一种纳米粒子、生物传感器及其制备方法、应用与流程

1.本技术涉及一种纳米粒子、生物传感器及其制备方法、应用，属于传感器领域。


背景技术：

2.磁性是物质本身具有的特性，这种性质是由于物质内部的电子绕原子核轨道运动和绕本身的自旋运动而产生的。其中应用比较广泛的就是四氧化三铁纳米粒子。由于磁性四氧化三铁纳米粒子化学性质稳定以及良好的磁性能，自发现以来广泛应用于催化、磁流体、磁共振成像以及环境科学等领域。近年来，fe3o4纳米粒子因其分离和传递方便、比表面积大、合成和表面修饰可控、生物相容性好、可回收利用等优点，在医用材料、生物分析和生物技术中的可视化和治疗剂以及药物传递系统等方面引起了研究者的广泛关注。四氧化三铁的制备方法有很多，主要有共沉淀发、热解法、微乳液法和水热法。其中共沉淀法是一种比较简单且可以合成形貌可控的纳米粒子的常用方法。
3.多巴胺是一种重要的神经递质生物分子，当在体内的多巴胺含量异常时可能引起帕金森病、心脏病和精神分裂症等，因此，在临床诊断中需要一种准确快速的多巴胺检测方法是至关重要的。目前报道的多巴胺的检测方法主要有色谱分析法、荧光法、高效液相色谱法、化学发光法。但是这些方法都具有操作繁琐、灵敏度低等缺陷。电化学方法因其高的灵敏度受到广泛的关注。如cheng等人开发了一种基于金纳米粒子/多壁碳纳米管杂化的电化学传感平台检测多巴胺，传感器的线性范围为50nm～2.7mm，检测限为15nm而且该传感器可以去除抗坏血酸和尿酸的干扰。


技术实现要素：

4.多巴胺是大脑生理学中的一种神经递质，它的检测对于研究大脑活动和理解大脑功能至关重要。然而，由于缺乏可重复在线检测-再生循环的平台，用于监测生理和病理过程中多巴胺的再生生物传感器仍然具有挑战性。为此，我们研制了一种结合体内监测系统的可再生磁控场效应晶体管(fet)传感器。
5.金纳米粒子具有良好的导电性和生物亲和性常用在生物传感器中用来提高生物传感器的性能，而且很容易通过巯基偶联半胱氨酸进一步来活化，使其具有更好的生物相容性。本章合成四氧化三铁@金@半胱氨酸(fe3o4@au@cys)溶液,基于酪氨酸酶可以催化多巴胺，因此在四氧化三铁@金@半胱氨酸(fe3o4@au@cys)溶液中加入酪氨酸酶将其固定在制作好的叉指电极上实现多巴胺的检测。由于四氧化三铁纳米粒子具有良好的磁响应，当四氧化三铁@金@半胱氨酸和酪氨酸酶混合溶液在磁场中固定在叉指电极的过程中会使溶液的分布达到局部的富集，这样就可以实现提高传感器灵敏度。
6.根据本技术的第一方面，提供一种纳米粒子。
7.一种纳米粒子，所述纳米粒子包括fe3o4纳米颗粒、au纳米颗粒和半胱氨酸；
8.所述au纳米颗粒包裹在fe3o4纳米颗粒的表面。
9.所述半胱氨酸连接在au纳米颗粒上。
10.所述fe3o4纳米颗粒、au纳米颗粒和巯基化合物的摩尔比为(1～2):(0.5～1):(0.1～0.2)优选1:0.5:0.1；
11.可选地，所述纳米粒子的大小为80nm～1000nm。
12.可选地，所述纳米粒子的大小独立地选自80nm、90nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、1000nm中的任意值或任意两者之间的范围值。
13.根据本技术的第二方面，提供一种生物传感器。
14.一种生物传感器，所述生物传感器包括叉指电极、纳米粒子、酪氨酸酶和成膜剂；
15.所述纳米粒子、酪氨酸酶通过成膜剂覆盖在叉指电极表面；
16.所述纳米粒子成线型排列；优选直线排列；
17.所述纳米粒子选自上述所述的纳米粒子。
18.可选地，所述成膜剂包括壳聚糖。
19.所述纳米粒子和酪氨酸酶的质量比是50～10:1，优选为10:1；
20.所述纳米粒子包括fe3o4纳米颗粒、au纳米颗粒和巯基化合物；
21.所述fe3o4纳米颗粒、au纳米颗粒和巯基化合物的摩尔比为(1～2):(0.5～1):(0.1～0.2)优选1:0.5:0.1。
22.可选地，通过永磁体控制所述的生物传感器或原位检测芯片的灵敏度和检测限。
23.可选地，通过永磁体的添加和去除来实现所述的生物传感器或原位检测芯片的再生。
24.根据本技术的第三方面，提供一种生物传感器的制备方法。
25.一种生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
26.(1)获取叉指电极；
27.(2)将含有纳米粒子、酪氨酸酶和成膜剂的混合溶液置于所述叉指电极的表面；并将叉指电极置于磁场中，干燥处理后，获得所述生物传感器。优选，将在叉指电极下方放置条形磁铁。
28.可选地，所述置于磁场是将叉指电极靠近磁铁；
29.可选地，叉指电极与磁铁的距离50μm～200μm。所述距离独立地选自50μm、100μm、150μm 200μm中的任意值或任意两者之间的范围值。
30.根据本技术的第四方面，提供一种生物传感器的应用。
31.上述所述的生物传感器、上述所述的制备方法制备得到的生物传感器在脑科学、检测多巴胺中的应用。
32.刺激了对再生传感器设备的强烈需求，以专门检测、量化和监测各种生物和化学物种。场效应晶体管(fet)作为最有前途的平台之一，为这一需求提供了量身定制的解决方案。
33.本技术能产生的有益效果包括：在本技术的生物传感器中，镀金的磁性纳米颗粒(fe3o4@aunps)充当多巴胺的再生识别单元。只需简单地去除永磁体，酪氨酸酶就能催化生物传感器界面上的多巴胺，从而实现生物传感器的再生。结果表明，该fet生物传感器不仅具有较高的灵敏度和选择性，而且经过15次再生处理后具有良好的稳定性。该生物传感器能够检测多巴胺，其浓度为1μmol l-1
～120μmol l-1
，检测下限为3.3nmol l-1
。最后，该平台已成功应用于大脑皮层全局神经元下的鱼脑多巴胺分析。该fet生物传感器是第一个通过
永磁体在线远程控制灵敏度和检测限的生物传感器。它为可重复使用、廉价和大规模生产打开了大门。
附图说明
34.图1中，
35.a图：实施例1中制备的fe3o4的tem图像；
36.b图：实施例1中制备的fe3o4@au的tem图像；
37.c图：实施例1中制备的fe3o4@au的tem放大图像；
38.d图：实施例1中制备的fe3o4@au@cys纳米粒子的元素分析图谱。
39.图2酪氨酸酶催化多巴胺的示意图。
40.图3磁性控制磁性纳米粒子从分散到线形。
41.a图：未加磁场的磁性纳米粒子，
42.b图：添加磁场的磁性纳米粒子。
43.图4a：fe3o4@au+tyr(有磁)和fe3o4@au+tyr(无磁)检测dopa时间-电流曲线；
44.图4b：fe3o4@au+tyr(有磁)和fe3o4@au+tyr(无磁)检测dopa稳态电流和dopa浓度校准曲线；
45.图4c：fe3o4@au+tyr(有磁)检测dopa及其干扰物响应信号；
46.图4d：fe3o4@au+tyr(有磁)稳定性测试检测dopa28天的电信号。
47.图5a：fe3o4@au+tyr(有磁)、fe3o4@au+tyr(无磁)、fe3o4+tyr(有磁)、fe3o4+tyr(无磁)、tyr(有磁)、tyr(无磁)检测dopa时间-电流曲线；
48.图5b图：100到250μm磁铁不同高度的fe3o4@au+tyr(有磁)检测dopa；
49.图5c：fe3o4@au+tyr(有磁)重复稳定性测试。
具体实施方式
50.下面结合实施例详述本技术，但本技术并不局限于这些实施例。
51.如无特别说明，本技术的实施例中的原料和催化剂均通过商业途径购买，如无特别说明，测试方法均采用常规方法，仪器设置均采用厂家推荐的设置。
52.六水合氯化铁(fecl3.6h2o)、四水合氯化亚铁(fecl2.4h2o)(分析纯)和多巴胺(dopa)均来自国药集团；氨水(gr,25-28％)、柠檬酸钠，二水合物(ar，99％)和l-半胱氨酸(99％)购自上海麦克林有限公司；从阿拉丁购买了0.1mol l-1pbs溶液、壳聚糖和氯金酸。实验中所用的去离子水是电阻率为18.2mω使用水。
53.表2-1实验所需仪器的基本信息
65.为了验证已经成功的合成了四氧化三铁颗粒，利用tem来表征实施例1中(1)制备的四氧化三铁的形态，如图1中的a图所示，四氧化三铁的tem图像表明它是直径约5纳米的球，而且粒径比较均一，但是局部也会有一定的团聚。
66.表征实施例1中(2)制备的fe3o4@au
67.当在四氧化三铁外面包裹一层金纳米粒子时，四氧化三铁表面明显出现了金簇，而且粒径也增大到约20纳米，如图1中的b图所示
68.测试例2检测多巴胺原理
69.fe3o4/叉指电极生物传感器之所以可以检测多巴胺，主要是酪氨酸酶(tyr)对多巴胺具有催化作用。如图5所示，多巴胺在酪氨酸酶的催化作用下可以形成多巴醌，在氧化的过程中，多巴胺的羟基(-oh)形成碳氧双键(c＝o)释放氢离子，这就导致溶液中氢离子增多。当在电极上施加电压时，氢离子就会在电极之间传递形成电流。也就是说，当加入多巴胺时，fe3o4/叉指电极生物传感器就会有电学响应。
70.测试例3 fe3o4/叉指电极生物传感器检测多巴胺(dopa)
71.首先，为了观察固定在叉指电极表面的fe3o4@au+tyr溶液在有无磁场作用下的形貌区别，通过将在有磁场作用修饰fe3o4@au+tyr溶液的叉指电极和没有磁场作用修饰fe3o4@au+tyr溶液的叉指电极做sem对照。如图3所示，当没有磁场作用下，电极的叉指区虽然有纳米粒子，但是分布没有规则，而当在磁场下修饰时，磁性纳米粒子在磁场的作用下形成了一条直线。这就说明在磁场的作用下含有磁性纳米粒子的溶液可以规则分布，不仅可以提高局部的浓度而且在叉指电极之间形成了一条磁纳米线。
72.图3的sem图像表征了在磁场的作用下fe3o4@au+tyr溶液会在叉指电极上形成一条致密的直线。现在基于酪氨酸酶可以催化氧化多巴胺来检测在磁场作用下fe3o4@au+tyr生物传感器的电化学响应变化。图4分别就壳聚糖/fe3o4@au+tyr(无磁)和壳聚糖/fe3o4@au+tyr(有磁)对照用计时电流法来检测多巴胺。图4是检测多巴胺(10μmol l-1)的时间-电流曲线。在测试过程中，每50s向5ml(50mmol l-1)pbs溶液中滴加10μl的多巴胺溶液。每组传感器对多巴胺都具有明显的电学响应，响应时间都在5s左右，这表明酪氨酸酶可以快速催化氧化多巴胺。分别对比壳聚糖/fe3o4@au+tyr(无磁)和壳聚糖/fe3o4@au+tyr(有磁)时间-电流曲线可以看出，每一组在加入磁场之后电流的阶跃变化明显增大。由于电极本身之间存在差异，所以每条时间-电流曲线的初始电流存在这差异。将每组时间-电流曲线的每次阶跃电流值作线性拟合直线，拟合直线的斜率也就是生物传感器的信号灵敏度。这就说明在磁场的作用下可以提高传感器的信号灵敏度，这是因为四氧化三铁磁性纳米粒子在磁场的作用下不仅使酪氨酸酶局部的浓度提高，而且在叉指电极沟道之间形成了一条致密的曲线，提高了电子的传输能力，提高了导电率，所以在磁场的作用下可以提高生物传感器的信号灵敏度。
73.这说明磁场的加入确实可以提高信号灵敏度，这是因为在磁场的作用下，四氧化三铁受到的磁场力作用，会在沿着磁铁的方向上形成一条直线，这条直线相当于给叉指电极之间的电子形成了一条通道，而且会提高这条线上的修饰的溶液浓度。接着直接比较壳聚糖/tyr和壳聚糖/fe3o4@au+tyr之间的信号灵敏度。在壳聚糖/tyr中加入与fe3o4@au溶液相同体积的去离子水来保证酪氨酸酶的浓度相同。同样地，检测同浓度的多巴胺，相比于纯的酪氨酸酶，在加入fe3o4@au粒子之后，并且引入非常容易实现的磁场之后传感器的信号灵
敏度有了2个数量级的提高，这相比于其他提高生物传感器灵敏度的方法来说，这是一种非常简单易行的措施。现在已知在加入磁场之后可以明显提高生物传感器的灵敏度，在接下来的工作中将优化磁场的的位置。
74.实施例4磁场高度的优化
75.本发明通过实验发现在条形磁铁的棱边上磁性纳米粒子形成的直线最好。本发明还发现距离棱边的距离不同也会对形成的直线有所影响，所以在固定磁铁的过程中优选选择条形磁铁的棱边放置叉指电极。在电学的测试中，为了尽量使每次的变化高度相同，使用了普通a4纸，通过每次增加纸张的层数来控制距离磁铁的距离，用游标卡尺测量的得纸张厚度为50μm。然后就100μm、150μm、200μm、250μm四个距离分别进行了时间-电流测量。而且从图中可以看出，电流随多巴胺浓度在10μm-50μm之间具有很好的线性关系。为了更直观的看出信号灵敏度随叉指电极距离磁铁高度的变化关系，做出了相同电压下不同叉指电极距磁铁高度的电流随多巴胺浓度的变化曲线，如图5所示，经5次、10次、15次循环后，用磁铁控制en-fets生物传感器的回收次数。
76.利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。