一种食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法与流程

1.本发明涉及致病菌检测技术领域，具体涉及一种食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法。


背景技术：

2.食源性疾病是指通过食物进入人体内的各种致病因子引起的感染或中毒。它是当今世界上分布最广泛、最常见的疾病之一。最近根据世界卫生组织(who) 统计报告表明，食源性疾病的实际发病数要比报告的病例数多300～500倍，全世界因食物污染而致病者已达数亿。发展中国家常见的食源性疾病包括霍乱、空肠弯曲菌、大肠杆菌感染、沙门氏菌病、志贺氏菌病。全世界5岁以下儿童每年发生腹泻的病例约为15亿例，其中300多万死亡，食物因素占很大比例。可见，食源性微生物中毒一直是食品安全的头号威胁。
3.目前，传统的食源性病原菌的检测、鉴定仍停留在分离培养、形态观察、生化鉴定和血清学分型水平。这些方法操作烦琐、检测周期较长，通常耗时5-14 天，因此，病原微生物的检测结果往往存在一定程度的滞后性。这即不利于食品安全监督检测机构实施控制措施，也不利于对潜在不安全产品迅速采取纠正措施，更不利于临床上中毒患者的正确救治。gb 29921-2013《食品安全国家标准食品中致病菌限量》新标准的实施后，对食源性致病菌进行准确、灵敏、省时、省力和低成本的快速检验方法已经成为保证食品安全的迫切需求。
4.一直以来，国内外研究机构和科研工作者都在致力于开发食源性病原菌的快速检测新技术方法。(1)酶联免疫法(elisa)，elisa是把抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化作用有机地结合起来的一种检测技术，它既可测抗原，也可测抗体。elisa法可用于检测食品中李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌o157、弯曲杆菌、假单胞菌属、致贺氏菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等。此外，elisa法还可用于食品介导的病毒的检测，目前我国已完成了禽流感流行株的分离和鉴定、禽流感重组核蛋白诊断抗原的研制及应用，建立了禽流感免疫酶诊断方法和技术。(2)微型自动荧光酶标分析法 (vidas)，利用酶联荧光免疫分析技术，通过抗原-抗体特异反应，分离出目标菌，由特殊仪器根据荧光的强弱自动判断样品的阳性或阴性。vidas法检测食品沙门菌比常规法敏感特异，对阴性样品检测时能很快作出非沙门菌的判断，比常规法可加快2～3天。(3)电阻抗技术，电阻抗法原理是细菌在生长繁殖中，将培养基中的碳水化合物、蛋白质和脂类等大分子电惰性物质，代谢为具有电活性的乳酸盐、醋酸盐等小分子物质，使培养基的阻抗发生变化，通过检测培养基的电阻抗变化情况，判定细菌在培养基中的生长繁殖特性，检测出相应的细菌。该法具有检测速度快、灵敏度高、准确性好等优点，目前已经用于细菌总数、霉菌、酵母菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的检测，但是选择性不够好。(4)聚合酶链式(pcr)反应技术。聚合酶链式反应技术是在体外合适条件下，以dna为模板，以一对人工合成的寡核苷酸为引物在耐热dna 聚合酶作用下特异性扩增目的dna片段的技术。通过引物序列的设计，可高选择性和特异性地识别各种致病菌的dna，从而实现了病源微生物检测。(5)免疫磁珠分离法，疫磁性分离技术是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面，与样品中被检
致病菌发生特异性结合，载有致病菌的磁性颗粒在外加磁场的作用下，向磁极方向聚集，弃去检样混合液，使致病菌不断得到分离、浓缩，是从食品成分中分离靶细菌非常有效的方法，该方法其实在分离富集方面更有价值。(6) 基因芯片技术，它是将各种基因寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品dna经 pcr扩增后制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特异微生物。基因芯片技术理论上可以在一次实验中检出所有潜在的致病菌，检测的灵敏度、特异性和快速便捷性都很高，因而在致病原分析检测中有很好的发展前景。
5.但是现有的快速检测技术仍然有很多问题亟待解决，如：(1)检测耗时较长，有很多新技术已经将检测时间降到24-36h，虽然有了很大改进，但是仍然不能满足特殊场景下的应用。如中毒者生命危在旦夕，急需确诊致病菌种类以便对症下药。(2)很多方法灵敏度不够。现有的检测方法中检测灵敏度达到100 cfu/g以上的实用性检测技术仍然不多。(3)样品处理仍然过于复杂。如为了达到较好的灵敏度，需要经过扩菌处理，增加了检测时长。(4)检测假阳性过多。如探针技术中，样品的dna污染，容易造成阴性样品检测呈阳性。(5)很难做到多个目标菌同时检测。
6.鉴于此，本发明的目的在于提供一种新的食源性致病菌检测方法解决上述技术问题。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是提供一种食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法，检测无需扩菌、检测灵敏度高，且可实现多目标检测。
8.为了解决上述问题，本发明的技术方案如下：
9.一种食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法，包括如下步骤：
10.步骤s1，制备银纳米颗粒、金纳米颗粒和枝状金纳米颗粒；
11.步骤s2，纳米颗粒修饰，采用沙门氏菌抗体、金黄色葡萄球菌抗体和志贺氏菌抗体分别对银纳米颗粒、金纳米颗粒和枝状金纳米颗粒进行修饰；
12.步骤s3，制备和修饰磁性纳米颗粒，得到多巴胺包裹修饰的水基磁流体；
13.步骤s4，样品检测，通过磁性纳米颗粒表面正电荷化，富集检测样品中的微生物；通过外加磁场实现检测样品中微生物和基质的分离；以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌为靶标，再与抗体修饰后的纳米颗粒作用后通过显微成像技术检测致病菌，且在显微镜下沙门氏菌呈现蓝色亮斑，金黄色葡萄球菌呈现绿色亮斑，志贺氏菌呈现红色亮斑。
14.进一步地，步骤s1中，银纳米颗粒的制备方法如下：
15.制备100ml体积的含有5mmol/l柠檬酸钠和0.025mmol/l鞣酸的水溶液，加热10-20min，边加热边搅拌；
16.加热至沸腾后，向该溶液中注入1ml 25mmol/l的agno3溶液，溶液变成亮黄色，通过在10000rpm转速下离心10分钟，吸掉上清液，加超纯水重新分散以去除过量的鞣酸，合成直径为10-20nm的银纳米颗粒种子，然后冷却溶液至80-90℃；
17.向银纳米颗粒种子溶液中依次加入100μl 25mmol/l柠檬酸钠，250μl 2.5 mmol/l鞣酸和250μl agno3，制备得到暗场显微镜下呈现蓝色的银纳米颗粒；
18.通过在10000rpm转速下离心10-15min纯化所得的银纳米颗粒。
19.进一步地，步骤s1中，金纳米颗粒的制备方法如下：
20.将1ml 24.24mmol/l的haucl4溶液加入到99ml超纯水中，将溶液置于油浴锅中边加热边搅拌，至沸腾时加入1ml质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液，待溶液变为酒红色后继续加热半小时，制备得到球形金纳米颗粒种子；
21.将合成的球形金纳米颗粒种子冷却后加入100ml带盖玻璃瓶中于4℃冰箱冷藏保存；
22.将200μl 24.24mmol/l的haucl4溶液、2ml球形金纳米颗粒种子溶液、200μl质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液加热煮沸25-35min，制备得到溶液为红色、暗场显微镜下呈绿色的大粒径的金纳米颗粒。
23.进一步地，枝状金纳米颗粒的制备方法如下：
24.将1ml 24.24mmol/l的haucl4溶液加入到99ml超纯水中，将溶液置于油浴锅中边加热边搅拌，至沸腾时加入1ml质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液，待溶液变为酒红色后继续加热半小时，制备得到球形金纳米颗粒种子；
25.将合成的球形金纳米颗粒种子冷却后加入100ml带盖玻璃瓶中于4℃冰箱冷藏保存；
26.将200μl 24.24mmol/l的haucl4溶液、2ml球形金纳米颗粒种子溶液、 200μl柠檬酸钠溶液(1％)、100μl对苯二酚溶液(0.5％)依次加入到20ml 水中，快速搅拌2分钟，室温下静置30分钟，制备得到得溶液为蓝色、暗场显微镜下呈红色的枝状金纳米颗粒。
27.进一步地，步骤s2中，纳米颗粒修饰包括如下步骤：
28.用超纯水分别稀释对应的纳米颗粒溶液，然后加入过量的1-巯基十一烷酸以通过ag-s键和置换反应与纳米颗粒的表面发生共价反应；
29.将溶液搅拌2-3h，然后加入1μm的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和100μm的n-羟基琥珀酰亚胺，并再搅拌30-40min，得到活化的纳米颗粒；
30.将沙门氏菌抗体、金黄色葡萄球菌抗体和志贺氏菌抗体分别添加到活化后的银纳米颗粒、金纳米颗粒和枝状金纳米颗粒溶液中，在常温环境下搅拌1-2h，离心去除上清液，加入超纯水洗涤，最后分散到磷酸盐缓冲液中，得到抗体修饰的纳米颗粒。
31.进一步地，步骤3中，制备和修饰磁性纳米颗粒包括如下步骤：
32.将fecl3·
6h2o和feso4·
4h2o溶于去离子水中，氮气保护下于78～82℃下快速加入氨水，温度稳定后逐滴加入质量浓度为1％的多巴胺，并搅拌80～100 min，制得多巴胺包裹修饰的水基磁流体。
33.进一步地，fecl3·
6h2o和feso4·
4h2o的质量比是(1.85-2.15)：1。
34.进一步地，步骤s4中，样品检测的具体步骤如下：
35.取样品适量溶于生理盐水中，调节ph至中性，加入步骤s3的磁性纳米颗粒溶液，混合均匀后静置一段时间；将强磁体放置于样品底部，待磁性纳米颗粒沉底后将上层样品倒掉，沉淀物采用生理盐水洗涤，得到第一反应体系(样品中细菌被富集)；
36.分别取抗体修饰的银纳米颗粒、金纳米颗粒和枝状金纳米颗粒加入到第一反应体系中孵育10-30min，然后采用生理盐水洗涤，得到第二反应体系(纳米颗粒锚定在细菌表面)；
37.撤去强磁体，向第二反应体系中加入适量生理盐水，摇匀孵育30分钟后，底部再次
放强磁体，待磁性纳米颗粒-细菌-金/银纳米颗粒沉底后，弃去上层样品，并清洗，再次加入1ml生理盐水悬浮后，吸取200μl置于暗场显微镜下观察，在显微镜下沙门氏菌呈现蓝色亮斑，金黄色葡萄球菌呈现绿色亮斑，志贺氏菌呈现红色亮斑。
38.与现有技术相比，本发明提供的食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法，有益效果在于：
39.一、本发明提供的食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法，基于磁性纳米颗粒的致病菌富集技术和三色贵金属纳米颗粒的显色技术，通过表面磁性纳米颗粒表面正电荷化，识别食品样品中的致病菌和其他活菌类，通过外加磁场实现样品中菌类和食品基质的分离，以食品中常见高发的病源微生物(沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和志贺氏菌)为靶标，再与抗体修饰的纳米颗粒作用后，通过暗场显微成像技术实现快速检测鉴定致病菌，在显微镜下沙门氏菌呈现蓝色亮斑，金黄色葡萄球菌呈现绿色亮斑，志贺氏菌呈现红色亮斑。因此，本发明提供的食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法，检测灵敏度可达到100个菌/g，检测时间大大缩短，且可以实现多目标同时检测。
40.二、本发明提供的食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法，磁性纳米颗粒的修饰是通过分子共价键偶联，将含有伯胺、仲胺和叔胺的小分子连接到磁性纳米颗粒表面，通过对磁性纳米颗粒表面正电荷化实现微生物的高度富集。
附图说明
41.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
42.图1是本发明中制备的银纳米颗粒的电镜图；
43.图2是本发明中制备的银纳米颗粒及修饰后的银纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图；
44.图3是本发明中银纳米颗粒在暗场显微镜下的观察图；
45.图4是本发明中制备的金纳米颗粒的电镜图；
46.图5是本发明中制备的金纳米颗粒及修饰后的金纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图；
47.图6是本发明中金纳米颗粒在暗场显微镜下的观察图；
48.图7是本发明中制备的枝状金纳米颗粒的电镜图；
49.图8是本发明中制备的枝状金纳米颗粒及修饰后的枝状金纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图；
50.图9是本发明中枝状金纳米颗粒在暗场显微镜下的观察图；
51.图10是本发明检测体系检测沙门氏菌的显微成像图；
52.图11是本发明检测体系检测金黄色葡萄球菌的显微成像图；
53.图12是本发明检测体系检测志贺氏菌的显微成像图。
具体实施方式
54.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式作进一步的说明。
55.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应该被视为在本文中具体公开。
56.实施例1
57.本发明提供的食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法，包括如下步骤：
58.步骤s1，制备银纳米颗粒、金纳米颗粒和枝状金纳米颗粒；
59.具体的，银纳米颗粒的制备方法如下：
60.制备100ml体积的含有5mmol/l柠檬酸钠和0.025mmol/l鞣酸的水溶液，加热10-20min，边加热边搅拌；
61.加热至沸腾后，向该溶液中注入1ml 25mmol/l的agno3溶液，溶液变成亮黄色，通过在10000rpm转速下离心10分钟，吸掉上清液，加超纯水重新分散以去除过量的鞣酸，合成直径为10-20nm的银纳米颗粒种子，然后冷却溶液至80-90℃；
62.向银纳米颗粒种子溶液中依次加入100μl 25mmol/l柠檬酸钠，250μl 2.5 mmol/l鞣酸和250μl agno3，制备得到暗场显微镜下呈现蓝色的银纳米颗粒；
63.通过在10000rpm转速下离心10-15min纯化所得的银纳米颗粒。
64.请结合参阅图1至图3，其中图1是本发明中制备的银纳米颗粒的电镜图；图2是本发明中制备的银纳米颗粒及修饰后的银纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图；图3是本发明中银纳米颗粒在暗场显微镜下的观察图。
65.金纳米颗粒的制备方法如下：
66.将1ml 24.24mmol/l的haucl4溶液加入到99ml超纯水中，将溶液置于油浴锅中边加热边搅拌，至沸腾时加入1ml质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液，待溶液变为酒红色后继续加热半小时，制备得到球形金纳米颗粒种子；
67.将合成的球形金纳米颗粒种子冷却后加入100ml带盖玻璃瓶中于4℃冰箱冷藏保存；
68.将200μl 24.24mmol/l的haucl4溶液、2ml球形金纳米颗粒种子溶液、 200μl质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液加热煮沸25-35min，制备得到溶液为红色、暗场显微镜下呈绿色的大粒径的球形金纳米颗粒。
69.请结合参阅图4至图6，其中图4是本发明中制备的金纳米颗粒的电镜图；图5是本发明中制备的金纳米颗粒及修饰后的金纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图；图6是本发明中金纳米颗粒在暗场显微镜下的观察图。
70.枝状金纳米颗粒的制备方法如下：
71.将1ml 24.24mmol/l的haucl4溶液加入到99ml超纯水中，将溶液置于油浴锅中边加热边搅拌，至沸腾时加入1ml质量浓度为1％的柠檬酸钠溶液，待溶液变为酒红色后继续加热半小时，制备得到球形金纳米颗粒种子；
72.将合成的球形金纳米颗粒种子冷却后加入100ml带盖玻璃瓶中于4℃冰箱冷藏保
存；
73.将200μl 24.24mmol/l的haucl4溶液、2ml球形金纳米颗粒种子溶液、 200μl柠檬酸钠溶液(1％)、100μl对苯二酚溶液(0.5％)依次加入到20ml 水中，快速搅拌2分钟，室温下静置30分钟，制备得到溶液为蓝色、暗场显微镜下呈红色的枝状金纳米颗粒。
74.请结合参阅图7至图9，其中图7是本发明中制备的枝状金纳米颗粒的电镜图；图8是本发明中制备的枝状金纳米颗粒及修饰后的枝状金纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图；图9是本发明中枝状金纳米颗粒在暗场显微镜下的观察图。
75.步骤s2，纳米颗粒修饰，采用沙门氏菌抗体、金黄色葡萄球菌抗体和志贺氏菌抗体分别对银纳米颗粒、金纳米颗粒和枝状金纳米颗粒进行修饰；
76.具体的，用超纯水分别稀释对应的纳米颗粒溶液，然后加入过量的1-巯基十一烷酸以通过ag-s键和置换反应与纳米颗粒的表面发生共价反应；
77.将溶液搅拌2-3h，然后加入1μm新鲜制备的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和100μm新鲜制备的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，并再搅拌30-40min，得到活化的纳米颗粒；
78.将沙门氏菌抗体、金黄色葡萄球菌抗体和志贺氏菌抗体分别添加到活化后的银纳米颗粒、金纳米颗粒和枝状金纳米颗粒溶液中，在常温环境下搅拌1-2h，离心去除上清液，加入超纯水洗涤，最后分散到磷酸盐缓冲液中，得到抗体修饰的纳米颗粒。
79.修饰后的银纳米颗粒、金纳米颗粒和枝状金纳米颗粒的紫外可见吸收光谱图分别参阅图2、图5和图8。
80.步骤s3，制备和修饰磁性纳米颗粒，得到多巴胺包裹修饰的水基磁流体；
81.具体的方法如下：
82.将fecl3·
6h2o和feso4·
4h2o溶于去离子水中，氮气保护下于78～82℃下快速加入氨水，温度稳定后逐滴加入质量浓度为1％的多巴胺，并搅拌80～100 min，制得多巴胺包裹修饰的水基磁流体。制备的巴胺包裹修饰的水基磁流体，通过分子共价键偶联，将含有伯胺、仲胺和叔胺的小分子连接到磁性纳米颗粒表面，通过对磁性纳米颗粒表面正电荷化实现微生物的高度富集。其中， fecl3·
6h2o和feso4·
4h2o的质量比是(1.85-2.15)：1。
83.步骤s4，样品检测，通过磁性纳米颗粒表面正电荷化，富集检测样品中的微生物；通过外加磁场实现检测样品中微生物和基质的分离；以沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌为靶标，再与抗体修饰后的纳米颗粒作用后通过暗场显微成像技术检测致病菌，且在显微镜下沙门氏菌呈现蓝色亮斑，金黄色葡萄球菌呈现绿色亮斑，志贺氏菌呈现红色亮斑。
84.具体的，包括如下步骤：
85.取样品适量溶于生理盐水中，调节ph至中性，加入步骤s3的磁性纳米颗粒溶液，混合均匀后静置一段时间；将强磁体放置于样品底部，待磁性纳米颗粒沉底后将上层样品倒掉，沉淀物采用生理盐水洗涤，得到第一反应体系；
86.分别取抗体修饰的银纳米颗粒、金纳米颗粒和枝状金纳米颗粒加入到第一反应体系中孵育10-30min，然后采用生理盐水洗涤，得到第二反应体系；
87.撤去强磁体，向第二反应体系中加入适量生理盐水，摇匀孵育30min后，底部再次放强磁体，待磁性纳米颗粒-细菌-金/银纳米颗粒沉底后，弃去上层样品，并清洗，再次加入1ml生理盐水悬浮后，吸取200μl置于暗场显微镜下观察，在显微镜下沙门氏菌呈现蓝色亮
斑，金黄色葡萄球菌呈现绿色亮斑，志贺氏菌呈现红色亮斑。
88.请结合参阅图10至图12，其中图10是本发明检测体系检测沙门氏菌的显微成像图；图11是本发明检测体系检测金黄色葡萄球菌的显微成像图；图12 是本发明检测体系粒检测志贺氏菌的显微成像图。由图10至图12可以看出，采用沙门氏菌抗体修饰后的银纳米颗粒使沙门氏菌呈蓝色亮斑，采用金黄色葡萄球菌抗体修饰的金纳米颗粒使金黄色葡萄球菌呈绿色亮斑，采用志贺氏菌抗体修饰的枝状金纳米颗粒使志贺氏菌呈红色亮斑。
89.实施例2
90.称取25g食品样品(大块状需粉碎)至225ml生理盐水中，摇匀；如样品是强酸性或强碱性，需调节ph至中性；
91.加入0.01g多巴胺包裹修饰的水基磁流体，摇匀，静置10-120min；将强磁铁放置于样品底部，静置3-10分钟，待磁性纳米颗粒沉底后，将上层食品样品倒掉，并加入生理盐水洗涤一次，得到第一反应体系；
92.分别吸取10μl抗体修饰的银纳米颗粒溶液、金纳米颗粒溶液和枝状金纳米颗粒溶液加入到第一反应体系中孵育10-30min，然后采用生理盐水洗涤磁性纳米颗粒2次，得到第二反应体系；
93.撤去强磁体，向第二反应体系中加入适量生理盐水，摇匀孵育30分钟后，底部再次放强磁体，待磁性纳米颗粒-细菌-(金或银)纳米颗粒沉底后，弃去上层样品，并清洗，再次加入1ml生理盐水悬浮后，吸取200μl置于暗场显微镜下观察，在显微镜下沙门氏菌呈现蓝色亮斑，金黄色葡萄球菌呈现绿色亮斑，志贺氏菌呈现红色亮斑。
94.使用本发明的检测方法，理论上可实现单个细菌的检测，根据实际检测结果，样品检测灵敏度可达到100个菌/g。
95.与现有技术相比，本发明提供的食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法，有益效果在于：
96.一、本发明提供的食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法，基于磁性纳米颗粒的致病菌富集技术和三色贵金属纳米颗粒的显色技术，通过表面磁性纳米颗粒表面正电荷化，识别食品样品中的致病菌和其他活菌类，通过外加磁场实现样品中菌类和食品基质的分离，以食品中常见高发的病源微生物(沙门氏菌，金黄色葡萄球菌和志贺氏菌)为靶标，再与抗体修饰的纳米颗粒作用后，通过暗场显微成像技术实现快速检测鉴定致病菌，在显微镜下沙门氏菌呈现蓝色亮斑，金黄色葡萄球菌呈现绿色亮斑，志贺氏菌呈现红色亮斑。因此，本发明提供的食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法，检测灵敏度可达到100个菌/g，检测时间缩短到3h内，且可以实现多目标同时检测。
97.二、本发明提供的食源性致病菌高灵敏快速显色检测方法，磁性纳米颗粒的修饰是通过分子共价键偶联，将含有伯胺、仲胺和叔胺的小分子连接到磁性纳米颗粒表面，通过对磁性纳米颗粒表面正电荷化实现微生物的高度富集。
98.以上对本发明的实施方式做出详细说明，但本发明不局限于所描述的实施方式。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下对这些实施例进行的多种变化、修改、替换和变型均仍落入在本发明的保护范围之内。