一种定量检测白色念珠菌烯醇化酶抗体的方法与流程

1.本发明涉及一种定量检测白色念珠菌烯醇化酶抗体的方法，属于生物学技术领域。


背景技术：

2.现代医疗面临侵袭性念珠菌病(invasive candidiasis，ic)的挑战越来越大，许多地区ic发病率持续上升，即使患者接受了抗真菌治疗，病死率率亦高达40％。当下常规的实验室诊断技术，如微生物培养，β-葡聚糖检测实验等，不能完全满足现代医疗快速准确的要求。在实验室诊断技术研究领域，白色念珠菌烯醇化酶(candida albicans enolase，caeno1)抗体检测被认为是可以用于ic诊断的重要指标。早在1994年，van deventer aj等就发展了间接elisa法检测caeno1抗体用于ic诊断。该研究具体的方法是用30μg/ml的粗提caeno1抗原包被空白酶联板，封闭后，加入倍比稀释的人血清(起始稀释度为1：200)，再以辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗人igg为检测抗体来分析血清中的caeno1抗体浓度。该方法对免疫力正常的ic病人诊断敏感性为50％，特异性为86％。此后，在间接elisa技术进一步发展，人们开始利用重组caeno1作为诊断抗原检测ic患者血清中的caeno1抗体，西班牙的vircell公司生产的“念珠菌烯醇化酶igg抗体检测试剂盒”就是基于这一原理。lain a等用该试剂盒检测了51例免疫力正常和47例免疫力缺陷患者的血清，总体敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为81.0％，83.9％，79.1％和85.5％。
3.从技术角度分析，上文提及的几种技术都有不同程度的缺陷。van deventer aj等利用白色念珠菌粗提蛋白作为包被抗原，是由于较早的时代分子生物学技术的局限，无法获得caeno1基因序列信息，并在此基础上制备重组的caeno1抗原。使用粗提念珠菌蛋白为抗原，由于抗原成分复杂，往往导致检测的特异性明显降低。采用重组蛋白作为抗原包被酶联板建立的间接elisa法相对提高了检测的特异性，但间接法本身的缺陷是血清中非特异性igg与酶联板的结合容易出现较高的本底，往往需要对血清进行较多倍数的稀释致使实验操作复杂。且现有方法在检测人血清样本时仅能定性，无法实现定量检测，在患者治疗或者病情发展的评估中难以起到应有的作用。


技术实现要素：

4.为克服现有技术弊端，本发明提供一种定量检测白色念珠菌烯醇化酶抗体的方法，通过对单克隆抗体9h8的筛选并作为标准物质引入双抗原夹心elisa实验中，建立了检测caeno1抗体的双抗原夹心elisa相对定量方法。
5.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
6.一种定量检测白色念珠菌烯醇化酶抗体的方法，采用双抗原夹心elisa方法，以单克隆抗体9h8作为标准物质，建立标准曲线，定量检测caeno1抗体的双抗原夹心elisa方法，包括如下步骤：
7.a、将重组的caeno1抗原用0.1m、ph 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至3μg/ml，每孔加入
100μl，包被空白酶联板，4℃过夜，次日用0.01m的pbst洗板；
8.b、每孔加入200μl 5g/l脱脂奶粉封闭液，37℃温育2h，0.01m的pbst洗板；
9.c、每孔加入50μl的血清样本，标准曲线孔中分别加入50μl倍比梯度稀释至一定浓度的单克隆抗体9h8，37℃温育1h，0.01m的pbst洗板5次；
10.d、每孔加入50μl利用pbst稀释的标记重组蛋白hrp-caeno1，37℃温育30min，0.01m的pbst洗板5次；
11.e、加入tmb底物显色液100μl显色，37℃温育15min，加入2m的h2so4终止反应，酶联测定仪在450nm和620nm双波长读取吸光度值；
12.f、根据标准物质浓度和吸光度值建立标准曲线，根据标准曲线计算血清样本中caeno1抗体的相对含量。
13.上述定量检测白色念珠菌烯醇化酶抗体的方法，所述步骤c中，单克隆抗体9h8倍比梯度稀释的浓度的选择标准为：将接近线性范围上限的高值样本按一定比例稀释为至少5种浓度，其中低值样本浓度须接近线性范围的下限；每一浓度重复检测2次，计算平均值，将结果平均值和稀释比例用最小二乘法进行直线拟合，并计算线性相关系数r，r》0.9900的为合适的浓度值。
14.上述定量检测白色念珠菌烯醇化酶抗体的方法，所述步骤a中，重组的caeno1抗原的制备过程为：根据genbank提供的序列(nw_139596)，对caeno1的全长基因进行合成，合成的基因经酶切后转入表达载体pet30(a)，继而导入大肠杆菌bl21(de3)中，构建工程菌株bl21-pet21a(+)-caeno1；工程菌裂解物经镍柱亲和层析后得到纯化的重组caeno1蛋白。
15.上述定量检测白色念珠菌烯醇化酶抗体的方法，所述步骤c中，所述血清样本用生理盐水1：10稀释或不稀释。
16.上述定量检测白色念珠菌烯醇化酶抗体的方法，所述步骤d中，0.01m pbst稀释的标记重组蛋白hrp-caeno1至0.5-2μg/ml。
17.本发明的有益效果是：
18.(1)本发明检测方法中引入异源单克隆抗体9h8作为标准物质，实现了caeno1抗体的定量检测，结果更为精确，为念珠菌感染患者疗效和病程监测提供较好的技术手段。
19.(2)与间接法elisa比较，本发明采用较低的血清稀释度，1：10稀释或者不稀释，降低了稀释引起的实验误差，同时也减小了实验操作的劳动量。
20.(3)与常用的间接法elisa检测比较，本发明检测基本实现无本底检测，利于检测方法的标准化。
21.(4)本发明设计的检测原理为双抗原夹心elisa，检测对象为血清中的抗caeno1总抗体，从感染到可以检测出抗体之间的窗口期更短，抗体升高明显。
22.(5)本发明可以检测除人体标本以外的其他动物标本，应用范围更广泛。
附图说明
23.图1为重组caeno1蛋白镍琼脂糖亲和层析sds-page分析图；
24.图2为western-blot验证单克隆抗体9h8特异性图；
25.图3为实施例1双抗原夹心法标准曲线图(双对数直线拟合)；
26.图4为实施例1双抗原夹心与间接法检测感染白色念珠菌sc5314的小鼠血清中的
caeno1抗体浓度；
27.图5为实施例1中传统间接法标准曲线图(双对数直线拟合)；
28.图6为实施例2中系列1浓度双抗原夹心法标准曲线图(双对数直线拟合)；
29.图7为实施例2中系列2浓度双抗原夹心法标准曲线图(双对数直线拟合)；
30.图8为白色念珠菌感染小鼠血清抗caeno1抗体含量动态变化；
31.图9为双抗原夹心elisa检测过程示意图。
32.图1中，m：protein marker；1：上样；2：流出；3-4：20mm imidazole；5：50mm imidazole；6：500mm imidazole。
具体实施方式
33.本发明采用基于双抗原夹心法的酶联免疫吸附检测技术。将重组caeno1包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的抗caeno1抗体会与酶标板上的包被抗原充分结合；洗板后利用辣根过氧化物酶(hrp)标记重组蛋白caeno1，得到的标记重组蛋白hrp-caeno1会与板子上包被抗原捕获的标准品或样本中的抗caeno1抗体发生特异性结合；洗板后加入显色剂底物tmb，若反应孔中样品存在不同浓度的抗caeno1抗体，则hrp会使无色tmb呈现不同深浅(正相关)的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；最后，在波长450nm处测定反应孔样品吸光度(od450)，样本中的抗caeno1抗体浓度与od450成正比，通过绘制标准曲线和利用四参数拟合软件便可计算出样本中抗caeno1抗体的相对浓度。
34.因为双抗原夹心elisa方法测定的是总抗体，且不具备种属特异性，本发明统一的以小鼠源性的igg抗体9h8作为定量的标准物质，所以测定的定量结果为相对浓度，亦即样本中抗体可以结合抗原的相对数量，为方便换算和理解，采用标准单位来定义，本发明用1ng/ml单克隆抗体9h8引起的elisa吸光度变化定义为1个标准单位(u/ml)的总抗体含量。
35.重组的caeno1抗原的制备过程为：根据genbank提供的序列(nw_139596)，对caeno1的全长基因进行合成，合成的基因经酶切后转入表达载体pet30(a)，继而导入大肠杆菌bl21(de3)中，构建工程菌株bl21-pet21a(+)-caeno1；白色念珠菌烯醇化酶基因在工程菌株中得到了高效表达。表达产物主要存在于裂解上清中，表达量达到菌体蛋白的30％以上。工程菌裂解物经镍柱亲和层析后得到纯化的重组caeno1蛋白，图1为重组caeno1蛋白纯化前和纯化后sds-page分析，可见目的条带清晰，纯化效果好，纯度可达95％以上。
36.本发明选用单克隆抗体9h8作为标准物质，单克隆抗体9h8的获取包括：
37.(1)杂交瘤细胞株的制备过程为：采用经典的杂交瘤技术制备抗单克隆抗体，以纯化的重组caeno1蛋白为抗原，免疫balb/c小鼠，将caeno1蛋白免疫的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0进行细胞融合，经克隆筛选获得小鼠抗caeno1蛋白单抗的杂交瘤细胞株；
38.(2)筛选：经阳性克隆筛选和有限稀释法克隆化培养，最终确定9h8为该检测的标准抗体。
39.(3)鉴定：采用western-blot和lc-ms/ms质谱分析验证该抗体的反应特异性。将重组caeno1(55kd)和白色念珠菌临床株sc5314菌体裂解物(含48kd大小的天然caeno1)经sds-page电泳后转移至pvdf膜，封闭后以单克隆抗体9h8与之反应，以hrp-羊抗小鼠igg为检测抗体，dab显色。结果如图2所示，抗体9h8与重组caeno1在55kd处产生反应条带，与
sc5314裂解物在48kd处产生反应条带，可见9h8与caeno1具有良好的反应性和特异性。
40.以9h8偶联n-羟基琥珀酼亚胺(nhs)活化的berpharose ff亲和层析凝胶颗粒，用白色念珠菌全菌蛋白进行亲和层析，lc-ms/ms质谱分析层析洗脱液，具体过程为：亲和纯化制备9h8单抗15mg，用1ml 0.2m nahco3，0.5m nacl溶解,，之后加入1ml nhs活化的sepharose ff凝胶4℃震荡偶联过夜，上述溶液过滤，用50ml 0.2m nahco3，0.5m nacl清洗偶联后的凝胶，用5ml封闭缓冲液(0.2m nahco3，0.5m nacl，0.5m乙醇胺，ph8.3)室温震荡4小时，最后用蒸馏水清洗干净，装柱，0.01m pbs保存。大量培养白色念珠菌sc5314，收集菌体，液氮充分研磨，加入10倍体积的0.01m pbs充分溶解，离心收取上清液，穿流通过偶联的9h8亲和柱，0.01m pbs冲洗5个柱体积，加入洗脱缓冲液(0.1m甘氨酸-盐酸ph3.4)收集洗脱峰，紫外法测定蛋白含量，lc-ms/ms质谱分析系统鉴定蛋白种类，鉴定结果如下表1所示，获取的caeno1谱图占总数的99％以上，说明9h8与caeno1之间有良好的亲和性且反应特异性很高。
41.表1 lc-ms/ms质谱分析9h8与白色念珠菌全菌蛋白亲和层析成分
[0042][0043]
下面结合实施例对本发明作进一步说明。
[0044]
实施例1
[0045]
挑选6只体重、周龄相近性别相同的balb/c小鼠，随机分成实验组和对照组。实验组小鼠每只腹腔注射白色念珠菌(sc5314)1
×
106cfu，对照组注射等体积生理盐水。自注射菌液开始计算，注射后第0、4、6、8、11、13、15、18、20、22、25、27天采集小鼠尾血，用本发明建立的检测方法检测小鼠尾血血清中caeno1抗体含量，参看图9，具体检测过程为：
[0046]
a、将重组的caeno1抗原用0.1m、ph 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至3μg/ml，每孔加入100μl，包被空白酶联板，4℃过夜，次日用0.01m的pbst洗板；
[0047]
b、每孔加入200μl 5g/l脱脂奶粉封闭液，37℃温育2h，0.01m的pbst洗板；
[0048]
c、每孔加入50μl的小鼠尾血血清样本，标准曲线孔中分别加入50μl梯度稀释至320、160、80、40、20ng/ml浓度的单克隆抗体9h8，37℃温育1h，0.01m的pbst洗板5次；
[0049]
d、每孔加入50μl利用pbst稀释至1μg/ml的标记重组蛋白hrp-caeno1，37℃温育30min，0.01m的pbst洗板5次；
[0050]
e、加入tmb底物显色液100μl显色，37℃温育15min，加入2m的h2so4终止反应，酶联测定仪在450nm和620nm双波长读取吸光度值；注：采用波长620nm(od620)，测定od620主要用于排除本底干扰，不用来作为检测定量的参考；
[0051]
f、根据标准物质浓度和吸光度值建立标准曲线，根据标准曲线计算样本中caeno1抗体的相对含量。不同含量标准物质检测吸光度值见下表2，标准曲线经双对数直线拟合后
见图3，其中y＝1.29755x-2.75396；r2＝0.99591。
[0052]
表2不同含量标准物质检测吸光度值
[0053]
标准物质浓度(u/ml)检测光密度od值200.084400.196800.5961601.3293202.895
[0054]
同时与传统的间接法检测结果进行对比。结果如图4所示，可见与间接法相比，本发明的双抗原夹心elisa方法在感染早期即可检测到高浓度的抗体。例如以100u/ml为检测阳性阈值，本发明可将诊断时间提前至感染后的第6天；对照组小鼠血清中无抗体，检测不到相应的数值。
[0055]
传统的间接法具体过程为：
[0056]
a、将重组的caeno1抗原用0.1m、ph 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至1μg/ml，每孔加入100μl，包被空白酶联板，4℃过夜，次日用0.01m的pbst洗板；
[0057]
b、每孔加入200μl 5g/l脱脂奶粉封闭液，37℃温育2h，0.01m的pbst洗板；
[0058]
c、每孔加入50μl用pbst 1：10稀释的的小鼠尾血血清样本，标准曲线孔中分别加入50μl梯度稀释至80、40、20、10、5ng/ml浓度的单克隆抗体9h8，37℃温育1h，0.01m的pbst洗板5次；
[0059]
d、每孔加入50μl利用0.01m的pbst 1：200稀释的hrp标记兔抗小鼠igg，37℃温育30min，0.01m的pbst洗板5次；
[0060]
e、加入tmb底物显色液100μl显色，37℃温育15min，加入2m的h2so4终止反应，酶联测定仪在450nm和620nm双波长读取吸光度值；
[0061]
f、根据标准物质浓度和吸光度值建立标准曲线，根据标准曲线计算样本中caeno1 igg抗体的相对含量。不同含量标准物质检测吸光度值见下表3，标准曲线经双对数直线拟合后见图5，其中y＝0.86x-1.44281；r2＝0.9987
[0062]
表3不同含量标准物质检测吸光度值
[0063]
标准物质浓度(u/ml)检测光密度od值50.140100.263200.489400.889801.500
[0064]
实施例2
[0065]
由实施例1中的实验组任选两组小鼠尾血血清样本与对照组小鼠血清混合，制作盲测样本1和样本2，标准物质配制不同的两个系列稀释浓度，用以分析不同标准曲线对检测结果的影响。检测过程具体为：
[0066]
a、将重组的caeno1抗原用0.1m、ph 9.6的碳酸盐缓冲液稀释至3μg/ml，每孔加入100μl，包被空白酶联板，4℃过夜，次日用0.01m的pbst洗板；
[0067]
b、每孔加入200μl 5g/l脱脂奶粉封闭液，37℃温育2h，0.01m的pbst洗板；
[0068]
c、检测孔加入50μl的盲测血清样本1、样本2，标准曲线孔中分别加入2组倍比梯度稀释的标准物质单克隆抗体9h8 50μl，浓度分别为系列1：320、160、80、40、20ng/ml，系列2：240、120、60、30、15ng/ml的单克隆抗体9h8，37℃温育1h，0.01m的pbst洗板5次；
[0069]
d、每孔加入50μl利用0.01m的pbst稀释至1μg/ml的标记重组蛋白hrp-caeno1，37℃温育30min，0.01m的pbst洗板5次；
[0070]
e、加入tmb底物显色液100μl显色，37℃温育15min，加入2m的h2so4终止反应，酶联测定仪在450nm和620nm双波长读取吸光度值；
[0071]
f、根据标准物质浓度和吸光度值建立标准曲线，根据标准曲线计算样本中caeno1抗体的相对含量。
[0072]
标准曲线及检测结果见表4、表5，图7和图8，其中，系列1浓度标准曲线y＝1.30109x-2.76020；r2＝0.99686；系列2浓度标准曲线y＝1.28178x-2.71979；r2＝0.99957。
[0073]
表4系列1、系类2标准物质检测吸光度值
[0074][0075]
注：od值1和od值2重复两次测量的od450结果。
[0076]
分别采用两种系列稀释的标准曲线计算样本中caeno1含量，结果见表5。
[0077]
表5不同标准曲线检测样本计算结果
[0078][0079]
由表5可知，梯度稀释的单克隆抗体9h8选择不同浓度用于换算同一个血清检测结果时，换算结果无明显差别。
[0080]
(一)对本发明定量检测方法进行准确度测定
[0081]
采用回收试验，将高值样本(a)加入到低值样本(b)中，所加入样本a与样本b之间的体积比为1：9，根据下面公式计算回收率(r)。
[0082][0083]
式中：
[0084]
r——回收率；
[0085]
v——加入a液体积；
[0086]v0
——血清或相应基质b的体积；
[0087]
c——血清样品或相应基质加入a液后的检测浓度；
[0088]
c0——血清样品或相应基质b的检测浓度；
[0089]cs
——a液的浓度。
[0090]
检测结果如下表6，可得到回收率约为107.8％。
[0091]
表6回收率测试结果
[0092][0093]
(二)检出限测定
[0094]
用零校准品或样本稀释液作为样本进行检测，重复测定20次，得出20次测量结果的od值，计算其平均值(m)和标准差(sd)，以m+2sd值，求出对应的浓度值，即为最低检出限。
[0095]
检测结果如下表7，经计算可知本发明最低检测限为18.5u/ml。
[0096]
表7检测限测定结果
[0097][0098]
(三)重复性测定
[0099]
用浓度分别为(200
±
20)u/ml和(100
±
10)u/ml的样本各重复检测10次，计算其浓度值，计算10次测量结果的平均值(m)和标准差(sd)，根据公式cv＝sd/m
×
100％得出变异系数(cv)
[0100]
检测结果如下表8：
[0101]
表8重复性检测结果
[0102][0103]
经计算，可知本发明在200u/ml浓度水平变异系数为2.29％，在100u/ml浓度水平变异系数为3.47％。
[0104]
(四)特异性实验
[0105]
白色念珠菌，光滑念珠菌，近平滑念珠菌，热带念珠菌和克柔念珠菌是临床最常见的念珠菌病原，总和占比超过95％。分别使用以上五种念珠菌标准株：白色念珠菌sc5314，光滑念珠菌atcc15126，近平滑念珠菌atcc22019，热带念珠菌atcc1369和克柔念珠菌atcc6258以腹腔注射免疫balb/c小鼠。免疫3周后采集小鼠血清，以本发明建立的双抗原夹心elisa法检测，仅可在白色念珠菌sc5314感染的小鼠血清中检测到抗caeno1抗体，其余四种念珠菌感染的小鼠血清中未检测到任何数值。可推测本方法可特异性的检测白色念珠菌感染患者血清。
[0106]
(五)小鼠白色念珠菌感染模型血清抗caeno1抗体的动态变化
[0107]
用酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(ypd)培养的白色念珠菌sc5314腹腔注射balb/c小鼠，剂量为每只小鼠注射1
×
106cfu，对照组注射生理盐水0.5ml。记录注射时间，从注射日开始计算，在不同的时间点采集小鼠的尾部末梢血液并分离血清，检测抗体含量并记录结果。检测结果如图8所示，本发明可以敏感的检测白色念珠菌感染小鼠血清中抗caeno1的总抗体。