表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测口蹄疫病毒方法

1.本发明涉及口蹄疫病毒检测技术领域，具体为一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测口蹄疫病毒方法。


背景技术：

2.口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus,fm dv)属于小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属，是目前所知病毒中最细微的一级，其导致的口蹄疫是世界动物卫生组织(oie)原规定的动物a类传染病，其主要危害对象是猪、羊、牛等偶蹄动物，发病率可达100％，并容易形成大范围流行，危害严重，是进出境检疫和猪场监控必检项目之一。
3.口蹄疫病毒共有o型、a型、c型、asia1型、sat1、sat2和sat3等7个血清型，而每个血清型中又包括许多的亚型，且各个血清型之间无交叉保护。现有的口蹄疫病毒检测方法主要有病毒分离鉴定、荧光定量pcr、rt-pcr、反转录环介导等温扩增技术(rt-lamp)、elisa、病毒中和试验(vnt)等方法。其中，elisa和病毒中和试验(vnt)特异性不高、敏感性低，病毒分离鉴定操作繁琐，实验条件和技术水平要求高，实践应用不便；虽然荧光定量pcr、rt-pcr、反转录环介导等温扩增技术(rt-lamp)等检测方法较上述方法快速也准确许多，但其需要复杂的仪器设备，设备成本高，不适合基层和现场检测。
4.表面增强拉曼散射(surface enhanced raman scatterimg，sers)是一种振动光谱技术，该技术灵敏度高、特异性强；免疫层析技术是一种结合免疫技术和色谱层析技术分析方法，该方法具有特异性、操作简单、快速等特点；而且，现也有将sers与免疫层析技术结合用于病原的检测相关的研究。因此，如何将sers与免疫层析技术结合用于口蹄疫病毒检测工作中，如何建立一种高灵敏度sers-免疫层析检测新技术，以快速、准确且定量检测口蹄疫病毒是本技术领域亟需解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明意在提供一种表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测口蹄疫病毒方法，以解决现有技术检测口蹄疫病毒的设备复杂、成本高，检测所需的条件苛刻，检测费力、费时、危险性高、成功率低，检测的耗时长，而且需要经特殊培训的专业技术人员才能检测的问题。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测口蹄疫病毒方法，包括以下步骤：
8.s1、对口蹄疫病毒抗体进行分组：
9.将获得的一对口蹄疫病毒抗体所包含的口蹄疫病毒标记抗体和口蹄疫病毒捕获抗体两个口蹄疫病毒抗体进行独立存放，备用；
10.s2、制备纳米材料：
11.选择s1中任一一个口蹄疫病毒抗体，利用柠檬酸钠还原法制备出20～35nm的au nps胶体金溶液；然后在au nps胶体金溶液中加入8～12mm的dtnb，搅拌反应3～6h；离心弃
上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到au/dtnb nps；取au/dtnb nps搅拌加热至煮沸，加入0.5～1.5％w/v的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5～1.5mm的硝酸银溶液，持续沸腾10～20min，得到au/dtnb@ag nps；向au/dtnb@ag nps中加入10mm的dtnb，搅拌反应3.5～5.5h，可得到au/dtnb@ag/dtnb nps纳米材料；
12.s3、制备sers标记检测探针：
13.向s2制备得到的au/dtnb@ag/dtnb nps纳米材料中加入edc和nhs进行活化，活化后离心弃上清，用1.5～2.8mm的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入口蹄疫病毒抗体孵育1.3～2.5h；加入bsa进行封闭，封闭完成后离心弃上清，加入用sers检测探针复溶液重悬，制备得到口蹄疫病毒特异性sers标记分子；对口蹄疫病毒特异性sers标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20～40℃恒温环境下干燥，可得到sers标记的口蹄疫病毒抗体检测探针；
14.s4、制备拉曼免疫层析试纸条：
15.将s1中剩余的另一个口蹄疫病毒抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在30～40℃恒温环境下干燥，其中口蹄疫病毒抗体检测探针作为检测线t，羊抗鼠抗体作为质控线c；将干燥后的硝酸纤维素膜与s3制备得到的含sers标记的口蹄疫病毒抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸和样品垫一同叠压，并安装在pvc底板上，再对其进行裁切作业即可得到成品试纸条，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内置于燥环境密封，备用；
16.s5、对试纸条进行性能检测：
17.采用国家标准品对s4所制备得到的试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行检测，并通过临床样品对s4所制备得到的试纸条的检测性能进行比对检测，实现对s4所制备得到的试纸条检测性能的全面评测。
18.进一步地，在s3中，加入edc和nhs活化au/dtnb@ag/dtnb nps纳米材料过程中，edc的使用量为2.0～3.5μl，nhs的使用量为2.0～3.5μl，加入bsa进行封闭过程中，bsa的使用量为90～120ml。
19.进一步地，在s4中，口蹄疫病毒抗体与羊抗鼠抗体进行稀释作业后，口蹄疫病毒抗体检测探针稀释后浓度为0.3～0.7mg/ml，羊抗鼠抗体稀释后浓度为0.3～0.7mg/ml。
20.进一步地，在s4中，得到的成品试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和pvc底板；裁切得到的试纸条宽度为2～4cm，长度为5～10cm。
21.进一步地，在s5中，对试纸条灵敏度的检测方法为：
22.使用试纸条检测口蹄疫病毒国家标准品，分别稀释口蹄疫病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10～15min观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号；
23.试纸条特异性的检测方法为：
24.使用试纸条检测口蹄疫病毒阴性国家标准品：大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μl逐滴加入至试纸条上；10～15min观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号；
25.试纸条重复性的检测方法为：
26.制备八批次口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条，分别稀释口蹄疫病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10～15min观察结果；拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号，从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10～15min观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号；
27.试纸条稳定性的检测方法为：
28.使用口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒阳性国家标准品：羊种布鲁氏菌1型阳性国家标准品p1、羊种布鲁氏菌2型阳性国家标准品p2、羊种布鲁氏菌3型阳性国家标准品p3、牛种布鲁氏菌1型阳性国家标准品p4、牛种布鲁氏菌2型阳性国家标准品p5，及使用口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒阴性国家标准品：柯萨奇病毒a16型n1、肠道病毒71型n2、大肠杆菌n3、多杀性巴氏杆菌n4、副伤寒甲型沙门氏菌n5、副伤寒乙型沙门氏菌n6、副伤寒丙型沙门氏菌n7、小肠结肠炎耶尔森氏菌n8、金黄色葡萄球菌n9，各取60μl逐滴加入至试纸条上；10～15min观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
29.进一步地，在s5中，临床样品的检测方法为：
30.通过对若干例口蹄疫病毒临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证，从而实现临床性检测的目的，其中检测时各取60μl逐滴加入至试纸条，并静置8～20min由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号。
31.进一步地，在s5中，在进行临床样品检测时，还需进行荧光定量pcr与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，包括对口蹄疫病毒基因进行多重序列比对，其中至少2对对引物探针用于基因序列扩增，提取口蹄疫病毒全基因组核酸，在以其作为模板进行rt-pcr进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，包括buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数；用在中检院购买的国家标准品进行数字pcr扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光pcr定量检测；在荧光pcr定量完成后，将荧光定量pcr检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比。
32.技术方案的原理及有益效果是：
33.1、本发明提供的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测口蹄疫病毒方法，通过合成双层拉曼分子标记的金核银壳纳米材料(au/dtnb@ag/dtnb nps)，在此材料上修饰口蹄疫病毒抗体，制备出sers检测探针；sers-免疫层析试纸条由吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及底板组成；结合垫上固定制备好的口蹄疫病毒sers检测探针，硝酸纤维素膜是固定检测线(rv抗体)与控制线(羊抗鼠igg)。当含有口蹄疫病毒的样品滴加在样品垫上后，溶液在结合垫上发生特异性识别与结合，在层析作用下经过结合垫到达控制线，与控制线上特异性rv抗体识别捕获，形成复合物，剩余的sers检测探针继续移动到达控制线，被羊抗鼠igg捕获，在控制线与检测线上的sers检测探针累积显现可视化的两条红色线条；当只有控制线显现红色线条时，证明该样品中没有口蹄疫病毒的存在，检测线出现红色线条代表该试纸条体系完整良好；
34.2、本发明将拉曼增强技术与免疫层析技术相结合，制备出口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，可大量用于临床快速诊断中，在临床快速诊断中具有极大的推广和应用价值；
35.3、本发明的方法操作简便、灵敏度高，15min内即可完成检测，在口蹄疫病毒早期感染检测中具有广阔的应用和推广前景。
附图说明
36.图1为本发明表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测口蹄疫病毒方法的流程图；
具体实施方式
37.下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明：
38.如图1所示，
39.表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测口蹄疫病毒方法，包括以下步骤：
40.s1，口蹄疫病毒抗体分组，将获得的一对口蹄疫病毒抗体所包含的口蹄疫病毒标记抗体组和口蹄疫病毒捕获抗体组口蹄疫病毒抗体进行独立存放备用；
41.s2，制备纳米材料，先选择s1步骤其中一个口蹄疫病毒抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出20nm的au nps胶体金溶液；然后在au nps胶体金溶液中加入8mm的dtnb，搅拌反应3h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到au/dtnb nps；最后取au/dtnb nps搅拌加热至煮沸，加入0.5％(w/v)的柠檬酸钠溶液，随后滴加0.5mm硝酸银溶液，持续沸腾10分钟，得到au/dtnb@ag nps，再向au/dtnb@ag nps中加入10mm的dtnb，搅拌反应3.5h，即可得到au/dtnb@ag/dtnb nps纳米材料；
42.s3，制备sers标记检测探针，首先向s2步骤制备的au/dtnb@ag/dtnb nps纳米材料中加入2.0μl的edc和2.0μl的nhs进行活化，活化后离心弃上清，然后用1.5mm的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入口蹄疫病毒抗体孵育1.3h；然后加入90ml的bsa进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用sers检测探针复溶液重悬，即制备得到口蹄疫病毒特异性sers标记分子，然后对口蹄疫病毒特异性sers标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在20℃恒温环境下干燥3h后，得到sers标记的口蹄疫病毒抗体检测探针；
43.s4，制备拉曼免疫层析试纸条，首先将s1步骤剩余的另一个口蹄疫病毒抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，稀释后口蹄疫病毒抗体检测探针的浓度为0.3mg/ml；羊抗鼠抗体的浓度为0.3mg/ml，然后分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在30℃恒温环境下干燥，其中口蹄疫病毒抗体检测探针作为检测线(t)，羊抗鼠抗体作为质控线(c)，然后将干燥后的硝酸纤维素膜与s3步骤制备的含sers标记的口蹄疫病毒抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在pvc底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及pvc底板，裁剪后的试纸条宽度为3cm，长度为6.5cm，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；
44.s5，试纸条性能检测，一方面采用国家标准品对s4步骤所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察；另一方面通过临床样品对s4步骤所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测；从而对s4步骤所制备检测试纸条检测性能进行全面评测；其中：
45.灵敏度检测的具体方法为：
46.使用试纸条检测口蹄疫病毒国家标准品，分别稀释口蹄疫病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10～15分钟观察结果，拉
曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
47.特异性检测的具体方法为：
48.使用试纸条检测口蹄疫病毒阴性国家标准品：水疱性口炎病毒、牛流行性腹泻/黏膜病毒、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μl逐滴加入至试纸条上；10分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号；
49.重复性检测的具体方法为：
50.制备八批次口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条，分别稀释口蹄疫病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号，从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号；
51.稳定性检测的具体方法为：
52.使用口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒阳性国家标准品：口蹄疫o型阳性国家标准品p1、口蹄疫a型阳性国家标准品p2、口蹄疫c型阳性国家标准品p3、口蹄疫asia1型阳性国家标准品p4、口蹄疫sat1型阳性国家标准品p5、口蹄疫sat2型阳性国家标准品p6和口蹄疫sat3型阳性国家标准品p7，及使用口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒阴性国家标准品：水疱性口炎病毒(n1)、牛流行性腹泻/黏膜病毒(n2)、大肠杆菌(n3)、多杀性巴氏杆菌(n4)、副伤寒甲型沙门氏菌(n5)、副伤寒乙型沙门氏菌(n6)、副伤寒丙型沙门氏菌(n7)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(n8)、金黄色葡萄球菌(n9)，各取60μl逐滴加入至试纸条上；10～15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号；
53.临床样品检测的具体方法为：
54.通过对若干例口蹄疫病毒临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μl逐滴加入至试纸条，并静置8分钟由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号；
55.在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量pcr与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，具体步骤为：
56.首先对口蹄疫病毒基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，提取口蹄疫病毒全基因组核酸，在以其作为模板进行pcr进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等；然后用在中检院购买的国家标准品进行数字pcr扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光pcr定量检测，并在荧光pcr定量完成后，将荧光定量pcr检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比即可。
57.实施例2
58.本发明实施例提供的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测口蹄疫病毒的方法，包括以下步骤：
59.s1，口蹄疫病毒抗体分组，将获得的一对口蹄疫病毒抗体所包含的口蹄疫病毒标记抗体组和口蹄疫病毒捕获抗体组口蹄疫病毒抗体进行独立存放备用；
60.s2，制备纳米材料，首先选择s1步骤其中一个口蹄疫病毒抗体，并利用柠檬酸钠还
原法制备出35nm的au nps胶体金溶液；然后在au nps胶体金溶液中加入12mm的dtnb，搅拌反应6h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到au/dtnb nps；最后取au/dtnb nps搅拌加热至煮沸，加入1.5％(w/v)的柠檬酸钠溶液，随后滴加1.5mm硝酸银溶液，持续沸腾20分钟，得到au/dtnb@ag nps，再向au/dtnb@ag nps中加入10mm的dtnb，搅拌反应5.5h，即可得到au/dtnb@ag/dtnb nps纳米材料；
61.s3，制备sers标记检测探针，首先向s2步骤制备的au/dtnb@ag/dtnb nps纳米材料中加入3.5μl的edc和3.5μl的nhs进行活化，活化后离心弃上清，然后用2.8mm的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入口蹄疫病毒抗体孵育2.5h；然后加入120ml的bsa进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用sers检测探针复溶液重悬，即制备得到口蹄疫病毒特异性sers标记分子，然后对口蹄疫病毒特异性sers标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在40℃恒温环境下干燥3h后，得到sers标记的口蹄疫病毒抗体检测探针；
62.s4，制备拉曼免疫层析试纸条，首先将s1步骤剩余的另一个口蹄疫病毒抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，稀释后口蹄疫病毒抗体检测探针的浓度为0.7mg/ml；羊抗鼠抗体的浓度为0.7mg/ml，然后分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在40℃恒温环境下干燥，其中口蹄疫病毒抗体检测探针作为检测线(t)，羊抗鼠抗体作为质控线(c)，然后将干燥后的硝酸纤维素膜与s3步骤制备的含sers标记的口蹄疫病毒抗体检测探针的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在pvc底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，制备的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及pvc底板，且裁剪后的试纸条宽度为2cm，长度为5cm，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；
63.s5，试纸条性能检测，一方面采用国家标准品对s4步骤所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察；另一方面通过临床样品对s4步骤所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测；从而对s4步骤所制备检测试纸条检测性能进行全面评测；其中：
64.灵敏度检测的具体方法为：
65.使用试纸条检测口蹄疫病毒国家标准品，分别稀释口蹄疫病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
66.特异性检测的具体方法为：
67.使用试纸条检测口蹄疫病毒阴性国家标准品：水疱性口炎病毒(n1)、牛流行性腹泻/黏膜病毒(n2)、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μl逐滴加入至试纸条上；15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
68.重复性检测的具体方法为：
69.制备八批次口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条，分别稀释口蹄疫病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号，从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10～15分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号。
70.稳定性检测的具体方法为：
71.使用口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒阳性国家标准品：口蹄疫o型阳性国家标准品p1、口蹄疫a型阳性国家标准品p2、口蹄疫c型阳性国家标准品p3、口蹄疫
asia1型阳性国家标准品p4、口蹄疫sat1型阳性国家标准品p5、口蹄疫sat2型阳性国家标准品p6和口蹄疫sat3型阳性国家标准品p7，及使用口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒阴性国家标准品：水疱性口炎病毒(n1)、牛流行性腹泻/黏膜病毒(n2)、大肠杆菌(n3)、多杀性巴氏杆菌(n4)、副伤寒甲型沙门氏菌(n5)、副伤寒乙型沙门氏菌(n6)、副伤寒丙型沙门氏菌(n7)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(n8)、金黄色葡萄球菌(n9)，各取60μl逐滴加入至试纸条上；10～15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
72.临床样品检测的具体方法为：
73.通过对若干例口蹄疫病毒临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μl逐滴加入至试纸条，并静置20分钟由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号即可；
74.在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量pcr与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，具体步骤为：
75.首先对口蹄疫病毒基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，
76.提取口蹄疫病毒全基因组核酸，在以其作为模板进行pcr进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等；然后用在中检院购买的国家标准品进行数字pcr扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光pcr定量检测，
77.并在荧光pcr定量完成后，将荧光定量pcr检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比。
78.实施例3
79.本发明实施例提供的表面增强拉曼散射结合免疫层析技术检测口蹄疫病毒的方法，包括以下步骤：
80.s1，口蹄疫病毒抗体分组，将获得的一对口蹄疫病毒抗体所包含的口蹄疫病毒标记抗体组和口蹄疫病毒捕获抗体组口蹄疫病毒抗体进行独立存放备用；
81.s2，制备纳米材料，首先选择s1步骤其中一个口蹄疫病毒抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出25nm的au nps胶体金溶液；然后在au nps胶体金溶液中加入10mm的dtnb，搅拌反应4h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备得到au/dtnb nps；最后取au/dtnb nps搅拌加热至煮沸，加入1％(w/v)的柠檬酸钠溶液，随后滴加1mm硝酸银溶液，持续沸腾15分钟，得到au/dtnb@ag nps，再向au/dtnb@ag nps中加入10mm的dtnb，搅拌反应4h，即可得到au/dtnb@ag/dtnb nps纳米材料；
82.s3，制备sers标记检测探针，首先向s2步骤制备的au/dtnb@ag/dtnb nps纳米材料中加入2.5μl的edc和2.5μl的nhs进行活化，活化后离心弃上清，然后用2mm的硼酸钠缓冲液重悬沉淀，加入口蹄疫病毒抗体孵育2h；然后加入100ml的bsa进行封闭，封闭完成后离心弃上清，最后加入用sers检测探针复溶液重悬，即制备得到口蹄疫病毒特异性sers标记分子，然后对口蹄疫病毒特异性sers标记分子稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上并在37℃恒温环境下干燥3h后，得到sers标记的口蹄疫病毒抗体检测探针；
83.s4，制备拉曼免疫层析试纸条，首先将s1步骤剩余的另一个口蹄疫病毒抗体和羊
抗鼠抗体进行稀释作业，稀释后口蹄疫病毒抗体检测探针的浓度为0.5mg/ml；羊抗鼠抗体的浓度为0.5mg/ml，然后分别喷涂在硝酸纤维素膜上并在37℃恒温环境下干燥，其中口蹄疫病毒抗体检测探针作为检测线(t)，羊抗鼠抗体作为质控线(c)，然后将干燥后的硝酸纤维素膜与s3步骤制备的结合垫同时与吸水纸及样品垫一同叠压并安装在pvc底板，在进行裁切作业即可得到成品试纸条，得到的试纸条从上至下依次为吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及pvc底板，且裁剪后的试纸条宽度为4cm，长度为10cm，最后将制备的试纸条分别装入卡壳内并置于燥环境密封备用；
84.s5，试纸条性能检测，一方面采用国家标准品对s4步骤所制备试纸条的灵敏度、特异性、重复性和稳定性进行考察；另一方面通过临床样品对s4步骤所制备检测试纸条的检测性能进行比对检测；从而对s4步骤所制备检测试纸条检测性能进行全面评测；其中：
85.灵敏度检测的具体方法为：
86.使用试纸条检测口蹄疫病毒国家标准品，分别稀释口蹄疫病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，12分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号；
87.特异性检测的具体方法为：
88.使用试纸条检测口蹄疫病毒阴性国家标准品：水疱性口炎病毒、牛流行性腹泻/黏膜病毒、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μl逐滴加入至试纸条上；13分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号；
89.重复性检测的具体方法为：
90.制备八批次口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条，分别稀释口蹄疫病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，13分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号,从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，13分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号；
91.稳定性检测的具体方法为：
92.使用口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒阳性国家标准品：口蹄疫o型阳性国家标准品p1、口蹄疫a型阳性国家标准品p2、口蹄疫c型阳性国家标准品p3、口蹄疫asia1型阳性国家标准品p4、口蹄疫sat1型阳性国家标准品p5、口蹄疫sat2型阳性国家标准品p6和口蹄疫sat3型阳性国家标准品p7，及使用口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒阴性国家标准品：水疱性口炎病毒(n1)、牛流行性腹泻/黏膜病毒(n2)、大肠杆菌(n3)、多杀性巴氏杆菌(n4)、副伤寒甲型沙门氏菌(n5)、副伤寒乙型沙门氏菌(n6)、副伤寒丙型沙门氏菌(n7)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(n8)、金黄色葡萄球菌(n9)，各取60μl逐滴加入至试纸条上；10～15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号；
93.临床样品检测的具体方法为：
94.通过对若干例口蹄疫病毒临床阳性样品和若干例阴性样本进行验证达到临床性检测的目的，其中检测时各取60μl逐滴加入至试纸条，并静置15分钟由拉曼光谱检测仪检测拉曼信号即可；
95.在进行临床样品检测时，另需进行荧光定量pcr与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比作业，具体步骤为：
96.首先对口蹄疫病毒基因进行多重序列比对，设计至少2对对引物探针用于基因序列扩增，提取口蹄疫病毒全基因组核酸，在以其作为模板进行pcr进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等；然后用在中检院购买的国家标准品进行数字pcr扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品；最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，分别进行对若干例实际样本进行荧光pcr定量检测，并在荧光pcr定量完成后，将荧光定量pcr检测的各例临床样本结果与试纸条检测结果进行对比即可。
97.此外，为了更好的对本发明所采用的技术手段进行详细说明，便于本领域技术人员充分理解掌握本发明涉及技术方案内容及效果，现结合具体实施例对本发明进行进一步的详细说明，具体实施方法如下：
98.s1，口蹄疫病毒抗体分组，将获得的原始口蹄疫病毒抗体分为两组，并分别对两组口蹄疫病毒抗体进行独立存放备用；其中：
99.(1)主要试剂和材料
100.硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane，nc膜)；玻璃纤维素膜；血清样品垫；吸水纸；pvc底板，以上均购自上海杰一生物技术有限公司；划膜仪(bio-dot公司)；微电脑自动斩切机(上海金标生物科技公司)；i-raman plusbws465-785h拉曼光谱仪(b&w tek公司)；加热磁力搅拌器(北京世纪华科)。离心机(德国eppendorf)；hitachi h-9000高清透射电镜(日本日立)；电热鼓风干燥箱(重庆万达仪器有限公司)。
101.(2)试剂
102.次氯金酸(haucl4)、硝酸银(agno3)、无水乙醇、柠檬酸钠均为国产分析试剂；5,5-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)(dtnb)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc)；n-羟基硫代琥珀酰亚胺nhs(sulfo-nhs)均购于sigma公司；口蹄疫病毒抗体(口蹄疫病毒标记抗体与口蹄疫病毒捕获抗体)购于深圳市鼎抗生物技术有限公司。
103.具体实施步骤为：
104.s2，au/dtnb@ag/dtnb纳米材料的合成与制备au nps的合成：首先选择s1步骤其中一个口蹄疫病毒抗体，并利用柠檬酸钠还原法制备出25nm的au nps胶体金溶液。au/dtnb nps的合成:在au nps中加入10mm的dtnb，搅拌反应4h；离心弃上清，用去离子水重悬至原始体积，制备出au/dtnb nps。au/dtnb@ag/dtnb nps的合成：取au/dtnb nps搅拌加热至煮沸，加入1％(w/v)的柠檬酸钠溶液，随后滴加1mm硝酸银溶液，持续沸腾15分钟，形成au/dtnb@ag nps。于au/dtnb@ag nps中加入10mm的dtnb，搅拌反应反应4h合成au/dtnb@ag/dtnb nps。
105.s3，口蹄疫病毒特异性sers标记分子的制备
106.在au/dtnb@ag/dtnb nps中分别加入一定量的edc和nhs进行活化，活化后离心弃上清，用2mm的硼酸钠缓冲液(bbs)重悬沉淀，加入口蹄疫病毒抗体孵育2h；加入bsa进行封闭，封闭完成后离心弃上清，用sers检测探针复溶液重悬，制备出口蹄疫病毒特异性sers标记分子，稀释至所需浓度均匀的喷涂于结合垫上，干燥3h备用。
107.s4，拉曼免疫层析试纸条的制备
108.首先将s1步骤剩余的另一个口蹄疫病毒抗体和羊抗鼠抗体进行稀释作业，并将口蹄疫病毒抗体和羊抗鼠稀释至所需浓度，分别作为t线(检测线)和c线(质控线)，置于37℃
干燥3h备用。将制备好的结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸和样品垫相互压叠，贴于pvc底板上，切割为宽3mm、长6.5cm的试纸条，装入卡壳，置于干燥环境密封备用。
109.s5，拉曼免疫层析试纸条的性能考察
110.(1)口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条灵敏度检测
111.使用口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒国家标准品，分别稀释口蹄疫病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10～15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
112.(2)口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条参考品检测
113.使用口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒阳性国家标准品：口蹄疫o型阳性国家标准品p1、口蹄疫a型阳性国家标准品p2、口蹄疫c型阳性国家标准品p3、口蹄疫asia1型阳性国家标准品p4、口蹄疫sat1型阳性国家标准品p5、口蹄疫sat2型阳性国家标准品p6和口蹄疫sat3型阳性国家标准品p7，及使用口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒阴性国家标准品：水疱性口炎病毒(n1)、牛流行性腹泻/黏膜病毒(n2)、大肠杆菌(n3)、多杀性巴氏杆菌(n4)、副伤寒甲型沙门氏菌(n5)、副伤寒乙型沙门氏菌(n6)、副伤寒丙型沙门氏菌(n7)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(n8)、金黄色葡萄球菌(n9)，各取60μl逐滴加入至试纸条上；10～15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
114.(3)口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条特异性检测
115.使用口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒阴性国家标准品：水疱性口炎病毒、牛流行性腹泻/黏膜病毒、大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、副伤寒甲型沙门氏菌、副伤寒乙型沙门氏菌、副伤寒丙型沙门氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、金黄色葡萄球菌，各取60μl逐滴加入至试纸条上；10～15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号。
116.(4)口蹄疫病毒免疫层析试纸条重复性检测
117.制备八批次口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条，分别稀释口蹄疫病毒国家标准品至10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000倍，加入至试纸条，10～15分钟观察结果，拉曼光谱仪器检测每个试纸条上拉曼信号,从同一批试纸条内随机选择十个试纸条，分别检测相同稀释倍数，10～15分钟观察结果，拉曼光谱仪检测拉曼信号。
118.(5)口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条临床样品检测
119.为了验证制备的拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒的有效性与灵敏性，检测了10例口蹄疫病毒临床阳性样品和7例阴性样本进行验证，各取60μl逐滴加入至试纸条，10分钟左右观察结果，拉曼光谱检测仪检测拉曼信号。
120.(6)荧光定量pcr与拉曼免疫层析试纸条检测临床样本的对比
121.首先对口蹄疫病毒基因进行多重序列比对，设计2对引物探针用于基因序列扩增，提取口蹄疫病毒全基因组核酸，在以其作为模板进行pcr进行扩增，找到最佳反应条件及反应体系，主要有buffer浓度、引物探针浓度以及反应程序参数等。之后用在中检院购买的国家标准品进行数字pcr扩增，计算拷贝数，确定其浓度并作为参考品。最后通过确立最佳反应条件与确立好国家标准品浓度后，进行对92例实际样本进行荧光pcr定量检测。荧光pcr定量完成后，将荧光定量pcr检测92例临床样本结果与拉曼免疫层析试纸条检测结果进行对比。
122.下面试验结果对本发明技术效果作详细的描述。
123.1.拉曼标记分子的表征
124.在本实验中，以粒径为25nm左右的au nps作为基底。将拉曼分子dtnb修饰到au np表面，加入硝酸银形成au/dtnb@ag。再修饰拉曼分子dtnb于金核银壳上形成au/dtnb@ag/dtnb nps。
125.au nps、au/dtnb nps、au/dtnb@ag nps和au/dtnb@ag/dtnb nps四类纳米材料的紫外光谱表明，au nps的吸收峰出现在波长525nm附近，au/dtnb@ag/dtnb nps的吸收峰偏移18nm。根据1331cm-1
拉曼位移处的峰值来比较拉曼信号的强弱，观察可得au/dtnb@ag/dtnb nps的sers信号强度为au/dtnb nps的两倍。
126.2.拉曼免疫层析试纸条的灵敏度检测结果
127.基于双层拉曼分子的sers拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒国家标准品结果，可以观察到检测低稀释倍数的口蹄疫病毒国家标准品时，检测线上形成可视化的红色线条；随着稀释倍数的增加，检测线上的颜色逐渐变浅，检测浓度低于稀释5000倍时，观察不到检测线，
128.得出结论：基于双层拉曼分子的sers拉曼免疫层析检测口蹄疫病毒试纸条工作良好，且可视化信号为稀释浓度5000倍。检测不同稀释倍数的sers光谱，可以观察到随着稀释倍数的增加，拉曼信号逐渐变弱，当稀释倍数为50000倍时，1331cm-1
拉曼位移处的主峰显著高于阴性，且根据公式：lod＝vblank+3sdblank，可得最低检测限的主峰信号为：1441.91。因此基于双层拉曼分子的sers拉曼免疫层析检测口蹄疫病毒的检测限为稀释浓度50000倍。通过绘制口蹄疫病毒国家标准品稀释浓度与1331cm-1
拉曼位移处的主峰sers信号强度之间的校正曲线，在稀释倍数为10倍至100000倍之间具有良好的线性关系(r2＝0.995)，误差线代表了五次独立检测拉曼信号的标准偏差。
129.3.拉曼免疫层析试纸条的重复性检测结果
130.用同一批十根试纸条检测稀释100倍口蹄疫病毒国家标准品结果，证明：该试纸条批内重复性良好。用八批sers拉曼免疫层析试纸条检测稀释100倍口蹄疫病毒国家标准品的结果显示：该试纸条批间重复性良好。
131.4.拉曼免疫层析试纸条国家标准品检测结果
132.根据口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒国家标准品结果，检测水疱性口炎病毒(n1)、牛流行性腹泻/黏膜病毒(n2)、大肠杆菌(n3)、多杀性巴氏杆菌(n4)、副伤寒甲型沙门氏菌(n5)、副伤寒乙型沙门氏菌(n6)、副伤寒丙型沙门氏菌(n7)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(n8)、金黄色葡萄球菌(n9)与口蹄疫o型阳性国家标准品p1、口蹄疫a型阳性国家标准品p2、口蹄疫c型阳性国家标准品p3、口蹄疫asia1型阳性国家标准品p4、口蹄疫sat1型阳性国家标准品p5、口蹄疫sat2型阳性国家标准品p6和口蹄疫sat3型阳性国家标准品p7的sers拉曼免疫层析试纸条结果，可以观察到：n1～n9只有控制线上形成可视化的红色线条，p1～p7检测线上形成可视化的红色线条；通过14种国家标准品的sers光谱，n1～n9：1331cm-1
拉曼位移处均未有明显主峰，p1～p7：1331cm-1
拉曼位移处的主峰信号均高于1441.91。结果显示：该试纸条国家标准品检测结果符合率100％。
133.5.拉曼免疫层析试纸条对临床样品的检测结果
134.口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条检测口蹄疫病毒临床样品结果及检测口蹄疫病毒临床样品的试纸条图片，阳性组标本的检测线与控制线为肉眼可见的红色，阴性组标本
仅有肉眼可见的一条红色控制线。通过检测口蹄疫病毒临床样品的sers光谱，阳性组所有的拉曼信号在1331cm-1
处都有明显峰值，阴性组都无明显信号，阳性组的拉曼信号都明显高于阴性组，并且高于临界值1441.91。得出结论：口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条，临床阳性标本检出率为100％。
135.6.口蹄疫病毒荧光定量pcr检测结果
136.拉曼免疫层析检测结果与荧光定量pcr检测结果比较经荧光定量pcr及拉曼免疫层析试纸条检测，该试纸条特异性为100％，两种方法符合率为100％。
137.由上述试验可知，本发明实施检测的基本原理为：
138.首先，合成双层拉曼分子标记的金核银壳纳米材料(au/dtnb@ag/dtnb nps)，在此材料上修饰口蹄疫病毒抗体，制备出sers检测探针。sers-免疫层析试纸条由吸水纸、样品垫、结合垫与硝酸纤维素膜及底板组成。结合垫上固定制备好的口蹄疫病毒sers检测探针，硝酸纤维素膜是固定检测线(rv抗体)与控制线(羊抗鼠igg)。当含有口蹄疫病毒的样品滴加在样品垫上后，溶液在结合垫上发生特异性识别与结合，在层析作用下经过结合垫到达控制线，与控制线上特异性rv抗体识别捕获，形成复合物，剩余的sers检测探针继续移动到达控制线，被羊抗鼠igg捕获，在控制线与检测线上的sers检测探针累积显现可视化的两条红色线条。当只有控制线显现红色线条时，证明该样品中没有口蹄疫病毒的存在，检测线出现红色线条代表该试纸条体系完整良好。
139.本发明将拉曼增强技术与免疫层析技术相结合，制备出口蹄疫病毒拉曼免疫层析试纸条，该试纸条灵敏度高、特异性强、使用方便快捷，可大量用于临床快速诊断中；另一方面本发明的方法操作简便、灵敏度高，15min内即可完成检测，在口蹄疫病毒感染的早期检测中具有广阔的应用和推广前景。
140.以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体技术方案或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明技术方案的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本技术要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。