一种信息量丰富的一贯煎指纹图谱、其构建方法及其应用与流程

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种信息量丰富的一贯煎指纹图谱、其构建方法及其应用。

背景技术：

1、一贯煎出自清·钱敏捷《医方絜度》，为国家中医药管理局2018年4月发布的《古代经典名方目录(第一批)》中的第84首处方，一贯煎因疗效确切，目前仍在广泛应用。为支持一贯煎等经典名方的开发，国家药品监督管理局2019年3月发布《古代经典名方中药复方制剂基准样品的申报资料要求(征求意见稿)》，其核心思想是必须确保临床所用的药用物质与传统汤剂的药用物质基本一致，如何实现“基本一致”成为了经典名方生产工艺研究的关键和核心。

2、对中药制剂而言，控制药用物质一致的常用方法为指纹图谱法。中国专利公开号109406672a，发明名称为一种使用hplc测定中药一贯煎的指纹图谱方法，公开了一种一贯煎的指纹图谱，其清楚地呈现出当归、生地黄、枸杞子的专属特征峰，能反应一贯煎的质量。一贯煎由麦冬、北沙参、当归、枸杞子、地黄、川楝子共6味药组成，发明人认为现有的一贯煎的指纹图谱在含量控制上只有不多于三个指标性成分，质量控制单一，难以全面、准确地反映产品的质量状况。

技术实现思路

1、为了增加一贯煎指纹图谱中的指标性成分数量，提高对一贯煎质量控制的全面性和准确性，本发明提出了一种信息量丰富的一贯煎指纹图谱、其构建方法及其应用，其具有指标性成分数量多、峰型好、分离度高等优点，适合对一贯煎的质量进行全面、准确的评价。

2、本发明提供了一种信息量丰富的一贯煎指纹图谱的构建方法，包括供试品溶液的制备方法和测定法；

3、其中所述供试品溶液的制备方法为：取适量一贯煎基准样品，加入供试品溶媒处理后，过滤，得供试品溶液，所述供试品溶媒为甲醇、正丁醇和水中的一种或多种；

4、所述测定法为采用高效液相色谱法测定供试品溶液并记录色谱图，其色谱条件包括：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相a，以磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～20min内，流动相a占总流动相的体积比从4％a匀速渐变至15％a；20～60min内，流动相a占总流动相的体积比从15％a匀速渐变至28％a。

5、十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱可以从市场上购得，有多种品牌，如：月旭ultimatelp-c18(5μm，4.6×250mm)、月旭ultimate xb-c18(5μm，4.6×250mm)、上海安谱athena c18(5μm，4.6×250mm)、依利特supersil ods2、岛津shim-pack vp-ods、agilent 5tc-c18(250×4.6mm，5μm)、waters symmetry c18(250×4.6mm，5μm)、ace 5aq(250×4.6mm，5μm)等。

6、通过采用上述技术方案所得的一贯煎指纹图谱中含有7个归属于地黄、枸杞子、当归、麦冬、和川楝子五味药的特征峰，并指认出了阿魏酸、芦丁、毛蕊花糖苷、洋川芎内酯i、scotanamine d和对香豆酸。该指纹图谱具有5味药的指标性成分，能较全面地对一贯煎的质量进行评价；此外，该指纹图谱具有7个可用于评价一贯煎质量的特征峰，特征峰数量多、峰型好、分离度高，能准确地对一贯煎的质量进行评价。

7、优选的，所述供试品溶液的制备方法为：取适量一贯煎基准样品，加入水使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取，取正丁醇液，蒸干，残渣加入甲醇使溶解，过滤，得供试品溶液。

8、更优选的，所述供试品溶液的制备方法为：取适量一贯煎基准样品，加水使溶解后，用水饱和正丁醇振摇提取2次，均取正丁醇液，合并两次正丁醇液，蒸干，残渣加入甲醇使溶解，过滤，得供试品溶液。

9、根据本发明，磷酸水溶液中磷酸的体积分数为0.05％-0.15％。

10、优选地，磷酸水溶液中，磷酸体积分数可以为0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、0.11％、0.12％、0.13％、0.14％或0.15％。

11、更优选地，磷酸水溶液中，磷酸体积分数为0.1％。

12、根据本发明，检测波长为280-300nm。

13、优选地，检测波长可以为280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299或300nm。

14、更优选地，检测波长为290nm。

15、本发明还提供了上述构建方法构建的一贯煎指纹图谱。

16、本发明还提供了上述一贯煎指纹图谱的应用，其可用于鉴别一贯煎中的各味药及监控各味药在制剂工艺过程的变化，或用于评价一贯煎及其相关制剂的质量。

17、根据本发明，评价一贯煎的质量的方法包括：对照品溶液的制备方法、供试品溶液的制备方法、hplc测定方法以及质量评价方法。

18、根据本发明，所述对照品溶液的制备方法为取适量对照品，加对照品溶媒使溶解，滤过，得对照品溶液，所述对照品为阿魏酸、毛蕊花糖苷、芦丁、洋川芎内酯i中的一种，所述对照品溶媒为水或甲醇或甲醇的水溶液。

19、根据本发明，所述供试品溶液的制备方法为取适量待测样品，加入供试品溶媒处理后，过滤，得供试品溶液，所述供试品溶媒为甲醇、正丁醇和水中的一种或多种。

20、根据本发明，所述hplc测定方法为使用高效液相色谱仪分别测定所述供试品溶液、所述对照品溶液，并记录对应的色谱图，其色谱条件为色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相a，以磷酸水溶液为流动相b，进行梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0～20min内，流动相a占总流动相的体积比从4％a匀速渐变至15％a；20～60min内，流动相a占总流动相的体积比从15％a匀速渐变至28％a。

21、所述评价方法为将所述供试品溶液的色谱图、所述对照品溶液的色谱图积分处理后，导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，计算所述供试品溶液的指纹图谱的相似度。

22、优选的，所述供试品溶液的制备方法为取适量待测样品，加入水使溶解，用水饱和正丁醇振摇提取，取正丁醇液，蒸干，残渣加入甲醇使溶解，过滤，得供试品溶液。

23、更优选的，所述供试品溶液的制备方法为取适量待测样品，加水使溶解后，用水饱和正丁醇振摇提取2次，均取正丁醇液，合并两次正丁醇液，蒸干，残渣加入甲醇使溶解，过滤，得供试品溶液。

24、进一步的，所述对照品为阿魏酸，所述对照品溶媒为70％甲醇。

25、阿魏酸色谱峰保留时间适中，响应值较高，有利于对特征峰进行定位。

26、有益的效果

27、1.本发明使用水饱和正丁醇作为溶媒提取一贯煎基准样品中的指标性成分，然后选择乙腈和磷酸水溶液作为流动相，并以特定的梯度洗脱程序进行梯度洗脱，得到了一贯煎的指纹图谱。该指纹图谱具有归属于5味原料药的7个特征峰，其中6个特征峰所对应的物质可被成功指认，成功实现了增加一贯煎指纹图谱中的指标性成分数量，提高对一贯煎质量控制的全面性和准确性的效果。

28、2.本发明在290nm波长下对供试溶液进行扫描检测所得的色谱图中的色谱峰响应值适中，峰信息量丰富，基线平稳，有利于准确评价一贯煎的质量。

29、3.本发明选择阿魏酸作为对照品参照峰，具有色谱峰保留时间适中，响应值高，有利于对特征峰进行定位，从而便于后续对色谱图的积分转换。

30、说明书附图

31、图1实施例1的hplc图谱。

32、图2对比例1的hplc图谱。

33、图3紫外吸收波长扫描结果图。

34、图4一贯煎基准样品hplc图谱(280nm)。

35、图5一贯煎基准样品hplc图谱(290nm)。

36、图6一贯煎基准样品hplc图谱(300nm)。

37、图7实施例2-6的hplc叠加图。

38、图8实施例7的hplc图谱(峰2scotanamine；峰3对香豆酸；峰4阿魏酸；峰5芦丁；峰6毛蕊花糖苷；峰7洋川芎内酯i)。

39、图9峰归属hplc叠加图(s1一贯煎基准样品；s2川楝子饮片/药材；s3地黄饮片；s4地黄药材；s5枸杞子饮片/药材；s6当归饮片；s7当归药材；s8麦冬饮片；s9麦冬药材；s10北沙参饮片；s11北沙参药材)。

40、图10相关成分确认hplc叠加图。

41、图11uplc-ms总离子流图(峰1 5-羟基异喹啉；峰3益母草苷；峰5酪氨酸；峰6lycibarbarspermidine b；峰7lycibarbarspermidine a；峰9scotanamine；峰10洋地黄叶苷c；峰11对香豆酸；峰12对甲氧基桂皮酸乙酯；峰13焦地；峰14阿魏酸；峰15芦丁；峰16地黄紫罗兰苷a/b；峰17毛蕊花糖苷；峰18毛蕊花糖苷；峰19毛蕊花糖苷；峰20洋川芎内酯h)。

42、图12空白溶剂、对照品、供试品hplc叠加图。

43、图13指纹图谱仪器精密度hplc叠加图。

44、图14指纹图谱精密度相似度结果图。

45、图15指纹图谱稳定性结果hplc叠加图。

46、图16指纹图谱稳定性相似度结果图。

47、图17指纹图谱重复性hplc叠加图。

48、图18指纹图谱重复性相似度结果图。

49、图19色谱条件流动相流速考察hplc叠加图。

50、图20色谱条件流速考察相似度结果图。

51、图21色谱条件色谱柱温度考察hplc叠加图。

52、图22色谱条件色谱柱温度考察相似度结果图。

53、图23色谱条件色谱柱考察hplc叠加图。

54、图24色谱条件色谱柱考察相似度结果图。

55、图25色谱条件高效液相色谱仪考察hplc叠加图。

56、图26色谱条件高效液相色谱仪考察相似度结果图。