泪液代谢指纹谱图输入至所述预测模型中获取结果。
13.进一步地，所述获取预测模型具体包括以下步骤：
14.通过无机纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱，对青光眼人群的泪液样本和健康人群的泪液样本分别进行检测，分别获取健康人群和青光眼人群的泪液代谢指纹谱图；
15.运用matlab数据仿真软件对所述健康人群和青光眼人群的泪液代谢指纹谱图进行预处理，分别获取m/z信号；
16.运用orange使用岭回归算法，对健康人群和青光眼人群预处理后的泪液代谢指纹谱图进行模型训练，获取预测模型。
17.进一步地，运用orange使用岭回归算法，对健康人群和青光眼人群预处理后的泪液代谢指纹谱图进行模型训练，获取预测模型，具体包括：
18.将健康人群和青光眼人群预处理后的泪液代谢指纹谱图分为训练集和测试集，运用orange数据处理软件，使用岭回归算法对训练集进行模型训练，获取初预测模型；
19.将所述测试集输入所述初预测模型中，运用orange数据处理软件进行预测，获取岭回归算法对测试集的预测结果；
20.将健康人群的泪液代谢指纹谱图和原发性早期开角型青光眼人群的泪液代谢指纹谱图输入所述初预测模型中，运用orange数据处理软件进行交叉验证，将原发性闭角型青光眼人群的泪液代谢指纹谱图和原发性早期开角型青光眼人群的泪液代谢指纹谱图输入所述初预测模型中，运用orange数据处理软件进行交叉验证，根据交叉验证的结果对初预测模型的参数进行调整，获取所述预测模型。
21.进一步地，所述预处理包括谱线平滑、基线校正、谱峰联配。
22.进一步地，青光眼人群的泪液样本数为146个，健康人群的泪液样本数为120。
23.进一步地，步骤1中，所述训练集中，预处理后的健康人群的泪液代谢指纹谱图数为106个，预处理后的青光眼人群的泪液代谢指纹谱图数为116个；
24.步骤2中，所述测试集中，预处理后的健康人群的泪液代谢指纹谱图数为24个，预处理后的青光眼人群的泪液代谢指纹谱图数为30个；
25.步骤3中，健康人群的泪液代谢指纹谱图数为120个，原发性早期开角型青光眼人群的泪液代谢指纹谱图数为33个；
26.步骤4中，原发性闭角型青光眼人群的泪液代谢指纹谱图数为63个，原发性早期开角型青光眼人群的泪液代谢指纹谱图数为30个。
27.本发明第三方面提供一种青光眼泪液代谢指纹谱图的筛选方法，所述方法包括：根据上述任一所述预测模型的结果，检测青光眼泪液代谢指纹谱图中的代谢生物标志物，所述代谢生物标志物为c3h6o3、c4h9no3、c3h6o3s、c3h4o5s、c4h4n2o3、c6h
13
n3o3。
28.进一步地，使用基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱检测所述代谢生物标志物。
29.本发明通过采用纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱，仅仅使用痕量泪液样本(100nl)，实现了泪液代谢指纹谱图高通量(384样本/芯片)，高检测速度(约30s/样本)，
高灵敏度(低至0.3pmol)以及高可重复性(cv《10％)检测，有效解决了传统技术样本量较大以及预处理复杂等缺陷。
30.本发明通过对青光眼病人和健康对照的泪液样本的代谢指纹谱图进行机器学习，构建了含有代谢生物标志物的预测模型，解决了传统青光眼检测技术存在的操作复杂，检测繁琐和分析速度慢等问题。
31.本发明通过对待测泪液样本进行6种代谢生物标志物进行检测，相比于单个代谢生物标志物，6个代谢生物标志物组合在预测青光眼病人时表现出更好的性能。
32.以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
33.图1是本发明的一实施例提供的青光眼泪液和健康对照泪液的代谢指纹谱图；
34.图2是本发明的一实施例提供的青光眼泪液样本和健康对照泪液样本的m/z信号对应热图；
35.图3是本发明的一实施例提供的采用岭回归算法对于早期原发性开角型青光眼的预测效率图；
36.图4是本发明的一实施例提供的采用岭回归算法对于青光眼分期的检测效果图；
37.图5是本发明的一实施例提供的代谢生物标志物在预测青光眼病人时性能效果图。
具体实施方式
38.以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
39.实施例1
40.使用无机纳米颗粒增强激光解吸电离飞行时间质谱技术，获取泪液代谢指纹谱图，激光解吸电离飞行时间质谱具有检测速度快，通量高的优点，具体包括以下步骤：
41.步骤1：将泪液样本用去离子水稀释10倍；
42.步骤2：将无机纳米颗粒用去离子水配成1mg/ml的基质溶液，所使用的无机纳米颗粒可参考现有文献报道；
43.步骤3：在质谱靶板上进行样品制备，每个稀释后的泪液样本点样1μl，室温下干燥；
44.步骤4：在质谱靶板上进行基质制备，每个基质溶液点样1μl，室温下干燥；
45.步骤5：使用激光解吸电离飞行时间质谱进行泪液代谢指纹采集，得到泪液代谢指纹谱图。
46.实施例2
47.对青光眼病人和健康对照组泪液样本代谢指纹谱图进行模型训练，构建预测模型，拿出大部分样本进行建模型，留小部分样本用刚建立的模型进行验证，并根据交叉验证的结果进行参数调整，实现对青光眼人群的泪液代谢指纹谱图的筛查和预测，具体包括以
下步骤：
48.步骤1；将146个青光眼泪液样本和120个健康对照泪液样本采用实施例1的方法进行代谢指纹谱图成像，成像谱图如图1所示；
49.步骤2：将266个样本的泪液代谢指纹谱图在matlab(r2020a)上进行谱线平滑、基线校正和谱峰联配预处理，得到311个m/z信号，如图2所示；
50.步骤3：将预处理后的266个泪液样本划分成训练集和测试集，其中训练集包括116个青光眼泪液样本和106个健康对照泪液样本，测试集包括30个青光眼泪液样本和24个健康对照泪液样本；
51.步骤4：将训练集在orange(3.25.0)上使用岭回归算法进行模型训练，得到初预测模型；将测试集在初预测模型中进行测试，获取预测模型，其中训练集和测试集在训练模型上的诊断性能如表1所示；
52.表1. 311个m/z信号在预测模型中使用岭回归算法的诊断性能
[0053][0054]
步骤5：将120个健康对照泪液样本和33个原发性早期开角型青光眼(poag)泪液样本在orange(3.25.0)上采用经过测试的预测模型进行交叉验证，获得岭回归算法对于早期原发性开角型青光眼的预测效率，如图3所示；
[0055]
步骤6：将63个原发性闭角型青光眼泪液样本和30个原发性早期开角型青光眼(poag)泪液样本在orange(3.25.0)上采用经过测试的预测模型进行交叉验证，获得岭回归算法对于青光眼分期的检测效果，如图4所示。
[0056]
实施例3
[0057]
根据预测模型的预测结果，对泪液中的代谢生物标志物进行检测，实现对青光眼筛查、分期和早诊，具体包括以下步骤：
[0058]
步骤1：将泪液样本用去离子水稀释10倍；
[0059]
步骤2：将无机纳米颗粒用去离子水配成1mg/ml的基质溶液；
[0060]
步骤3：在质谱靶板上进行样品制备，每个稀释后的房水样本点样1μl，室温下干燥；
[0061]
步骤4：在质谱靶板上进行基质制备，每个基质溶液点样1μl，室温下干燥；
[0062]
步骤5：在基质辅助激光解吸电离傅里叶变换离子回旋共振质谱仪中得到生物标志物的精准分子量，傅里叶变换离子回旋共振质谱分辨率更高，对质谱检测结果进行代谢生物标志物分析，鉴定出6个代谢生物标志物，如表2所示，通过观察可知，相比于单个代谢生物标志物，6个代谢生物标志物组合在预测青光眼病人时表现出更好的性能，如图5所示。
[0063]
表2.代谢生物标志物相关信息
[0064][0065][0066]
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。