一种测定抗体浓度的荧光偏振免疫分析方法与流程

1.本发明涉及生物分析技术领域，尤其涉及一种基于荧光偏振理论测定抗体浓度的免疫分析方法。


背景技术：

2.抗体表达量高低是衡量稳定细胞株质量关注的重要指标。获得稳定高表达抗体的细胞株是将治疗性抗体从实验室推向市场，真正应用到救治病人的重要一步，其意义不仅在于给临床研究提供足够量的试验药物，也为抗体药物上市后的量产尽可能降低生产成本。除此之外，抗体浓度的测定，几乎贯穿抗体药物的整个研发、生产过程。
3.获得高产的稳定细胞株通常需要从一大批单克隆中筛选，目前常用的抗体浓度定量方法用于高产稳定细胞株的大量筛选仍有缺陷，有待改进。常用的方法主要有：高效液相色谱(hplc)法、酶联免疫吸附实验(elisa)、和生物膜层干涉(bli)法。hplc法被认为是抗体浓度检测的“金标准”，但是hplc测样通量低、对仪器和操作人员专业技术要求较高；elisa是蛋白定量的成熟方法，但实验过程冗长、步骤多、花费时间长；bli法通量较高，但费用昂贵，经济成本高。
4.因此亟需开发一种测样通量高、操作简便且较为经济的方法用以稳定细胞株大规模的抗体表达量筛选。


技术实现要素：

5.鉴于上述分析，本发明旨在提供一种新型的基于荧光偏振理论的抗体浓度检测方法，用以简化稳定细胞株抗体表达量检测步骤，提高筛选通量同时降低经济成本。
6.本发明基于以下原理：荧光追踪分子在受到一定波长的光照射激发下，可发射与激发光不同波长的光；带有荧光偏振功能的酶标仪通过滤光片和起偏器形成具有特定波长的振动面只限于某一固定方向的偏振激发光；如果在激发时荧光物质处于静止状态，发射光将保持原有激发光的偏振性；如果其处于运动状态，将会有部分发射光丢失偏振性，从而形成不同于激发光偏振性的发射光光束，使发射光通过两个方向垂直的偏振器，检测两互相垂直光的光强用以分析。自由的荧光追踪分子较小，在缓冲液中旋转速度较快，激发偏振光丢失偏振性多，偏振较小；但与抗体结合后，复合物分子量变大，荧光标记分子运动速率下降，激发光保持原来偏振性，偏振值较大。溶液中形成的荧光复合物越多，偏振值将越大，即溶液偏振值与抗体浓度呈一定关系，由此分析测定抗体浓度。
7.一方面，本发明提供了一种测定抗体浓度的荧光偏振免疫分析方法，包括如下步骤：
8.1.制备带有荧光基团的抗体结合蛋白作为荧光追踪分子；
9.2.将所述荧光追踪分子与待测样品溶液混合并孵育，同步地，将所述荧光追踪分子与抗体浓度已知的标准品溶液混合并孵育，同步地，将所述荧光追踪分子与不含抗体的空白溶剂混合并孵育以便作为空白对照组；
10.3.孵育完成后，用带有荧光偏振检测功能的酶标仪检测步骤2得到的孵育后溶液的水平及垂直方向上光强，分别记为i
∥
和i
⊥
；
11.4.数据分析：用计算公式：荧光偏振强度(polarization intensity，pi)＝i
∥-i
⊥
计算溶液的荧光偏振强度，通过扣除空白对照组的荧光偏振强度值来校正标准品溶液或待测样品溶液的荧光偏振强度值，以已知标准品浓度为横坐标，校正后的荧光偏振强度值为纵坐标绘制标准曲线，线性拟合得抗体浓度与荧光偏振强度关系式，将待测样品溶液测得的校正后的荧光偏振强度值代入该关系式即可得待测样品溶液中的抗体浓度，
12.其中，在所述方法中，标准品和待测样品每个浓度均设置两复孔，采用两个复孔的pi均值进行数据分析。
13.下文中对上述各步骤进行详细描述。
14.步骤1：
15.具体地，在步骤1中，通过以下工序制备所述荧光追踪分子：
16.1.1)使用二甲基亚砜(dmso)溶解异硫氰酸荧光素(fitc)制备得到fitc预备溶液；
17.1.2)准备抗体结合蛋白原液，并保证所述蛋白原液中不含有咪唑基或者含游离氨基的成分；
18.1.3)将fitc预备溶液与抗体结合蛋白原液混合并进行分子偶联反应；
19.1.4)终止偶联反应并通过纯化去除游离fitc，获得荧光追踪分子溶液。
20.在具体实施方式中，在工序1.1)中，所得到的fitc预备溶液的浓度为10mg/ml以上；
21.在具体实施方式中，在工序1.2)中，准备的抗体结合蛋白原液的浓度为5mg/ml以上。
22.在具体实施方式中，在工序1.2)中，所述抗体结合蛋白为重组葡萄球菌蛋白a(recombinant staphylococcal protein a,spa)。
23.在具体实施方式中，在工序1.3)中，按fitc与spa的摩尔比为18-20:1将fitc预备溶液与抗体结合蛋白原液混合。
24.在具体实施方式中，在工序1.3)中，用ph在9.0-10.0范围内的缓冲液将抗体结合蛋白浓度控制在2-5mg/ml，充分混匀，于4℃避光搅拌过夜，从而进行偶联反应。
25.在具体实施方式中，在工序1.4)中，通过加入nh4cl溶液终止偶联反应，在终止偶联反应后，采用葡聚糖凝胶分子筛sepharose-25除去游离的fitc，并将缓冲液置换成1
×
pbs或者ddh2o。
26.在步骤1中，还包括工序1.5)：将获得的荧光追踪分子溶液稀释，优选地，采用1
×
pbs、ddh2o或cho培养基cd04将荧光追踪分子溶液稀释至0.40-0.70mg/l的浓度，例如稀释至0.42mg/l。
27.本技术在步骤1中优化了荧光追踪分子制备条件，提高了蛋白分子的fitc偶联效率，获得了更适合应用于本发明方法的荧光追踪分子。
28.步骤2：
29.在具体实施方式中，在步骤2中，荧光追踪分子与待测样品溶液的体积比不进行具体限定，这取决于待测样品溶液中的抗体浓度，原则上，待测样品溶液中的抗体浓度越高，荧光追踪分子与待测样品溶液的体积比越大，例如，对于待测样品浓度较高(超过100mg/l)
的样品可选择荧光追踪分子/待测样品溶液体积比为9:1(例如180μl/20μl)的检测体系，低于100mg/l可选择荧光追踪分子/待测样品溶液体积比4:1(例如160μl/40μl)的检测体系，在应用于细胞株筛选的情况下，由于抗体浓度通常低于100mg/l，因此，优选选择荧光追踪分子/待测样品溶液体积比为160μl/40μl的检测体系。本技术中通过采用上述优化的混合体积比，在可接受准确度80％-120％范围内，扩大了可准确检出抗体浓度范围。
30.在具体实施方式中，在步骤2中，孵育温度为20-25℃，孵育时间为20-30分钟。
31.在具体实施方式中，在步骤2中，待测样品溶液可取自细胞培养上清液的一部分，其中包含的抗体类型没有限制，只要能与抗体结合蛋白结合即可，具体地，其中包含的抗体类型可选自人igg1、igg2、igg4、igm、iga，小鼠igg1、igg2、igg3、igm，以及在这些抗体类型上进行改造的抗体fc端融合蛋白、双特异性抗体。
32.在具体实施方式中，在步骤2中，除待测物之外，待测样品溶液不得包含能和spa特异性结合或非特异性结合较强的其它蛋白。对于待测样品溶液中可能含有的已知或未知的其它能与spa非特异性结合较弱的蛋白，在空白溶剂100倍稀释液与原空白溶剂的pi值差异不超过5％的情况下，可忽略溶剂中其它组分的影响。
33.在具体实施方式中，在步骤2中，通过使用移液枪或震板仪震荡进行混合。
34.在具体实施方式中，在步骤2中，浓度已知的标准品通过使用与待测样品溶液相同缓冲液稀释得到，优选地，至少稀释6个浓度梯度，并使这些浓度位于线性区间内以确保标准曲线准确性。
35.步骤3：
36.在具体实施方式中，在步骤3的检测中，将激发波长设置为485nm，发射波长设置为520nm。
37.步骤4：
38.在具体实施方式中，在步骤4中，数据分析满足如下要求：1)两平行复孔的变异系数cv小于2％；2)至少通过6个标准品浓度梯度确定标准曲线；3)标准曲线的线性拟合度r2在0.999以上；以及4)待测样品溶液浓度落在标准曲线最低稀释浓度和最高稀释浓度之间。
39.对于该步骤，本发明首次提出并定义的荧光偏振强度(polarization intensity，pi)，相比于目前研究报道中使用传统荧光偏振能力(polarization potency，p)计算式，其优点在于可通过提高荧光追踪分子荧光素标记率，提高偏振荧光光强，放大偏振测量量值。在pi基础上建立的方法，比此前所报道的荧光偏振免疫分析法检测抗体浓度(ben thompson,jerry clifford,mike jenns,et al.anal.biochem,2017(534):49-55.在p计算式基础上，使用与本发明不同的荧光追踪分子，获得的最大可分析抗体浓度为100mg/l)，可得到更大的检测窗口和线性分析范围。
40.另一方面，本发明提供一种用于测定抗体浓度的试剂盒，其至少包含荧光追踪分子，其中，所述荧光追踪分子为带有荧光基团的抗体结合蛋白。
41.在具体实施方式中，所述荧光追踪分子为异硫氰酸荧光素(fitc)与抗体结合蛋白偶联的分子。
42.在具体实施方式中，所述抗体结合蛋白为重组葡萄球菌蛋白a(spa)。
43.在具体实施方式中，所述抗体结合蛋白通过如上所述的方法制备。
44.在具体实施方式中，所述试剂盒还包括1
×
pbs、cho培养基cd04或去离子水作为荧
光追踪分子的稀释液。
45.再一方面，本发明提供如上所述的方法或如上所述的试剂盒在筛选表达抗体的细胞株中的用途。
46.有益效果
47.本技术公开了一种测样通量高、操作简便且经济的抗体浓度检测方法，可直接检测细胞培养上清中的抗体浓度，尤其适合应用于高产稳定细胞株的批量筛选。
48.本技术公开的分析方法有良好的线性，pi值与抗体浓度线性相关，r2值在0.999以上；抗体测得浓度与理论浓度亦高度线性相关，r2值亦在0.999以上。
49.对人igg4单抗，本发明实施例线性分析范围在5-400mg/l，准确度80％-120％，满足稳定细胞株筛选需求。
50.本技术的方法相较于hplc具有测样通量高、对操作人员技术要求低的突出优势，在基本满足稳定细胞株筛选准确度要求的基础上大大提高了测样的通量，30分钟可检测约100份样本；同时，相较于需要操作十几个步骤的elisa法，本发明的方法具有简便快速的突出特点，检测只需3～4步骤实验操作，能大大节省检测时间和工作量，提高检测效率；另外相较于bli法，本发明的方法无需使用昂贵的耗材，具有节省经济成本的优势，应用于稳定细胞株的筛选将大大降低抗体检测成本。
51.综上，本发明公开的方法具有操作简易快速、测样通量高、节约检测成本的突出特点，比目前常用的抗体检测方法更适合应用于高产稳定细胞株的筛选。
附图说明
52.以下，通过结合附图对本公开示例性实施例进行更详细的描述。
53.图1示出了本发明实施例测定抗体浓度的步骤示意图。
54.图2示出了不同偶联ph对偶联效率和荧光偏振强度(150mg/l抗体浓度下)的影响，其中f-spa为fitc-spa荧光追踪分子简写，f/p值为荧光蛋白中fitc与蛋白摩尔比，反映荧光标记效率。图中，左侧条柱表示pi，右侧条柱表示f/p。
55.图3示出了在不同偶联ph下获得的荧光追踪分子制作的曲线。
56.图4示出了在不同荧光追踪分子使用量下的标准曲线(a)及其线性拟合结果(b)。
57.图5示出了在不同荧光追踪分子稀释液下对测得浓度和理论浓度相关性分析结果。
58.图6示出了检测体系中样品溶液与荧光追踪分子不同混合体积下制作的标准曲线，其中图中右侧图标第一个数字(例如160)代表96孔板中加入的浓度为0.42mg/l荧光追踪分子体积，第二个数字(例如40)代表抗体样本加入体积，单位均为μl。
具体实施方式
59.下面参照附图更详细、完整地阐述本公开实施例的技术方案，显然所描述实施例只是本发明的部分实施例，而不是全部。提供这些实施例是为了使本公开更透彻和完整，并且能够将本公开范围完整地传达给本领域技术人员。
60.术语
61.本发明中，“荧光追踪分子”是指带荧光基团的抗体结合蛋白，具体地，其是指fitc
偶联的重组葡萄球菌蛋白a。建议请给出更加明确的定义。
62.设备和材料
63.fitc购买自sigma；spa购买自义翘神州有限公司；m5e酶标仪为美国molecular devices公司；黑色96孔板使用的是greiner bio one；cho细胞培养基cd04购自奥浦迈生物科技股份有限公司。下文中使用的1
×
pbs为20
×
pbs(购自生工)稀释得到。
64.以下实施例中以人igg4作为代表性分析样本，然而本技术的范围并不限于此，正如权利要求书所述，本发明实施例亦能检测其它能与spa结合的蛋白，都属于本发明保护范围。
65.实施例1.制备不同ph偶联条件下的荧光追踪分子fitc-spa
66.荧光追踪分子fitc-spa(也即fitc偶联的spa)的制备步骤如下：
67.1.偶联前蛋白溶液处理：spa蛋白浓度高于5mg/ml，蛋白缓冲液使用偶联缓冲液(即ph 7.0-10.0的碳酸盐缓冲液)，注意蛋白缓冲液中不得含有咪唑及含游离氨基的成分(高浓度咪唑影响fitc偶联效率)；
68.2.fitc溶液配制：称取fitc粉末，用dmso溶解，制备得到fitc浓度在10mg/ml以上的fitc预备溶液；
69.3.偶联：按fitc与spa摩尔比20:1，分别加入上述步骤2制备的fitc预备溶液和上述步骤1制备的蛋白溶液，用ph 9.0-10.0的碳酸盐缓冲液将蛋白溶液浓度稀释至2mg/ml。涡旋振荡，封口膜封紧管盖，4℃避光搅拌过夜；
70.其中，碳酸盐缓冲液的配置方法为：7.56g nahco3,1.06g na2co3,定容至1l，即nahco3终浓度为0.1m，na2co3终浓度为0.01m。用2m hcl和5m naoh分别将碳酸盐缓冲液母液的ph调至9.0-10.0之间。
71.4.终止偶联：以nh4cl与fitc摩尔比1:1加入浓度为50mm/l的nh4cl溶液终止偶联，涡旋混匀，常温下避光反应0.5小时；
72.5.纯化：使用葡聚糖凝胶分子筛sepharose-25除去游离的fitc，将缓冲液换成1
×
pbs或者ddh2o；
73.6.偶联产物浓度测定：使用micro drop进行全波长扫描，读取波长280nm、495nm处吸光值。使用如下公式计算偶联产物蛋白浓度和f/p值。
[0074][0075][0076]
其中，e
0.1％
代表1.0mg/ml的spa在280nm处的消光系数，0.35
×a495
为fitc在280nm处产生吸收值的校正，389为fitc的分子质量，195为偶联fitc的消光系数。
[0077]
实施例2：不同ph偶联条件对荧光追踪分子偶联效率的影响
[0078]
1.用1
×
pbs将igg4标准品稀释至150mg/l，实验组每孔加10μl稀释好的标准品溶液，空白对照组加10μl 1
×
pbs；
[0079]
2.用1
×
pbs将各候选蛋白样品稀释至0.53mg/l，实验组和空白对照组每孔均加入190μl，即荧光追踪分子加入量为0.1μg/well；
[0080]
3.振荡器混匀，室温下避光孵育20min，使用m5e酶标仪荧光偏振(fp)终点检测方
法，激发波长设置为485nm，发射波长设置为520nm，读取水平及垂直方向上光强；
[0081]
4.数据处理：计算每孔pi值，
△
pi＝pi
实验组-pi
空白组
，该值可初步指示分析窗口大小。以不同ph为横坐标，
△
pi和f/p值为纵坐标(数据获得方法已在实施例1详述)作图，如图2所示。
[0082]
通过该实施例，明晰了偶联时ph与偶联效率的关系，即ph越高fitc的偶联效率越高。同时，在150mg/l抗体浓度下，偶联效率越高其分析窗口越大。
[0083]
实施例3：不同ph偶联条件对pi标准曲线的影响
[0084]
1.用1
×
pbs将igg4标准品稀释至3.6g/l，以5倍稀释7个浓度梯度，每孔加20μl，每组设空白溶剂对照，即加入等量稀释液；
[0085]
2.用1
×
pbs稀释将不同偶联条件下的f-spa稀释至0.56mg/l，实验组和空白对照组每孔均加入180μl，即荧光追踪分子加入量为0.1μg/well。
[0086]
3.振荡器混匀，室温下避光孵育20min，使用m5e酶标仪荧光偏振(fp)终点检测方法，激发波长设置为485nm，发射波长设置为520nm，读取水平及垂直方向上光强；
[0087]
4.数据处理：计算每孔pi值，通过扣除空白溶剂对照组pi值校正pi，即
△
pi＝pi
实验组-pi
空白组
，以抗体浓度为横坐标，
△
pi为纵坐标作图，如图3所述。
[0088]
通过该实施例，确定了分析窗口最大的荧光追踪分子是ph 9.0、ph 10.0(两者几乎相等)下偶联得到的，因此确定了偶联时最佳的ph条件范围为9.0-10.0。
[0089]
实施例4：不同荧光追踪分子浓度对标准曲线的影响
[0090]
1.用1
×
pbs将igg4标准品稀释至400mg/l，以3倍稀释7个浓度梯度，每孔加20μl，每组设空白溶剂对照，即加入等量的1
×
pbs；
[0091]
2.用1
×
pbs将f-spa ph 9.0稀释分别至0.70、0.56、0.42、0.28mg/l，实验组和空白对照组每孔均加入180μl，即荧光追踪分子加入量为0.125、0.1、0.075、0.05μg/well；
[0092]
3.混匀、孵育、读板设置方法及数据处理方法同实施例3，制得的标准曲线如图4a，其拟合结果如图4b。
[0093]
通过该实施例确定了以荧光追踪分子/待测样品溶液体积比180μl/20μl检测时荧光追踪分子的最佳使用量应在0.075-0.125μg/well之间。
[0094]
实施例5：不同稀释液对测样浓度和理论浓度相关性的影响
[0095]
1.用cho培养基cd04将igg4标准品稀释至400mg/l，以3倍稀释7个浓度梯度，每孔加20μl，每组设空白溶剂对照，即加入等量溶剂培养基cd04；
[0096]
2.分别用1
×
pbs、培养基cd04、去离子水稀释将荧光追踪分子稀释至0.42mg/l，实验组和空白对照组每孔均加入180μl，即荧光追踪分子加入量为0.75μg/well。
[0097]
3.混匀、孵育、读板设置方法同实施例3；
[0098]
4.数据处理：通过下式计算每孔荧光偏振强度pi值，pi＝i
∥-i
⊥
；通过扣除空白溶剂对照组的pi以校正pi；以已知标准品浓度为横坐标，校正后的pi值为纵坐标绘制标准曲线，线性拟合得待测抗体的浓度与荧光偏振强度关系式，将测得的待测样品溶液的校正pi值代入此关系式得待测样品溶液的抗体浓度测得值；测样浓度和理论浓度相关性分析以实际加入的理论浓度为横坐标，测得浓度为纵坐标作出曲线，分析其线性相关度，如图5所示。
[0099]
通过实施例5，验证了在使用以上的不同稀释液下测得浓度和理论浓度相关性均较高，因此检测时体系稀释液可优先选择1
×
pbs、培养基cd04或去离子水。
[0100]
实施例6：荧光追踪分子和抗体反应比例对标准曲线的影响
[0101]
1.用培养基上清将igg4标准品稀释至400mg/l，以3倍稀释7个浓度梯度。180μl+20μl、160μl+40μl、140μl+60μl和60μl+60μl实验组(前一体积表示加入的荧光追踪分子溶液的体积，后者为加入的待测样品溶液的体积)每孔分别加入20μl、40μl、60μl和60μl抗体梯度稀释液，每组设空白溶剂对照，即分别加入20μl、40μl、60μl和60μl空白细胞培养上清。
[0102]
2.用培养基上清将荧光追踪分子稀释至0.42mg/l，180μl+20μl、160μl+40μl、140μl+60μl和60μl+60μl实验组每孔分别加入180μl、160μl、140μl和60μl稀释好的荧光追踪分子溶液；
[0103]
3.混匀、孵育、读板设置方法同实施例3；
[0104]
4.数据处理：以抗体浓度为横坐标，校正pi为纵坐标作出标准曲线，如图6。
[0105]
实施例6反映了不同荧光追踪分子和抗体反应比例对标准曲线的影响，对于待测样品浓度较高(超过100mg/l)的样品可选择荧光追踪分子/待测样品溶液体积比180μl/20μl的检测体系，低于100mg/l可选择荧光追踪分子/待测样品溶液体积比160μl/40μl的检测体系。
[0106]
实施例7：模拟测样准确性评估
[0107]
以荧光追踪分子/待测样品溶液体积比160μl/40μl的检测体系为例：
[0108]
1.用培养基上清将igg4标准品稀释至100mg/l，以2倍稀释6个浓度梯度，每孔加40μl，设空白溶剂对照组，即每孔加入等量培养基上清；
[0109]
2.制备模拟样品：用培养基上清分别将igg4标准品稀释至100mg/l、50mg/l、25mg/l、5mg/l，每孔40μl，标曲和模拟样品均设平行复孔。
[0110]
3.用培养基上清将荧光追踪分子稀释至0.42mg/l，每孔分别加入160μl稀释好的荧光追踪分子溶液；
[0111]
4.混匀、孵育、读板设置方法同实施例3；
[0112]
5.数据处理：模拟样品测得浓度计算方法如实施例5所述。测样回收率＝测得浓度/理论浓度*100％。结果如下表1所示。
[0113]
表1
[0114][0115]
实施例8：
[0116]
以下，对本技术抗体浓度检测方法的具体实施方式进行详细描述：
[0117]
1.于黑色96孔板加入待测样品溶液40μl/孔，根据实际情况稀释一定梯度的标准品，与样品溶液同步操作；
[0118]
其中，样品溶液可直接使用细胞培养上清；标准品的稀释液选择与待检样品相同
缓冲液，如使用细胞培养上清直接测样，则可将空白细胞培养上清作为标准品稀释液。
[0119]
2.将以上实施例1中制备的荧光追踪分子(fitc-spa)母液稀释至0.42mg/l，加入160μl/well，与上述样品溶液充分混合；
[0120]
在该步骤中，荧光追踪分子稀释液还可使用1
×
pbs、ddh2o、细胞培养基、bsa溶液等，但应当注意体系粘度越高，分子运动速度减慢，荧光偏振强度下降；
[0121]
其中，混合均匀可使用移液枪混匀或使用震板仪震荡30秒。
[0122]
3.孵育条件为：室温、避光、孵育20分钟。
[0123]
4.检测：使用带有荧光偏振检测功能的酶标仪，选择荧光偏振检测，激发波长设置为485nm，发射波长设置为520nm，仪器将读取水平及垂直方向上光强，分别记为i
∥
和i
⊥
。
[0124]
5.数据处理：通过下式计算每孔荧光偏振强度pi值，pi＝i
∥-i
⊥
；通过扣除空白对照组的荧光偏振强度值校正标准品/样品的荧光偏振强度值，以已知标准品浓度为横坐标，荧光偏振强度校正值为纵坐标绘制标准曲线，线性拟合得待测抗体的浓度与荧光偏振强度关系式，将测得的待测样品溶液的荧光偏振强度校正值代入此关系式可得待测样品溶液中的抗体浓度。其中，复孔pi差异变异系数cv应控制在2％以下。