一种用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液及其制备方法

1.本发明属于病理检材处理技术领域，涉及病理检材处理液，具体涉及一种用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液、其制备方法及应用。


背景技术：

2.远处转移是恶性肿瘤的重要生物学特征之一、也是临床进行tnm分期的重要依据，其方式有四种：
①
直接蔓延到邻近部位，最常见的有侵犯内脏器官周围的神经组织，如肺尖部肿瘤侵犯臂丛神经出现肩臂疼痛；
②
血行转移：癌细胞侵入血管随血流转移至远隔部位如肺、肝、骨、脑等处，形成继发性肿瘤；
③
淋巴转移：原发部位的癌细胞随淋巴引流，由近及远转移到各级淋巴结，也可发生跳跃式转移；
④
种植：癌细胞脱落后种植到胸膜或腹膜脂肪组织上。原发病灶及其周围一定范围内正常组织的r0完整切除和清扫引流区域淋巴结的根治性手术是临床重要的手术方式，而对术后送检至病理科的手术切除标本的规范检材(尤其是对有无远处转移的判断)是保障病理报告质量、推测患者预后及指导临床后续治疗的重要步骤之一。
3.对手术标本进行充分的病理检材能最大程度提高导致癌症相关不良事件的危险因素(如神经侵犯、血管内癌栓、淋巴结转移、腹膜转移癌灶)的检出率，对于患者的远期生存率的预判也有重要影响。有研究证实，胰头导管腺癌超过半数以上存在淋巴结转移和神经侵犯，临床主张广泛的腹膜后软组织切除和扩大淋巴结清扫范围以争取较好的预后；早期微血管侵犯和中晚期门静脉癌栓的形成是影响肝细胞癌术后预后不佳的最重要因素；而基于淋巴结转移数目和解剖位置的淋巴结转移分期(n分期)是最常见的胃肠道和乳腺等肿瘤的预后评估和诊断分期方式，许多特殊类型的淋巴结转移也可通过充分检材被确认，如癌结节、淋巴结微转移、孤立肿瘤细胞及跳跃性转移等，从而降低淋巴结假阴性的发生率；结直肠癌伴腹膜转移根治切除患者较伴同时性肝转移根治切除组预后好，故而局限的结直肠癌伴腹膜转移通过手术可能得到根治。综上，充分的病理检材对确定恶性肿瘤分期、评估预后以及制定个体化治疗方案具有重要意义。
4.临床恶性肿瘤根治标本的取材是病理工作中的重点也是难点，上述提到的需重点充分取材并在显微镜下仔细观察的对象(神经、血管、淋巴结、癌结节等)均埋藏在脂肪组织中，病理医师常采用间隔一定距离分页状刀切并手摸的方法，根据手感经验判断包裹于脂肪组织中的实质组织并取材，存在很大的随机性和人为操作因素，尤其是脂肪组织过于丰富而实质组织的体积小于直径0.5cm的时候，这种情况下常常会漏检微小转移癌灶的可能。目前的解决方案只能耐心寻找，一个根治标本可能需要花费数小时才能把重点观察对象充分取材，突增时间和人力成本。因而在病理科实际工作中亟需一种对各种体积大小的脂肪组织进行高效快速肉眼可视化处理、显露出其内包含的神经血管淋巴结等实质组织的并能充分固定的方法。
5.通过文献检索发现，近年来较多的研究集中在应用脂肪溶解液处理乳腺癌根治标
本以提高腋窝淋巴结的检出率，但并未提及对其他重要实质组织(神经、血管、淋巴结、癌结节等)的影响，并且针对胃肠道、胰、肝、肾等脏器在内的临床常见恶性肿瘤根治术后大标本使用的肉眼可视化处理方法未见报道。


技术实现要素：

6.本发明依托上述研究进行，针对现有手术大体标本脂肪组织内检查微小实质组织所存在的困难以及目前脂肪溶解液的处理缺陷，提供了一种全新的肉眼可视化处理的脱脂液，该脱脂液具有透明、除脂、固定脂肪组织内多种实质组织(神经、血管、淋巴结、癌结节、器官残端等)的多重功能，在透明去除脂肪组织的同时，能有效保留各类实质组织的形态结构、免疫组化抗原表位及原位杂交的核酸序列。
7.为了实现该目的，本发明采用的技术方案如下：
8.本发明的第一方面，提供一种用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，由透化剂、促渗剂、除脂剂、增溶剂四种组分构成，四种组分的重量份组成如下：透化剂为五元或六元氮杂环酮类化合物，其n位取代基为甲基、乙基或丁基，重量份2-20％；促渗剂为c1-c3低级醇，重量份30％-55％；除脂剂为c6-c8环烷类，重量份40％-65％；增溶剂为甜菜碱型两性离子表面活性剂，重量份0.5％-3％。
9.优选的，透化剂5-15重量份、促渗剂40-55重量份、除脂剂45-65重量份和增溶剂0.3-2重量份。
10.进一步优选，四种组分的具体试剂选择如下：
11.透化剂为n-甲基吡咯烷酮、n-甲基-3-吡咯烷酮、n-乙基吡咯烷酮、n-乙基-3-吡咯烷酮、n-丁基吡咯烷酮、己内酰胺、n-甲基己内酰胺中的一种或几种的混合物；
12.促渗剂为甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇中的一种或几种的混合物；
13.除脂剂为环己烷、甲基环己烷、乙基环己烷中的一种或几种的混合物；
14.增溶剂为十二烷基二甲基甜菜碱、十二烷基磺丙基甜菜碱、十四烷基二甲甜菜碱、十四烷基磺丙基甜菜碱、十八烷基二甲基甜菜碱、十八烷基二甲基磺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基甜菜碱中的一种或几种的混合物。
15.进一步优选，脱脂液的具体组成如下述(1)～(5)任一项所述：
16.(1)n-甲基吡咯烷酮或n-甲基-3-吡咯烷酮9.5重量份、乙醇45重量份、环己烷45重量份、十二烷基二甲基甜菜碱或十二烷基磺丙基甜菜碱0.5重量份；
17.(2)n-乙基吡咯烷酮或n-乙基-3-吡咯烷酮12.5重量份、甲醇40重量份、甲基环己烷47重量份、十四烷基二甲甜菜碱或十四烷基磺丙基甜菜碱0.5重量份；
18.(3)n-丁基吡咯烷酮10重量份、丙醇42重量份、乙基环己烷47重量份、十八烷基二甲基甜菜碱1重量份；
19.(4)己内酰胺8.5重量份、甲醇45重量份、环己烷46重量份、十八烷基二甲基磺丙基甜菜碱0.5重量份；
20.(5)n-甲基己内酰胺9.5重量份、异丙醇45重量份、环己烷45重量份、椰油酰胺丙基甜菜碱0.5重量份。
21.本发明的第二方面，提供了上述脱脂液的制备方法，包括如下步骤：按照选定的重量份称取透化剂、促渗剂、除脂剂和增溶剂，在室温至45℃进行调和混匀即得。
22.本发明的第三方面，提供了上述脱脂液在手术大体标本或活检脂肪组织透明化处理中的用途。
23.具体的，该用途为对手术大体标本或活检组织进行脱脂处理，使其内部的非脂肪组织肉眼可视化，该非脂肪组织包括神经、血管、淋巴结、癌结节、器官残端等实质组织。
24.本发明的第四方面，提供了采用上述脱脂液进行手术病理检材肉眼可视化处理的方法：将手术大体标本或活检组织按重量体积比1:3-1:100于室温下放于所述脱脂液中，浸泡脱脂4小时以上，期间可换液重复浸泡。后续可肉眼下对病理检材进行特定部位的采样获取，用于病理制片。
25.通过实验验证，本发明的脱脂液可同时用于处理手术大体标本或活检组织，具有透明、除脂、固定标本的作用，与目前普遍使用的甲醛处理液对比，能显著提高样本非脂肪组织检出率且不影响后续形态学观察、免疫组化及原位杂交效果，是一种理想的可用于不同体积大小脂肪组织病理检材的配方试剂。
26.本发明的有益保障及效果：
27.本发明脱脂液在应用于恶性肿瘤常规根治性手术大体标本或活检组织时，在有效透明不同大小脂肪组织的同时，还兼具一定除脂的功能，并且保证了其内实质组织的充分固定。
28.因本脱脂液具有透明脂肪组织、使其肉眼可视化的功能，提高了隐藏在内的实质组织(神经、血管、淋巴结、癌结节、器官残端等)的检出率，进而精准提供恶性肿瘤远处转移的证据(神经侵犯、血管内癌栓、淋巴结转移、癌结节等)，节省了病理医生在检材工作上耗费的时间、大大提高劳动效率，节约人力成本，尤其是在目前病理医生极为短缺的情况下具有重要的现实意义。
29.经实验证实，经本脱脂液处理过的手术大体标本或活检组织在后续的病理制片中，所有获取的实质组织均保留其原有的组织结构，不影响形态学观察、免疫组化及原位杂交效果。
30.因此，本发明解决了现有病理检材中对于脂肪组织内(包括但不限于网膜、胃周、肠周、胰周、腋窝、肝门部、肾门部脂肪组织等)实质组织如神经、血管、淋巴结、癌结节、器官残端等的精确获取问题。本发明脱脂液商品化后在病理科检材中推广使用，可产生一定的经济价值，且其取材及制备过程简单，既可实验室自行配置，又利于工业化规模扩大生产。
附图说明
31.图1为肉眼对比观察对照组及试验组(实施例1、5、9、10、11)中脂肪组织的透明度；
32.图2为用ls116透光率仪测定对照组及试验组(实施例1～11)中不同脱脂液处理后脂肪组织的透光率；
33.图3为对照组及试验组(实施例1、5、9、10、11)肝门部清扫脂肪组织内神经组织石蜡切片和免疫组化切片镜下病理图对比；
34.图4为对照组及试验组(实施例1、5、9、10、11)肝门部清扫脂肪组织内血管组织石蜡切片和免疫组化切片镜下病理图对比；
35.图5为对照组及试验组(实施例1)肝门部清扫脂肪组织内淋巴结石蜡切片、免疫组化和原位杂交切片镜下病理图对比；
36.图6为对照组及试验组(实施例1、5、9、10、11)肝门部清扫脂肪组织内癌结节石蜡切片和免疫组化切片镜下病理图对比；
37.图7为对照组及试验组(实施例1、5、9、10、11)肝门部清扫脂肪组织内器官残端(部分胰腺组织)石蜡切片和免疫组化切片镜下病理图对比；
38.图8为对照组及试验组(实施例1、5、9、10、11)腹腔结节石蜡切片和免疫组化切片镜下病理图对比。
具体实施方式
39.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
40.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件进行。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
41.一、用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液配方，参见实施例1～11：
42.实施例1
43.本实施的用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，按总重量为100％计，包括：n-甲基吡咯烷酮9.5％、乙醇45％、环己烷45％、十二烷基二甲基甜菜碱0.5％。
44.实施例2
45.本实施的用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，按总重量为100％计，包括：n-甲基吡咯烷酮9.5％、乙醇45％、环己烷45％、十二烷基磺丙基甜菜碱0.5％。
46.实施例3
47.本实施的用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，按总重量为100％计，包括：n-甲基-3-吡咯烷酮9.5％、乙醇45％、环己烷45％、十二烷基二甲基甜菜碱0.5％。
48.实施例4
49.本实施的用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，按总重量为100％计，包括：n-甲基-3-吡咯烷酮9.5％、乙醇45％、环己烷45％、十二烷基磺丙基甜菜碱0.5％。
50.实施例5
51.本实施的用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，按总重量为100％计，包括：n-乙基吡咯烷酮12.5％、甲醇40％、甲基环己烷47％、十四烷基二甲甜菜碱0.5％。
52.实施例6
53.本实施的用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，按总重量为100％计，包括：n-乙基吡咯烷酮12.5％、甲醇40％、甲基环己烷47％、十四烷基磺丙基甜菜碱0.5％。
54.实施例7
55.本实施的用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，按总重量为100％计，包括：n-乙基-3-吡咯烷酮12.5％、甲醇40％、甲基环己烷47％、十四烷基二甲甜菜碱0.5％。
56.实施例8
57.本实施的用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，按总重量为100％计，包
括：n-乙基-3-吡咯烷酮12.5％、甲醇40％、甲基环己烷47％、十四烷基磺丙基甜菜碱0.5％。
58.实施例9
59.本实施的用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，按总重量为100％计，包括：n-丁基吡咯烷酮10％、丙醇42％、乙基环己烷47％、十八烷基二甲基甜菜碱1％。
60.实施例10
61.本实施的用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，按总重量为100％计，包括：己内酰胺8.5％、甲醇45％、环己烷46％、十八烷基二甲基磺丙基甜菜碱0.5％。
62.实施例11
63.本实施的用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，按总重量为100％计，包括：n-甲基己内酰胺9.5％、异丙醇45％、环己烷45％、椰油酰胺丙基甜菜碱0.5％。
64.上述各实施例中的脱脂液制备方法相同，均采用如下制备方法：将上述透化剂、促渗剂、除脂剂、增溶剂在室温至45℃下调合形成用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液。
65.对上述配方分析，按透化剂进行分类：实施例1～4均属于n-甲基吡咯烷酮体系；实施例5～8均属于n-乙基吡咯烷酮体系；实施例9属于n-丁基吡咯烷酮体系；实施例10属于己内酰胺体系；实施例11属于己内酰胺烷基取代体系。
66.同一种体系中透化剂性能类似，下分别在上述五个体系中各选择一种脱脂液进行实验验证，重点选取实施例1、实施例5、实施例9、实施例10以及实施例11中所示的脱脂液作为代表进行后续实验。
67.二、效果验证
68.以下通过实验例更好地说明本发明脱脂液对脂肪组织透明、除脂、固定作用。与未进行脱脂液处理的脂肪组织相比，固定防腐效果相同，但脂肪组织的透光率和透明度大大增强，更有利于其内实质组织的暴露和检材获取，且能达到有效保留待检组织的形态结构、免疫组化抗原表位及原位杂交核酸序列的显著技术效果。
69.1、实验材料及试剂
70.实验材料：肝门部清扫脂肪组织(手术大体标本)或腹腔结节(活检组织)。
71.实验试剂：试验组的脱脂液为按照上述实施例制备的脱脂液，对照组为传统4％中性甲醛固定液。
72.2、实验方法及结果
73.2.1实验方法
74.将肝门部清扫脂肪组织或腹腔脂肪按重量体积比1:3-1:100于室温条件下分别浸泡在试验组和对照组的溶液中，时间为6小时，必要时换液重复浸泡。后续肉眼下对病理检材进行特定部位的采样获取，用于常规病理制片、免疫组化染色和原位杂交。
75.2.2透明度及透光率对比
76.肉眼对比观察对照组和试验组(实施例1、5、9、10、11)中脂肪组织的透明度。采用ls116透光率仪测定对照组和试验组(实施例1～11)透光率，透光率的测定方法如下：
77.对照组透明度测定：
78.(1)取固定后组织，摊平后放于4℃冰箱12小时。脂肪组织硬化后，切成厚度约5mm的4cm
×
4cm组织块；
79.(2)组织块铺于石英大面透光比色皿(5cm
×
5cm
×
1cm)内，加入50％乙醇水溶液；
80.(3)采用ls116透光率仪测定透光率(％)，此为对照组脂肪组织的透光率(％)。
81.处理后组织的透明度测定：
82.(1)取固定后组织，摊平后放于4℃冰箱12小时。脂肪组织硬化后，切成厚度约5mm的4cm
×
4cm组织块；
83.(2)组织块浸泡于实施例1～11中制备的脱脂液，室温浸泡6小时；
84.(3)取出组织块，铺于石英大面透光比色皿(5cm
×
5cm
×
1cm)内，加入50％乙醇水溶液；
85.(4)采用ls116透光率仪测定透光率(％)，此为试验组脂肪组织的透光率(％)。
86.肉眼对比观察对照组和试验组(实施例1、5、9、10、11)中脂肪组织的透明度结果参见图1；透光率实验比对结果如表1及图2所示。结果显示，在相同拍照条件下，经本发明实施例1、5、9、10、11脱脂液处理后的样本透明度显著优于对照组(图1)；透光率测试结果显示，本发明脱脂液处理后样本的透明度为对照组样本测试数据的8～10倍，差异显著(表1及图2)。
87.表1试验组与对照组透光率对比
88.组别透光率(％)op_sd对照组3.20.43实施例131.53.26实施例230.23.15实施例329.22.47实施例428.62.39实施例526.72.68实施例625.93.89实施例727.74.36实施例828.43.95实施例924.43.41实施例1029.63.35实施例1125.33.60
89.2.3免疫组化及原位杂交对比
90.将试验组和对照组的脂肪组织从脱脂液或固定液中取出，将其内存在的实质组织一一检材并放入包埋盒中，后续对上述实质组织的脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、免疫组化及原位杂交的操作均按规范化标准化流程进行。结果如下：
91.2.3.1对肝门部清扫脂肪组织内神经组织的形态学观察和免疫组化效果
92.将试验组(实施例1、5、9、10、11)制作的肝门部清扫脂肪组织内神经组织石蜡切片/免疫组化切片和对照组制作的肝门部清扫脂肪组织内神经组织石蜡切片/免疫组化切片比较，结果参见图3，对比发现，试验组与对照组的形态学观察和免疫组化效果基本相同。
93.2.3.2对肝门部清扫脂肪组织内血管组织的形态学观察和免疫组化效果
94.将试验组(实施例1、5、9、10、11)制作的肝门部清扫脂肪组织内血管组织石蜡切片/免疫组化切片和对照组制作的肝门部清扫脂肪组织内血管组织石蜡切片/免疫组化切
片比较，结果参见图4，对比发现，试验组与对照组的形态学观察和免疫组化效果基本相同。
95.2.3.3对肝门部清扫脂肪组织内淋巴结的形态学观察和免疫组化效果
96.将试验组(实施例1)制作的肝门部清扫脂肪组织内淋巴结石蜡切片/免疫组化切片/原位杂交和对照组制作的肝门部清扫脂肪组织内淋巴结石蜡切片/免疫组化切片/原位杂交切片比较，结果参见图5，对比发现，试验组与对照组的形态学观察、免疫组化及原位杂交效果基本相同。
97.2.3.4对肝门部清扫脂肪组织内癌结节的形态学观察和免疫组化效果
98.将试验组(实施例1、5、9、10、11)制作的肝门部清扫脂肪组织内癌结节石蜡切片/免疫组化切片和对照组制作的肝门部清扫脂肪组织内癌结节石蜡切片/免疫组化切片进行比较，结果参见图6，对比发现，试验组与对照组的形态学观察和免疫组化效果基本相同。
99.2.3.5对肝门部清扫脂肪组织内器官残端的形态学观察和免疫组化效果(部分胰腺组织)
100.将试验组(实施例1、5、9、10、11)制作的肝门部清扫脂肪组织内器官残端石蜡切片/免疫组化切片和对照组制作的肝门部清扫脂肪组织内器官残端石蜡切片/免疫组化切片进行比较，结果参见图7，对比发现，试验组与对照组的形态学观察和免疫组化效果基本相同。
101.2.3.6对腹腔结节的形态学观察和免疫组化效果
102.将试验组(实施例1、5、9、10、11)制作的腹腔结节石蜡切片/免疫组化切片和对照组制作的腹腔结节石蜡切片/免疫组化切片进行比较，结果参见图8，对比发现，试验组与对照组的形态学观察和免疫组化效果基本相同。
103.2.3.7结论
104.本发明的用于对手术大体标本进行透化处理的脱脂液，处理手术大体标本或活检组织，具有透明、除脂、固定标本的作用，且不影响后续形态学观察、免疫组化及原位杂交效果，是一种理想的可用于不同体积大小脂肪组织病理检材的配方试剂。
105.以上已对本发明的实例进行了具体说明，但本发明并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本技术权利要求所限定的范围内。