一种抗CD137单克隆抗体的生物活性测定方法与流程

一种抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法
技术领域
1.本发明涉及生物活性测定技术领域，具体涉及一种抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法。


背景技术：

2.在肿瘤免疫中具有重要作用的t细胞被两个信号激活：1)t细胞受体(tcr)与主要组织相容性复合物(mhc)i类分子呈递的抗原肽结合，和tcr的激活；2)t细胞表面上的一种共刺激分子与其在抗原呈递细胞上的配体的结合以及该共刺激分子的激活。另外，cd137(41bb)的肿瘤坏死因子受体超家族(tnfrsf)的共刺激分子，对t细胞激活很重要。


技术实现要素：

3.本发明的目的在于提供一种抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法。
4.为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
5.一种抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法，包括以下步骤：
6.(1)将ccrf cem nf-kb细胞悬液进行离心处理，弃上清液，再用完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为3.3*10^5/ml；
7.(2)向步骤(1)所得细胞液中加入pma和ionomycin的混合液刺激细胞，然后进行离心处理，弃上清液，再用完全培养基调整细胞浓度为3.3*10^6/ml；
8.(3)配制抗体溶液：
9.将交联抗体和cd137抗体加入完全培养基中制得交联组抗体溶液，进行梯度稀释，得到8个浓度梯度的抗体溶液；
10.将cd137抗体加入完全培养基中制得非交联组抗体溶液，进行梯度稀释，得到8个浓度梯度的抗体溶液；
11.(4)取步骤(3)所得抗体溶液分别与步骤(2)所得细胞悬液混合均匀，静置培养，然后加入荧光素酶底物，孵育，再检测化学发光的表达。
12.本发明所述抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法，当抗cd137单克隆抗体与靶细胞表达的cd137结合，通过激活cd137信号，进一步激活了转录因子nfkb，启动荧光素酶的表达，其表达量与抗cd137单克隆抗体的生物活性呈正相关，加入细胞裂解液和荧光素酶底物后，测定其化学发光值并绘制量效曲线，以此测定抗cd137单克隆抗体生物学活性。
13.nfkb(核因子激活的b细胞的κ-轻链增强)是一种蛋白质复合物，其控制转录的dna，细胞因子产生和细胞存活。nf-κb几乎存在于所有动物细胞类型中，并参与细胞对刺激的反应，如应激，细胞因子，自由基，重金属，紫外线照射，氧化ldl和细菌或病毒抗原。
14.上述一种抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法，作为一种优选的实施方案，步骤(1)中，离心处理的速率为300r/min，离心时间为5min；所述完全培养基为：rpmi1640培养基和rpmi1640培养基体积10％的胎牛血清的混合物。
15.rpmi1640培养基，rpmi是roswell park memorial institute的缩写，代指洛斯
维
·
帕克纪念研究所。rpmi是该研究所研发的一类细胞培养基，1640是培养基代号。
16.上述一种抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法，作为一种优选的实施方案，步骤(2)中，pma和ionomycin的混合液中pma的浓度为162nm pma，ionomycin的浓度为2.68um ionomycin；刺激细胞为：在温度为37
°
的条件下，刺激48h；所述完全培养基为rpmi1640培养基和rpmi1640培养基体积10％的胎牛血清的混合物。
17.pma和ionomycin的混合液是指佛波酯(pma)和离子酶素(ionomycin)的混合液，可用于刺激体外培养细胞产生细胞因子，随后用免疫学方法进行检测。
18.上述一种抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，所述交联抗体为anti-fc抗体(抗fc)，交联抗体和cd137抗体的摩尔比为2.5：1；所述交联组抗体溶液的浓度为10ug/ml，所述梯度稀释为采用完全培养基作为稀释液，3倍梯度稀释，得到8个浓度梯度的抗体溶液。
19.3倍梯度稀释为：将交联组抗体溶液稀释3倍得3.3333ug/ml的交联组抗体溶液，再稀释3倍得1.1111ug/ml的溶液，再稀释3倍得0.3703ug/ml的溶液，再稀释3倍得0.1235ug/ml的溶液，再稀释3倍得0.0412ug/ml的溶液，再稀释3倍得0.0137ug/ml的溶液，再稀释3倍得0.0046ug/ml的溶液；即得到8个浓度梯度的抗体溶液。
20.上述一种抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法，作为一种优选的实施方案，步骤(3)中，所述非交联组抗体溶液的浓度为10ug/ml，所述梯度稀释为采用完全培养基作为稀释液，3倍梯度稀释，得到8个浓度梯度的抗体溶液。
21.上述一种抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法，作为一种优选的实施方案，步骤(4)中，抗体溶液与细胞悬液的体积比为1：1，所述静置培养为在温度为37
°
的条件下，静置培养6h。
22.上述一种抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法，作为一种优选的实施方案，步骤(4)中，所述荧光素酶底物为steady-glo(promega,e2520)，所述荧光素酶底物与所述抗体溶液和所述细胞悬液混合液的体积比为5：6。
23.上述一种抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法，作为一种优选的实施方案，步骤(4)中，所述静置培养为：在温度为37
°
的条件下，培养6h；所述孵育为在温度为20-25℃的条件下，避光孵育15-30min。
24.本发明实施例具有如下优点：
25.1、本发明所述抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法通过激活cd137信号，进一步激活转录因子nfkb，启动荧光素酶的表达，其表达量与抗cd137单克隆抗体的生物活性呈正相关，通过测定其化学发光值来测定抗cd137单克隆抗体的生物活性，专属性强、耐用性高，对于抗cd137单克隆抗体的质量控制和临床应用具有重要意义。
26.2、本发明所述抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法的cd137蛋白是通过刺激后表达在细胞株上，而非人工稳转，更接近天然状态使测量更精准。
27.3、本发明所述抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法操作简单，用时短(一天就可以测出)，稳定性高，结果稳定可靠，能有效区分各候选抗体间的活性差别。
附图说明
28.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方
式作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
29.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
30.图1为本发明实施例1提供的cd137抗体的测试结果图；
31.图2为本发明实施例1提供的cd137经交联后的测试结果图。
具体实施方式
32.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
33.实施例1
34.一种抗cd137单克隆抗体的生物活性测定方法，包括以下步骤：
35.(1)将ccrf cem nf-kb细胞悬液在300r/min的离心速率下离心处理5min，弃上清液，再用完全培养基(rpmi1640培养基和rpmi1640培养基体积10％的胎牛血清的混合物)重悬细胞，并调整细胞浓度为3.3*10^5/ml；
36.(2)向步骤(1)所得细胞液中加入pma和ionomycin的混合液(混合液中pma的浓度为162nm pma，ionomycin的浓度为2.68um ionomycin)，在温度为37℃的条件下刺激细胞48h，然后在300r/min的离心速率下离心处理5min，弃上清液，再用完全培养基(rpmi1640培养基和rpmi1640培养基体积10％的胎牛血清的混合物)调整细胞浓度为3.3*10^6/ml；
37.(3)配制抗体溶液：
38.将交联抗体(anti-fc抗体)和cd137抗体按照摩尔比为2.5：1，加入完全培养基中制得浓度为10ug/ml的交联组抗体溶液，采用完全培养基进行3倍梯度稀释，得到8个浓度梯度的抗体溶液；(因交联组抗体溶液的浓度为10ug/ml，稀释3倍后得3.333333333ug/ml的交联组抗体溶液，再稀释3倍得1.111111111ug/ml的溶液，再稀释3倍得0.370370370ug/ml的溶液，再稀释3倍得0.123456789ug/ml的溶液，再稀释3倍得0.041152263ug/ml的溶液，再稀释3倍得0.013717421ug/ml的溶液，再稀释3倍得0.004572473ug/ml的溶液；即得到8个浓度梯度的抗体溶液)
39.将cd137抗体加入完全培养基中制得浓度为10ug/ml的非交联组抗体溶液，采用完全培养基稀释液进行3倍梯度稀释，得到8个浓度梯度的抗体溶液；(3倍梯度稀释的方式同上)
40.(4)取步骤(3)所得抗体溶液分别与步骤(2)所得细胞悬液按照体积比为1：1混合均匀(在混合时，将细胞悬液加入96孔白板中，每孔加入30ul的细胞悬液，然后再取30ul抗体溶液分别加入细胞悬液中混合)，在温度为37℃的条件下静置培养6h，然后加入荧光素酶底物steady-glo(promega,e2520)，加入荧光素酶底物的量与所述抗体溶液和所述细胞悬液混合液的体积比为5：6，在温度为20-25℃的条件下孵育15-30min，再检测(化学发光)
luminescence的表达。
41.本技术实施例1采用30ul的细胞悬液和30ul的抗体溶液混合，加入荧光素酶底物的量为50ul，本技术实施例1的化学发光检测结果如表1所示：
42.表1本技术实施例1化学发光检测结果
[0043][0044][0045]
从表1可以看出：化学发光值与抗体的活性成正相关，有些抗体如：anti-cd137ab2需要交联抗体的介导才能有活性，有些抗体如：anti-cd137 ab1它的活性不依赖于交联抗体的存在。
[0046]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。