一种CDKN2B化学发光法检测试剂盒及其制备方法与应用

一种cdkn2b化学发光法检测试剂盒及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明属于免疫学和生物技术领域，具体公开了一种细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子2b(cdkn2b)的化学发光法检测试剂盒及其制备方法。


背景技术：

2.原发性肝细胞肝癌(hcc)是我国常见的实体性肿瘤，病死率高居恶性肿瘤第二位，严重危害我国人民身体健康。化学药物和靶向药物治疗是延长中晚期hcc患者生存时间的主要手段，但其效果受到肿瘤耐药性的限制。目前，化疗耐药是导致肝细胞肝癌临床化疗失败的主要原因。
3.cdkn2b(细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制因子2b，又称p15、ink4b)，属ink4蛋白家族，又称多肿瘤抑制基因(mts1)，可以抑制细胞周期依赖激酶4(cyclin dependent kinase 4，cdk4)或6的活性而抑制细胞周期，引起细胞的g1期阻滞，从而抑制肿瘤的增殖，促进肿瘤细胞凋亡。已有研究证实cdkn2b是肝癌患者耐药的重要标志物，肝癌患者肿瘤组织中cdkn2b高表达对生物烷化剂类化疗药物呈现显著的敏感性，而低表达则呈现一定的耐药性。因此，检测手术后hcc患者肿瘤细胞中cdkn2b的表达水平对肝癌患者的术后化疗具有巨大的临床意义。现有的cdkn2b检测方法检出率低，易出现假阴性假阳性的问题，亟需找到一种高效、高精度的新的检测方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种cdkn2b化学发光法检测试剂盒，解决现有检测方法检测时间长、灵敏度不高，重复性较差，不能保证检测结果准确性的问题；本发明的另一目的是提供利用上述试剂盒的检测方法；本发明的第三目的是提供上述试剂盒在评估hcc患者术后化疗药物使用中的应用。
5.本发明旨在为临床和实验室hcc的患者肿瘤细胞样品中cdkn2b含量提供准确、便捷、灵敏度高并被广泛使用的检测手段。
6.为解决上述问题，本发明第一方面提供了一种cdkn2b化学发光法检测试剂盒，所述的化学发光法检测试剂盒包括：
7.(a)包被有cdkn2b抗体(即包被载体)的微孔板，所述cdkn2b抗体为免抗人cdkn2b的多克隆抗体；所述的cdkn2b抗体为免抗人cdkn2b的多克隆抗体；较优的，兔抗人cdkn2b的多克隆抗体购自affinity公司；最优的，抗体工作浓度下稀释倍数为1：10000。
8.(b)检测cdkn2b抗原的抗体，为小鼠抗人cdkn2b的单克隆抗体；较优的，小鼠抗人cdkn2b的单克隆抗体购自affinity公司；最优的，检测抗体工作浓度下稀释浓度为0.5ug/ml。
9.(c)酶标二抗，为hrp(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗小鼠igg；较优的，hrp标记的山羊抗小鼠igg购自solarbio公司；最佳的，稀释倍数为1：5000。
10.(d)标准蛋白，为重组人cdkn2b融合蛋白；较优的，重组人cdkn2b融合蛋白购自
solarbio公司。
11.(e)公共液体。
12.优选的，所述公共液体包括样品稀释液、微孔板浓缩洗涤液、化学发光底物和终止液，所述化学发光底物为双组分dab显色液，含有显色液a和显色液b，所述样品稀释液和微孔板浓缩洗涤液均为1xpbs缓冲液，ph7.2-7.4，所述终止液为2mol/l硫酸溶液。
13.优选的，所述微孔板为市售的96孔可拆酶标板，优选为biosharp公司的96孔可拆酶标板(8孔，12条)。
14.一种cdkn2b化学发光法检测试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
15.(1)制备包被载体：包被缓冲液将抗体(免抗人cdkn2b的多克隆抗体)1：10000稀释，在酶标板的每孔中加入100ul，封板后置于4℃孵育过夜。包被结束后，吸去包被缓冲液，再加入封闭液，置于37℃封闭3小时或在室温下封闭过夜；弃去封闭液，干燥包被载体后加入干燥剂密封包装，得到抗cdkn2b抗体包被载体，备用；
16.(2)制备公共液体：
17.a、制备终止液：终止液为2mol/l硫酸溶液；
18.b、制备dab显色液：显色剂a、b溶液各一滴或各50ul，和90ulpbs溶液混合均匀配成工作液，现配现用；
19.c、制备浓缩洗涤液：浓缩洗液为1xpbs缓冲液，ph7.2-7.4；
20.(3)制备工作液体：
21.工作液体包括标准蛋白样品即标准品和检测cdkn2b抗原的抗体及酶标二抗，其中标准蛋白样品为稀释至浓度为100ng/ml的重组人cdkn2b融合蛋白，具体为：用样品稀释液与人体细胞组织液按体积比3:1比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将重组人cdkn2b融合蛋白稀释至浓度为100ng/ml；其余检测cdkn2b抗原的抗体及酶标二抗即配即用。
22.(4)组装试剂盒：将包被载体、公共液体、工作液体经过半成品分装和半成品质检后组装成cdkn2b化学发光法检测试剂盒。
23.优选的，所述s1中包被缓冲液为1xpbs，ph7.2-7.4；所述封闭液为ph7.4的pbst溶液，内含1wt％bsa、0.1wt％proclin300以及3wt％蔗糖。
24.优选的，所述s4中采用滴配实验的方式进行半成品检测，检测合格的产品进行组装。
25.本发明还提供了利用上述的cdkn2b蛋白的化学发光法检测试剂盒的检测方法。所述的检测方法包括以下步骤：
26.s1.待检测样本用常规样品稀释液以体积比1:1稀释，将稀释后液体加入酶标板孔中，37℃孵育60min；
27.s2.重组人cdkn2b融合蛋白用常规样品稀释液稀释成所需的不同浓度梯度，加样至酶标板孔中，37℃孵育60min；甩去各孔中的液体，加入微孔板洗涤液，洗涤3-5次，甩干；
28.s3.将小鼠抗人cdkn2b的单克隆抗体用常规样品稀释液稀释至0.5ug/ml，加入各酶标板孔中，37℃孵育60min；甩去各孔中的液体，加入微孔板浓缩洗涤液，洗涤3-5次，甩干；
29.s4.各酶标板孔中加入用常规样品稀释液稀释5000倍的hrp标记的山羊抗小鼠
igg，37℃孵育60min；甩去各孔中的液体，加入酶标板洗涤液，洗涤6-8次，甩干；
30.s5.双组分dba显色液中显色剂a、b溶液各一滴或各50ul，和90ulpbs溶液混合均匀配成工作液，每酶标板孔加入50ul，室温避光孵育10-20min后，加入终止液终止反应。
31.s6.用半自动发光仪测定od值。
32.s7.以标准蛋白浓度作横坐标，od值作纵坐标，通过测得的样品od值在标准曲线上查出检测浓度结果。
33.在本发明的一个优选实施例中，所述的检测方法具体为：
34.肝癌细胞样本裂解离心后用样品稀释液1xpbs，ph7.2-7.4以1:1稀释，以100ul/孔的体积加样，37℃孵育60min；cdkn2b重组蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，以100ul/孔的体积加样，37℃孵育60min；甩去各孔中的液体，加入微孔板洗涤液，每孔200ul，洗涤3-5次，甩干；将cdkn2b检测抗体稀释成0.5ug/ml，每孔100ul，37℃孵育60min；甩去各孔中的液体，加入微孔板洗涤液，每孔200ul，洗涤3-5次，甩干；加入hrp标记的山羊抗小鼠igg，每孔100ul，37℃孵育60min；甩去各孔中的液体，加入微孔板洗涤液，每孔200ul，洗涤6-8次，甩干；显色剂a、b溶液各一滴或各50ul，和90ulpbs溶液混合均匀配成工作液，每孔50ul，室温避光孵育10-20min，加入2mol/l硫酸溶液终止反应，每孔50ul，在半自动发光仪上测定od值。以标准蛋白浓度作横坐标，od值作纵坐标。通过样品的od值可在标准曲线上查出其浓度。
35.cdkn2b重组蛋白用样品稀释液根据检测需要稀释成不同浓度梯度，在本发明的一个优选实施例中，浓度梯度为：10ng/ml，3ng/ml，1ng/ml，0.3ng/ml，0.1ng/ml，0.03ng/ml，0.01ng/ml。
36.上述检测结果仅用于判断患者肿瘤细胞中cdkn2b的表达水平，由此判断对生物烷化剂类化疗药物的敏感性。需强调，该结果属于中间结果，并不能直接得到患者的健康状况，也不能直接用于疾病的诊断和治疗。
37.本发明的第三目的是提供上述试剂盒在评估术后hcc患者化疗使用药物效果中的应用，所述的应用具体是指用于制备评估术后hcc患者化疗药物选择的检测试剂盒。
38.本发明的有益效果：
39.1)准确：目前市场上无商业化的人源性cdkn2b的化学发光法检测试剂盒，经文献检索没有定量检测人源性cdkn2b含量的方法，前期工作发现cdkn2b可以抑制cdk4或6的活性而抑制细胞周期，从而抑制肿瘤的增殖，促进肿瘤细胞凋亡，但目前无法对hcc病人肿瘤细胞中的cdkn2b进行测定。此化学发光法检测试剂盒可准确检测hcc病人肿瘤细胞中的cdkn2b蛋白的含量，结果由半自动发光仪定量分析，排除了免疫组化、免疫荧光等半定量方法的主观性。
40.2)灵敏度高：用该方法检测到的cdkn2b蛋白最低可至10pg/ml，敏感性明显高于普通的western blot和免疫组化等半定量方法。
41.3)简单方便：本方法中所用试剂和实验耗材均为市售商业化产品，容易获得；检测中仅需移液器和半自动发光仪进行加样和读数，普通的实验室和医院均可开展此项检测。
42.本发明提供的化学发光法检测试剂盒操作简单方便，可准确、高灵敏度地检测到hcc病人肿瘤细胞中的cdkn2b含量；为临床检验和基础研究提供了一种新的手段和方法。
43.本发明的试剂盒主要用于hcc病人的肿瘤细胞样品中cdkn2b的定量检测，基础研
究中可运用于各种生物学样品(如细胞裂解液)中的cdkn2b的检测。
44.本发明检测时不需要复杂仪器，易于在科研院校和医疗机构中推广应用，可大规模检测临床标本，快速获得人cdkn2b相关的海量数据和信息，为肝癌患者的诊断提供重要的临床参考价值，具有广阔的市场前景、较大的经济和社会效益。
附图说明
45.图1为本发明中试剂盒的加工生产流程图；
46.图2为本发明中试剂盒测试标准曲线。
具体实施方式
47.下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明不仅限于这些实例，在为脱离本发明宗旨的前提下，所为任何改进均落在本发明的保护范围之内。
48.实施例1
49.一种cdkn2b化学发光法检测试剂盒，试剂盒采用双抗体夹心法测量人肿瘤细胞中cdkn2b的含量，试剂盒包括：包被有cdkn2b抗体的96孔酶标板，所述cdkn2b抗体为免抗人cdkn2b的多克隆抗体，购自affinity公司，抗体工作浓度下稀释倍数为1：10000；检测cdkn2b抗原的抗体，为小鼠抗人cdkn2b的单克隆抗体，购自affinity公司，检测抗体工作浓度下稀释浓度为0.5ug/ml；酶标二抗，为hrp(辣根过氧化物酶)标记的山羊抗小鼠igg，购自solarbio公司，稀释倍数为1：5000；标准蛋白，为重组人cdkn2b融合蛋自，购自solarbio公司。
50.试剂盒还包括样品稀释液即1xpbs缓冲液、微孔板洗涤液即ph7.2-7.4的1xpbs缓冲液、显色液为双组分dba显色液和终止液即2mol/l硫酸溶液。
51.实施例2
52.实施例1中cdkn2b化学发光法检测试剂盒的具体制备方法，包括如下步骤：
53.(1)制备包被载体：包被缓冲液将抗体(免抗人cdkn2b的多克隆抗体)1：10000稀释，在酶标板的每孔中加入100ul，封板后置于4℃孵育过夜。包被结束后，吸去包被缓冲液，再加入封闭液，置于37℃封闭3小时或在室温下封闭过夜；弃去封闭液，干燥包被载体后加入干燥剂密封包装，得到抗cdkn2b抗体包被载体，备用；
54.(2)制备公共液体：
55.a、制备终止液：终止液为2mol/l硫酸溶液；
56.b、制备dab显色液：显色剂a、b溶液各一滴或各50ul，和90ulpbs溶液混合均匀配成工作液，现配现用；
57.c、制备浓缩洗涤液：浓缩洗液为1xpbs缓冲液，ph7.2-7.4；
58.(3)制备工作液体：
59.工作液体包括标准蛋白样品即标准品和检测cdkn2b抗原的抗体及酶标二抗。
60.标准蛋白样品用稀释液与人体肿瘤细胞按体积比3：1比例混合配制成基础缓冲液，用基础缓冲液将重组人cdkn2b融合蛋白稀释成浓度为100ng/ml的标准蛋白样品；
61.检测cdkn2b抗原的抗体及酶标二抗不需配置，在使用时即用即配。
62.(4)组装试剂盒：将标准品、包被载体、公共液体经过半成品分装和半成品质检后
组装成cdkn2b化学发光法检测试剂盒。
63.优选的，所述s1中包被缓冲液为1xpbs，ph7.2-7.4；所述封闭液为ph7.4的pbst溶液，内含1％bsa、0.1％proclin300以及3％蔗糖。所述上s3中稀释液为1xpbs，ph7.2-7.4。所述s4中采用滴配实验的方式进行半成品检测，检测合格的产品进行组装。
64.具体的本实施例中cdkn2b化学发光法检测试剂盒批量生产的流程图如图1所示。
65.实施例3
66.采用实施例1、2中cdkn2b化学发光法检测试剂盒的具体检测方法：
67.包括如下步骤：
68.肝癌细胞样本裂解液用样品稀释液1xpbs，ph7.2-7.4以1:1稀释，以100ul/孔的体积加样，37℃孵育60min；人重组cdkn2b融合蛋白用样品稀释液稀释成不同浓度梯度，以100ul/孔的体积加样，37℃孵育60min；甩去各孔中的液体，加入微孔板洗涤液，每孔200ul，洗涤3-5次，甩干；将cdkn2b检测抗体稀释成0.5ug/ml，每孔100ul，37℃孵育60min；甩去各孔中的液体，加入微孔板洗涤液，每孔200ul，洗涤3-5次，甩干；加入hrp标记的山羊抗小鼠igg，每孔100ul，37℃孵育60min；甩去各孔中的液体，加入微孔板洗涤液，每孔200ul，洗涤6-8次，甩干；显色剂a、b溶液各一滴或各50ul，和90ulpbs溶液混合均匀配成工作液，每孔50ul，室温避光孵育10-20min，加入2mol/l硫酸溶液终止反应，每孔50ul，在半自动发光仪上测定od值。以标准蛋白浓度作横坐标，od值作纵坐标。通过样品的od值可在标准曲线上查出其浓度。
69.实施例4
70.对实施例2得到的cdkn2b化学发光法检测试剂盒进行性能检测：
71.1.精密度实验
72.选取化疗耐药的hcc患者肿瘤细胞(cdkn2b水平低)和化疗敏感的hcc患者肿瘤细胞(cdkn2b水平高)各一例进行检测，同一板内各检测20次，计算批内精密度；同时每个浓度水平每天检测一批，每批重读检测4次，连续检测5天，共20次，计算批间精密度：
73.表1低浓度批内精密度
[0074][0075]
表2高浓度批内精密度
[0076][0077]
表3批间精密度
[0078][0079][0080]
从表上看出，经重复性检测，批间cv为7.33％和10.26％，批内cv为5.77％和6.01％，cv均小于15％，精密度符合要求。
[0081]
2.特异性试验
[0082]
用实施例1建立的化学发光法分别检测10例化疗耐药的hcc患者和化疗敏感的hcc患者肿瘤细胞样本中cdkn2b含量，将cdkn2b重组蛋白作为阳性对照，根据所得标准品od值与所对应浓度绘制标准曲线，计算各人群中cdkn2b的肿瘤细胞学水平。
[0083]
结果显示在如下表4所示。
[0084]
表4特异性实验结果
[0085][0086]
经spss软件分析，化疗耐药的hcc患者组cdkn2b肿瘤细胞学水平(avg：1.517ng/ml，sd：0.159)明显低于化疗敏感的hcc患者组(avg：3.945，sd：1.305)，差异有统计学意义(p《0.001)。提示cdkn2b在hcc患者化疗疗效中有一定的特异性。(avg-平均数，sd-标准差)
[0087]
3.敏感性试验
[0088]
将cdkn2b重组蛋白(1ug/ul)用1
×
pbs作连续倍比稀释，设置2个复孔，得出标准蛋白各个稀释点的平均od值与空白组od值有统计学差异的最高稀释倍数。
[0089]
cdkn2b融合蛋白稀释108倍后的od值与空白组od值仍有统计学差异，表明可检测的cdkn2b蛋白最低浓度为10pg/ml。
[0090]
灵敏度(最低检测限)：通过对标准品进行连续倍比稀释得出试剂盒的最低检测限为10pg/ml，小于0.25ng/ml，灵敏度符合要求。
[0091]
4.线性范围
[0092]
选择低浓度(l)和高浓度(h)标本各1份，低浓度(l)标本接近0ng/ml，高浓度(h)标本接近10ng/ml，h和l按等比关系配置系列浓度肿瘤细胞，配比比例见下表，每个实验样品在检测系统上重复测定两次，记录结果，对预期值、实测值采用直线回归方程对数据统计，相关系数大于0.975即可。
[0093]
表5线性浓度测定结果
[0094]
系列样品号低浓度(ml)高浓度(ml)11.000.0020.750.2530.500.5040.250.7550.001.00
[0095]
表6预期值和实测值
[0096]
系列样品号预期值(ng/ml)实测值(ng/ml)100.09522.52.77335.04.86047.57.559510.011.420
[0097]
回归结果如图2所示，可以看出试剂在线性范围内的测定值和预期值相关良好，相关系数r＝0.9938，大于0.975，线性评价处于可接受范围。
[0098]
上述实验表明利用本发明提供的cdkn2b化学发光法检测试剂盒，灵敏度高，重复性好，能够保证检测结果的准确性。
[0099]
以上内容仅仅是对本发明构思所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明的构思或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。