一种同时检测粮油中多种真菌毒素的免疫层析方法与流程

1.本发明属于真菌检测技术领域，具体的说涉及一种同时检测粮油中多种真菌毒素的免疫层析方法


背景技术：

2.霉菌毒素是由真菌产生的有毒的次级代谢产物，其可以通过饲料或食品进入到人和动物体内，从而引起急性或慢性中毒，危害人类和动物健康。霉菌的生长与地域、气候、季节等密切相关，因此不同地区、时间、季节的饲料和饲料原料受霉菌毒素污染的情况也有所不同。黄曲霉毒素、呕吐毒素(脱氧雪腐镰刀菌烯醇)、f-2毒素(玉米赤霉烯酮)、t-2毒素、伏马菌素、赭曲霉毒素，这六种毒素经常会同时污染农作物及其加工产品。
3.目前关于霉菌毒素的检测方法主要有：薄层色谱法(tlc)、酶联免疫法(elisa)、气相色谱法(gc)和高效液相色谱法(hplc)等。由于tlc和elisa方法不能准确定量，gc方法虽然检测灵敏度高，但样品前处理复杂，杂质干扰大。目前对霉菌毒素的检测用hplc法比较认可，用免疫亲和柱对经过萃取的样品进行净化后，杂质少，检测限低。经试验摸索研究，建立了免疫亲和柱-高效液相色谱检测的方法，该方法灵敏度高、回收率高、重复性好。但是hplc法的操作难度大，目前市场上都是对单一毒素检测检测，无法实现大通检测，而因为操作难度大，需要专岗专人进行操作，操作过程中需要使用有机溶剂对被测物质经行提取，容易造成有机溶剂的浪费与污染。


技术实现要素：

4.本发明提出一种同时检测粮油中多种真菌毒素的免疫层析方法，通过不同的配方，与真菌毒素的官能团结合，形成复合物，对真菌毒素进行提取并吸附杂质实现对样品的分离，纯化，通过液体样品通过震荡，离心，配方中的物质吸附杂质的同时与水结合，达到提取其中被测物质的作用，从而达到快速分离净化，降低样品基质干扰，提高检测灵敏度，解决了传统层析检测方法干扰大的问题，也免去传统层析检测方法复杂的前处理过程。
5.为达到上述目的，本发明采用以下技术方案为：
6.一种同时检测粮油中多种真菌毒素的免疫层析方法，所述方法包括以下步骤：
7.s1粉碎、称量：将粮谷类样品进行粉碎，称取粉碎好的样品于离心管中；
8.s2混匀、离心：加入纯净水与配方包，盖好盖子高速剧烈震荡混合、离心，得到上清液；
9.s3取样、加样：取上清液；分别加入到反应器中；
10.s4将检测不同真菌毒素的检测试纸插入反应器等待显色反应；
11.完成同时检测粮油中多种真菌毒素的检测。
12.优选地，所述方法采用的检测装置包括检测试纸、反应器和托盘，反应器置于托盘上，反应器由若干个反应管组成，反应器中心设有通孔，反应管依次围绕通孔周边，通孔高度低于反应管的高度。
13.进一步优选地，反应管底部为锥形供检测试纸可以立在反应管中；反应管依次围绕通孔周边形成一个多边形。
14.进一步优选地，反应管底部为锥形供检测试纸可以立在反应管中；反应管依次围绕通孔周边形成一个多边形。
15.进一步优选地，所述检测试纸包括背板，复合在所述背板一端设有吸水纸，贴在背板上的硝酸纤维薄膜，搭接在所述硝酸纤维薄膜上且靠近吸水纸的吸水玻璃纤维，所述硝酸纤维薄膜上至少设置一条检测线t线和控制线c线；靠近控制线c线的一侧设有吸水滤纸。
16.更进一步优选地，将多种真菌毒素的抗体固定在硝酸纤维素膜上作为检测线t线，将羊抗鼠的igg抗体固定在质控线作为对照线(c)；
17.吸水玻璃纤维上设有固相的胶体金-单克隆抗原结合物。
18.再更进一步优选地，所述吸水玻璃纤维设置固相的胶体金-单克隆抗原结合物包括以下步骤：
19.(1)胶体金溶剂：纯水放入防暴沸玻璃珠，加热至沸腾，加入柠檬酸三钠溶液，煮沸后加入氯金酸溶液，冷却，得到胶体金溶剂；
20.(2)将(1)中所得的胶体金溶剂调节ph至7.4，再加入若干个真菌毒素抗原，搅拌后加入牛血清白蛋白，搅拌至反应完全，得到胶体金抗原标记初液；
21.(3)将胶体金抗原标记初液离心，去除未结合的抗原，得到胶体金抗原标记沉淀物，将沉淀以原体积0.02mol/l tbs(ph 8.2,内含1％bsa,0.05％叠氮钠)溶解,重复离心2～3次,沉淀溶于1ml tbs中,加50％甘油,-20℃保存，金标抗原溶喷洒于玻璃纤维上,室温干燥，然后再粘贴组合。
22.继再更进一步优选地，所述步骤(2)中，若干个真菌毒素包括黄曲霉毒素单克隆抗原、玉米赤霉烯单克隆抗原、呕吐毒素单克隆抗原、t-2毒素单克隆抗原、伏马毒素单克隆抗原或赭曲霉毒素a单克隆抗原或其他；所述步骤(2)中，牛血清白蛋白加入量为是抗原质量1.2-1.5倍。
23.优选地，所述方法采用的配方包以样品质量为100份计，包括以下组分：
24.牛血清白蛋白7-9份、填料3-5份。
25.进一步优选地，所述配方包还包括以下组分：
26.石墨化碳3-5份；所述填料为hlb填料或pas填料或nh2填料。
27.更进一步优选地，所述配方包括按照重量份计的以下组分：
28.牛血清白蛋白8份、填料4份、石墨化碳4份。
29.本发明的有益效果：
30.1、本发明以传统层析检测方法原理为基础，利用水提法通过不同的配方包与被测物质结合进行提取，优化了实验步骤，降低了实验操作难度，原始实验操作需要使用到有机溶剂，容易对环境造成污染，现使用配方包提取，减少了有机溶剂的使用，也减少了有机溶剂的污染。微孔金中加入多种毒素抗原，可以实现多毒素大通量检测。
31.2、配方包中加入牛血清白蛋白，是牛血清中的一种球蛋白，白蛋白由581个氨基酸残基组成，其中35个半胱氨酸组成17个二硫键，在肽链的第34位有一自由巯基。白蛋白可与多种阳离子、阴离子和其他小分子物质结合。可携带金属离子、脂肪酸，使用牛血清白蛋白与真菌毒素结合，提取真菌毒素，实现水提法，减少有机试剂的使用，更加绿色环保。
32.3、试剂条：六种抗体分别固定在硝酸纤维素膜上作为检测线(t)，将羊抗鼠的igg抗体固定在质控线作为对照线(c)，试纸条前端分别偶联有六种抗体的胶体金，若样品中含有毒素，混合均匀后与复合物在样品垫上向前涌动到检测线位置，由于毒素与检测线的抗体结合，形成复合物，胶体金占据检测位点，检测线出现不同深浅的红色，将此检测结果视为阳性，可根据颜色深浅判断毒素浓度；而当样品中不含真菌毒素时，偶联有六种抗体的胶体金无法取代检测线上抗体的位点，检测线上不显色，此检测结果视为阴性。
33.4、检测样本量少，效率高，可同时进行多种检测，节省检测时间。
34.5、所述方法采用的检测装置包括检测试纸、反应器和托盘，反应器置于托盘上，反应器由若干个反应管组成，反应器中心设有通孔，反应管依次围绕通孔周边，通孔高度低于反应管的高度。反应管的体积恒定、互不干扰、各反应管达到所需体积后溢出、各反应管底部为圆锥形底部、便于测试条悬空在中间。
附图说明
35.图1是为本发明检测装置示意图，图1a是俯视图，图1b是侧面图，图1c测试状态图。
36.图2是为反应管底部示意图。
37.图3为本发明检测试纸示意图。
38.其中：检测试纸1，反应器2，托盘3，反应管4，通孔5，背板101，吸水纸102，硝酸纤维薄膜103，吸水玻璃纤维104，检测线t线105，控制线c线106吸水滤纸107。
39.图4为本发明反应步骤示意图。
具体实施方式:
40.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。对本发明做进一步详细的说明，但不限于这些实施例。
41.实施例1
42.一种同时检测粮油中多种真菌毒素的免疫层析方法，所述方法包括以下步骤：
43.s1粉碎、称量：将粮谷类样品进行粉碎，称取5g粉碎好的样品于50ml离心管中；s2混匀、离心：加入25ml纯净水与配方包，盖好盖子高速剧烈震荡混合5min；
44.4000rpm离心5min，得到上清液；
45.s3取样、加样：取上清液300μl(相当于0.06g样品)；加入样品中；
46.s4将试剂条插入样品池中，盖上外盖，等待检测结果。
47.优选地，所述方法采用的检测装置包括检测试纸1、反应器2和托盘3，反应器2置于托盘3上，反应器2由若干个反应管4组成，反应器2中心设有通孔5，反应管4依次围绕通孔5周边，通孔5高度低于反应管4的高度。
48.进一步优选地，反应管4底部为锥形供检测试纸1可以立在反应管4中；反应管4依次围绕通孔5周边形成一个多边形。
49.进一步优选地，反应管4底部为锥形供检测试纸1可以立在反应管4中；反应管4依次围绕通孔5周边形成一个多边形。
50.进一步优选地，所述检测试纸1包括背板101，复合在所述背板101一端设有吸水纸102，贴在背板101上的硝酸纤维薄膜103，搭接在所述硝酸纤维薄膜103上且靠近吸水纸102
的吸水玻璃纤维104，所述硝酸纤维薄膜103上至少设置一条检测线t线105和控制线c线106；靠近控制线c线106的一侧设有吸水滤纸107。
51.更进一步优选地，将多种真菌毒素的抗体固定在硝酸纤维素膜上作为检测线t线105，将羊抗鼠的igg抗体固定在质控线作为对照线(c)；
52.吸水玻璃纤维104上设有固相的胶体金-单克隆抗原结合物。
53.再更进一步优选地，所述吸水玻璃纤维104设置固相的胶体金-单克隆抗原结合物包括以下步骤：
54.(1)胶体金溶剂：精确量取1l纯水与圆底烧瓶中，放入防暴沸玻璃珠，加热至沸腾，加入15ml的1％的柠檬酸三钠溶液，煮沸1min后加入10ml的1％氯金酸溶液，待颜色稳定后继续加热8分钟，冷却后加纯水补充至1l；
55.(2)将(1)中所得的胶体金溶剂调节ph至7.4，再加入黄曲霉毒素单克隆抗原、玉米赤霉烯单克隆抗原、呕吐毒素单克隆抗原、t-2毒素单克隆抗原、伏马毒素单克隆抗原、赭曲霉毒素a单克隆抗原，搅拌反应20分钟后加入牛血清白蛋白(牛血清白蛋白加入量为是抗原质量1.3倍)，搅拌至反应完全，得到胶体金抗原标记初液；
56.(3)将将胶体金抗原标记初液离心，去除未结合的抗原，得到胶体金抗原标记沉淀物将沉淀以原体积0.02mol/l tbs(ph 8.2,内含1％bsa,0.05％叠氮钠)溶解,重复离心2～3次,沉淀溶于1ml tbs中,加50％甘油,-20℃保存，金标抗原溶喷洒于玻璃纤维上,室温干燥，然后再粘贴组合。
57.将饲料样品与不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液、玉米赤霉烯标准溶液、呕吐毒素标准溶液、t-2毒素标准溶液、伏马毒素标准溶液、赭曲霉毒素a标准溶液分别混合，置备成6种饲料毒素配置成6种毒素饲料和空白对照并对其编号编号1-2饲料中含黄曲霉毒素b1含量依次为50、200μg/kg，4-5为含玉米赤霉烯酮含量依次为100、500μg/kg，7-8号为含呕吐毒素含量依次为500、1000μg/kg，10-11号为含t-2毒素含量依次为100、500μg/kg，13-14号为含伏马毒素含量依次为100、500μg/kg，16-17号为含赭曲霉毒素a含量为100、500μg/kg，3、6、9、12、15、18号为空白对照。使用不同配方包经行前处理实验，使用本发明检测体系，以上述检测方法对18份样品进行检测，每份3次重复。
58.配方包1组分：所述配方包以样品(5g)质量为100％计，其加入量分别为：牛血清白蛋白8％、nh2填料4％、pas填料4％。
59.配方包2组分：所述配方包以样品(5g)质量为100％计，其加入量分别为：牛血清白蛋白8％、nh2填料4％、hlb填料4％；
60.配方包3组分：所述配方包以样品(5g)质量为100％计，其加入量分别为：牛血清白蛋白8％、石墨化碳4％、pas填料4％；
61.配方包4组分：所述配方包以样品(5g)质量为100％计，其加入量分别为：牛血清白蛋白8％、石墨化碳4％、hlb填料4％；
62.配方包5组分：所述配方包以样品(5g)质量为100％计，其加入量分别为：牛血清白蛋白8％、hlb填料4％、pas填料4％；
63.配方包6组分：所述配方包以样品(5g)质量为100％计，其加入量分别为：牛血清白蛋白8％、nh2填料4％、石墨化碳4％。结果见表1。
64.另外，将饲料样品与不同浓度的黄曲霉毒素标准溶液、玉米赤霉烯标准溶液、呕吐
毒素标准溶液、t-2毒素标准溶液、伏马毒素标准溶液、赭曲霉毒素a标准溶液分别混合，置备成6种饲料毒素配置成6种毒素饲料和空白对照并对其编号编号1-2饲料中含黄曲霉毒素b1含量依次为50、200μg/kg，4-5为含玉米赤霉烯酮含量依次为100、500μg/kg，7-8号为含呕吐毒素含量依次为500、1000μg/kg，10-11号为含t-2毒素含量依次为100、500μg/kg，13-14号为含伏马毒素含量依次为100、500μg/kg，16-17号为含赭曲霉毒素a含量为100、500μg/kg，3、6、9、12、15、18号为空白对照。使用毒素检测卡，以上述检测方法对18份样品进行检测，每份3次重复。其中：水提检测具体操作方法：
65.s1粉碎、称量：将粮谷类样品进行粉碎，称取5g粉碎好的样品于50ml离心管中；
66.s2混匀、离心：加入25ml纯净水，盖好盖子高速剧烈震荡混合5min；4000rpm离心5min，得到上清液；
67.s3取样、加样：取上清液300μl(相当于0.06g样品)；加入样品池中；
68.s4将试剂条插入样品池中，，等待检测结果。结果见表1。
69.乙醇检测具体操作方法：
70.s1粉碎、称量：将粮谷类样品进行粉碎，称取5g粉碎好的样品于50ml离心管中；
71.s2混匀、离心：加入25ml乙醇，盖好盖子高速剧烈震荡混合5min；4000rpm离心5min，得到上清液；
72.s3取样、加样：取上清液300μl(相当于0.06g样品)；加入胶体金干粉微孔中；
73.s4使用移液枪吸打混匀，至少吸打3次；
74.s5将试剂条插入胶体金干粉微孔中，盖上外盖，等待检测结果。结果见表1。
75.表1
[0076][0077]
表2
[0078][0079]
配方包7组分：以配方包6为基础，区别在于配方中不包括石墨化碳，其他同实施例1，检测结果如表3。
[0080]
配方包8组分：以配方包6为基础，区别在于配方中不包括nh2填料，其他同实施例1，检测结果如表3。
[0081]
配方包9组分：以配方包6为基础，区别在于配方中不包括牛血清白蛋白，其他同实施例1，检测结果如表3。
[0082]
表3
[0083]
[0084][0085]
加标回收率的范围标准在gbt 27404-2008-实验室质量控制规范-食品理化检测里面有规定，80-120是属于比较优的范围。
[0086]
由表1-3可知，通过使用牛血清白蛋白与填料搭配使用，可以实现统一前处理，水提真菌毒素，减少使用化学试剂，通过不同的填料搭配，对真菌毒素提取的回收率也有改善，牛血清白蛋白、nh2填料、石墨化碳的搭配提取回收率最佳。
[0087]
上述实施例仅为本发明的优选技术方案，而不应视为对本发明的限制，本技术中的实施例及实施例中的特征在不冲突的情况下，可以相互任意组合。本发明的保护范围应以权利要求记载的技术方案，包括权利要求记载的技术方案中技术特征的等同替换方案为保护范围。即在此范围内的等同替换改进，也在本发明的保护范围之内。