一种电位低且检测范围宽的葡萄糖传感器及其制备方法

1.本发明属于生物传感器技术领域，具体涉及一种电位低且检测范围宽的葡 萄糖传感器及其制备方法。


背景技术：

2.糖尿病已成为威胁人类健康的疾病之一。糖尿病人的血糖监测对控制病情 非常重要。对现在普遍采用的有创测试，病人多有恐惧感和不适感，因此，无 创血糖仪的研发成为各国医疗界的重点题目。
3.其中，采用反向离子电渗技术得到皮下间质的糖分子，并通过电化学生物 传感器测试皮下渗出的葡萄糖国外已有研究。相对于直接采血检测人体血糖 (mmol/l量级)来说，皮下渗出葡萄糖的浓度非常低(mmol/l量级)，传统的血糖 生物传感器在检测范围和灵敏度上几乎都无法满足要求，而能检测低浓度葡萄 糖的传感器由于电极制作的限制无法实用化。在0.53v工作电压下，通过使用 过氧化氢传感器实现了皮下血糖的无创检测，然而，较高的工作电位易导致体 液中的其他电活性物质易对测试造成干扰。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种电位低且检测范围宽的葡萄 糖传感器及其制备方法，葡萄糖的大量检测在许多应用中都是必需的，但目前 仍然具有挑战性。商业化的酶基葡萄糖检测试纸不能重复使用，同时目前的无 酶葡萄糖传感器检测范围窄，葡萄糖氧化动力学缓慢。
5.本发明采用耦联有葡萄糖氧化酶的铑氧化还原聚合物为电子媒介体修饰薄 膜au电极，并通过戊二醛法固定葡萄糖酶分子制备出新型生物传感器，传感器 对标准葡萄糖和皮下葡萄糖2种情况下的电流响应特性分别能够达到23.955 na/(mmol l-1
)和18.941na/(mmol l-1
)，在4℃环境中寿命能达到15天。
6.为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
7.一种电位低且检测范围宽的葡萄糖传感器的制备方法，在三电极体系中的 工作电极上交联固定葡萄糖氧化酶与铑形成的氧化还原聚合物即可。
8.进一步地，三电极体系中工作电极为au工作电极，对电极为au对电极， 参比电极为ag/agcl参比电极。
9.进一步地，包括以下步骤：
10.(1)将塑料基片上(130mm
×
100mm)的保护膜刻成条状电极的掩膜图案 后，然后在其上依次溅射过渡金属层和au电极层，然后将基片上的掩膜去除再 进行刻蚀，并通入氧气清洗，形成工作电极；
11.(2)以不锈钢为掩膜板，然后再在基片上的条状电极上间隔丝印银和氯化 银的混合液，制备得到ag/agcl参比电极；
12.(3)将胶带(130mm
×
50mm)的中部刻出长方形槽(100mm
×
4.0mm)后， 粘贴在基片
上，槽中露出基片上的电极依次为传感器的工作电极(2.0mm
×
4.0 mm)和参比电极(20mm
×
4.0mm)；
13.(4)将葡萄糖氧化酶和交联剂与含铑的氧化还原聚合物溶液中，混合均匀 后形成酶溶液，取0.5ml滴涂到传感器的工作电极表面，并于室温下自然晾干 成膜，水洗，晾干后分切成单个传感器，室温保存备用。
14.进一步地，基片为塑料基片。
15.进一步地，过渡金属层的厚度为10～30nm，au电极层的厚度为100～500nm。
16.进一步地，过渡金属层为cr层
17.进一步地，氧气的流量为30～50ml/min，工作气压为3～5pa，清洗时间为 30～40s。
18.进一步地，交联剂为醛类交联剂。
19.进一步地，交联剂为戊二醛。
20.进一步地，酶溶液中含有1％的bsa，葡萄糖氧化酶的浓度为5～10u/ml， 交联剂用量为酶溶液体积的3.5～5％。
21.上述方法制备得到的电位低且检测范围宽的葡萄糖传感器，葡萄糖传感器 采用au工作电极、au对电极和ag/agcl参比电极三电极体系，结构如图1， 传感器由2只形状相同的传感器组成，共同完成传感器的抽取和检测功能，其 中，w1和w2为薄膜au工作电极，c1和c2为au对电极，w和r构成抽取 电极回路，r1和r2为丝印ag/agcl参比电极，用于在传感器测试时提供一个 稳定的参比电压，工作电极敏感部位面积为0.85cm2。
22.该葡萄糖传感器在无创检测人体血糖中的应用。
23.本技术的技术原理为：
24.固定在工作电极上的葡萄糖氧化酶(gox)氧化葡萄糖，这个过程产生的电子 将还原态电介质rh氧化，rh变成氧化态rh，该氧化态电介质rh在较低工作 电压下被还原，因为电子的转移发生在整个氧化还原聚合物的三维网络中，所 以，反应电流密度大，且灵敏度高。此外，由于氧化还原聚合物不能自由扩散 到本体溶液中，因此，具有较高的电子转移效率。反应中响应电流与葡萄糖浓 度成正比。这种铑聚合物可以在较低的电位下检测葡萄糖，避免了其他电化学 活性物质的干扰。同时，由于铑可以在电极和酶之间进行电子的快速转移，在 一定程度上消除了对本体溶液中氧浓度的依赖。
25.本发明的有益效果：
26.1、本发明采用戊二醛交联方法将酶分子固定在薄膜电极表面组成具有特异 性的葡萄糖生物传感器。通过选用高灵敏度的氧化还原聚合物提高传感器的灵 敏度。研究了传感器对标准葡萄糖和皮下葡萄糖2种情况下的电流响应特性， 其灵敏度分别为23.955na/(mmol l-1
)和18.941na/(mmol l-1
)，线性相关性均达 到0.99以上。
27.2、本发明采用加速寿命试验分析出在4℃条件下传感器的寿命可达15d。并 给出了传感器的批内和批间精度均小于5％。所设计的三电极传感器具有灵敏度 高、稳定性好及检测限低等优点，集取样和检测功能于一体，结合反离子电渗 技术实现了对皮下血糖的抽取和检测。
28.3、本发明采用将戊二醛酶交联实验，在rp中可以有效地提高传感器的响 应电流，线性工作区域宽，灵敏度高。传感器响应时间为10s且有良好的一致 性和稳定性，使用一个
月后仍能保持其初始活性的90％，这说明戊二醛酶交联 在rp中能够保持较高的酶活性，传感器成本低廉、操作简单、检测快速。可望 批量制作用于医疗诊断、食品工业、环境检测等领域中。
附图说明
29.图1为传感器的三电极体系结构图；
30.图2为传感器对不同葡萄糖浓度下的cv(循环伏安)响应图；
31.图3为传感器对不同葡萄糖浓度下的i-t(时间-电流曲线)响应图；
32.图4为传感器对不同葡萄糖浓度下的线性图；
33.图5为传感器的长期稳定性图。
具体实施方式
34.下面对本发明的具体实施方式进行描述，以便于本技术领域的技术人员理 解本发明，但应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的 普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精 神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保 护之列。
35.实施例1
36.一种电位低且检测范围宽的葡萄糖传感器的制备方法，具体过程如下：
37.(1)将塑料基片上(130mm
×
100mm)的保护膜刻成条状电极的掩膜图案 后，先后在其上溅射过渡层cr(10nm-)和au电极层(100nm)；
38.(2)掩膜去除后，将基片放入等离子体刻蚀机中，通入o2(工作气压为3.0 pa，o2流量30ml/min)“清洗”30s。
39.(3)以不锈钢为掩膜板，在塑料基片上的条状电极上间隔丝印银和氯化银 的混合浆料，形成集成化的ag/agcl参比电极；
40.(4)将胶带(130mm
×
50mm)的中部刻出长方形槽(100mm
×
4.0mm)后，粘 贴在塑料基片上，槽中露出基片上的电极依次为传感器的工作电极(2.0mm
×
4.0 mm)和参比电极(20mm
×
4.0mm)；
41.(5)将gox和戊二醛加入到氧化还原聚合物溶液中，充分混合后，取0.5 ml滴涂到传感器的工作电极表面，并于室温下自然晾干成膜，水洗，晾干后分 切成单个传感器，室温保存备用。
42.实施例2
43.一种电位低且检测范围宽的葡萄糖传感器的制备方法，具体过程如下：
44.(1)将塑料基片上(130mm
×
100mm)的保护膜刻成条状电极的掩膜图案 后，先后在其上溅射过渡层cr(30nm)和au电极层(300nm)；
45.(2)掩膜去除后，将基片放入等离子体刻蚀机中，通入o2(工作气压为4.0 pa，o2流量35ml/min)“清洗”35s。
46.(3)以不锈钢为掩膜板，在塑料基片上的条状电极上间隔丝印银和氯化银 的混合浆料，形成集成化的ag/agcl参比电极；
47.(4)将胶带(130mm
×
50mm)的中部刻出长方形槽(100mm
×
4.0mm)后，粘 贴在塑料
基片上，槽中露出基片上的电极依次为传感器的工作电极(2.0mm
×
4.0 mm)和参比电极(20mm
×
4.0mm)；
48.(5)将gox和戊二醛加入到氧化还原聚合物溶液中，充分混合后，取0.5 ml滴涂到传感器的工作电极表面，并于室温下自然晾干成膜，水洗，晾干后分 切成单个传感器，室温保存备用。
49.实施例3
50.一种电位低且检测范围宽的葡萄糖传感器的制备方法，具体过程如下：
51.(1)将塑料基片上(130mm
×
100mm)的保护膜刻成条状电极的掩膜图案 后，先后在其上溅射过渡层cr(20nm)和au电极层(200nm)；
52.(2)掩膜去除后，将基片放入等离子体刻蚀机中，通入o2(工作气压为3.0 pa，o2流量35ml/min)“清洗”30s。
53.(3)以不锈钢为掩膜板，在塑料基片上的条状电极上间隔丝印银和氯化银 的混合浆料，形成集成化的ag/agcl参比电极；
54.(4)将胶带(130mm
×
50mm)的中部刻出长方形槽(100mm
×
4.0mm)后，粘 贴在塑料基片上，槽中露出基片上的电极依次为传感器的工作电极(2.0mm
×
4.0 mm)和参比电极(20mm
×
4.0mm)；
55.(5)将gox和戊二醛加入到氧化还原聚合物溶液中，充分混合后，取0.5 ml滴涂到传感器的工作电极表面，并于室温下自然晾干成膜，水洗，晾干后分 切成单个传感器，室温保存备用。
56.实验例
57.1、循环伏安实验和电流检测实验
58.循环伏安实验和电流检测实验均在chi 760e电化学工作站检测系统上进 行。具体过程如下：
59.在25ml的烧杯中，加入ph＝7.4磷酸盐缓冲液10ml(0.01m pbs)，烧杯 中事先放置搅拌磁子，插入传感器，开启搅拌器并调至恒速，工作电位为0.13 v(ag/agcl参比电极)。测试电流响应时，停止搅拌，首先，检测传感器的背景 电流，当响应处于稳态后，加入待测溶液物葡萄糖后，磁子继续开始搅拌1min， 以使被测物葡萄糖均匀充满整个溶液，然后，停止搅拌，启动测试程序，记录 氧化电流。实验温度均为25℃，检测结果见图2和图3。
60.2、传感器电化学特性检测
61.采用8ml的铑聚合物修饰薄膜au工作电极。图3为不同扫描速率时，氧 化还原聚合物的阴阳极峰电流变化值，扫描速率分别为5，10，20，50，100， 200，500mv/s。从图中可以看出：其氧化峰电流(i
pa
)与还原峰电流(i
pc
)之比为 i
pa
/i
pc
≈1，且峰电流与扫描速率的平方根成线性关系，说明铑氧化还原聚合物具 有可逆的电化学特性。
62.3、传感器对标准葡萄糖的电流响应
63.图4给出了传感器对标准葡萄糖的电流响应曲线。其中，根据曲线对应的 葡萄糖浓度，每个样品测3次，工作电压0.18v。由图中看出：当加入葡萄糖 溶液后，随着葡萄糖浓度的增加，传感器的电流响应也在逐渐增大，电流值的 增加与葡萄糖浓度增加呈线性关系，且电流响应信号快速趋于稳定，同时，在 5.0-45mmol/l浓度范围内，葡萄糖溶液的电流响应信号具有非常好的线性关系。 在5.0-45mmol/l范围内传感器的线性校正方程i
p
＝
5.6796x-2.4909，最低检测限 为0.3mmol/l，相关系数r为0.9979，传感器的灵敏度为23.955na/(mmol l-1
)。 结果表明：铑聚合物的使用有效地降低了传感器的工作电压。
64.4、传感器重复性研究
65.对所研制的同批单只生物传感器和批间不同传感器之间分别对10mmol/l 葡萄糖重复测试的精度，结果表明，批内精度指1只传感器重复10次测试10 mmol/l葡萄糖的电流响应结果，批间精度指用10只传感器分别测试10mmol/l 葡萄糖的电流响应结果。结果可以看出：传感器的批内和批间精度分别为4.07％ 和3.22％，均小于5％，表明所制备的传感器具有较好的重复性和一致性。
66.5、传感器稳定性检测
67.传统的寿命试验是通过检测传感器在4℃条件下存放多长时间来评估其性 能。在物理化学中，化学反应的速率随反应温度升高而加快。生物试剂在不同 温度中保存，试剂失效的“速率”和存放的温度时间也符合物理化学上的反应速率 的关系。阿仑尼乌斯经验式归纳了这个物理化学的规律。阿仑尼乌斯描述温度 对反应速率的影响经验式如下：lnk＝-eart+b，其中，k为反应速率；t为反应 的绝对温度。
68.设计试验：进行多个温度下保存试剂出现失效的保存时间，该时间(天数或 小时数)的倒数即为在该温度下试剂变坏的速率。将试验温度换算为绝对温度t， 和保存时间倒数形成各个数据对，在半对数纸上作图，令lnk为y1/t为x。在 图上绘制一条最佳的配合线，由该线倒推至t为277k(4℃)时对应的反应速率 的对数值。由该对数值求反对数(指数)，再求该值的倒数，即为估计的稳定时间。
69.依据上述原理对葡萄糖生物传感器进行了寿命稳定性能的观察。在20，35， 55℃进行试验。以4℃生物传感器的响应为对控制品检测结果，检测结果以在 4℃条件下生物传感器响应结果的90％或以下的为失效。
70.将x(1/t)和y[lg(1/d)]的成对结果绘图或进行直线回归处理(在半对数纸上 呈直线关系)，由回归式推算4℃的绝对温度277k下，预期稳定的天数为15d。 所以，由试验推算，所制备的生物传感器在4℃下可以稳定保存的时间约15d。 (见图5)综上可以看出，本发明制备得到的传感器具有更低的氧化电位。