一种基于磁性纳米探针和金纳米棒快速裸眼检测人N端脑钠肽前体检测试剂盒

一种基于磁性纳米探针和金纳米棒快速裸眼检测人n端脑钠肽前体检测试剂盒
技术领域
1.本发明涉及人n端脑钠肽前体(nt-pro bnp)的免疫学检测领域，特别是一种基于磁性纳米探针和金纳米棒快速裸眼检测人n端脑钠肽前体(nt-pro bnp)检测试剂盒。


背景技术：

2.随着人们生活质量水平的提高以及老龄化的快速增长，心衰的患病率也逐年增长。据报道，在发达国家中，1-2％的成年人患有心力衰竭，在以社区为基础的调查中，30％-40％的心衰患者在确诊1年内死亡，60％-70％的患者在5年内死亡，大多数死于心力衰竭恶化，在需要住院治疗的患者中，死亡率甚至更高，超过了大多数癌症患者。在我国成年人心力衰竭发病率为0.9％，虽低于发达国家的1％-2％。但随着全球人口老龄化进程加剧，老年心力衰竭病人只增不减。由于早期心力衰竭表现不明显，中后期损伤不可逆，经济负担较大，所以早期诊断至关重要。目前，心力衰竭严重危害人类健康，随着心力衰竭的发病率逐年升高如何快速、及早诊断心力衰竭已成为本病临床迫切需要解决的关键问题之一。
3.脑钠肽(brain natriuretic peptide，bnp)是一种神经激素类物质，具有促尿排钠和抵制交感神经活性的作用，bnp首次由日本学者从猪脑中分离。随着心力衰竭的发病率逐年升高及人们对于心衰等相关疾病研究的深入，使的bnp越来越被人们重视。研究发现，人体内的bnp是由bnp前体蛋白(pro-brain natriuretic peptide,probnp)的c端裂解得到，而其n端则裂解形成没有活性的n末端脑钠尿肽原(nt-pro bnp)。nt-pro bnp形成部位主要是心房和心室合成，两者都可以作为心肌损伤的标志物，对于多种心脏相关疾病的诊断和治疗评估具有重要价值。由于体内不存在nt-pro bnp主动清除机制，因此半衰期较长，同时其检测样本更易获得和性质较稳定等优点，nt-pro bnp已成为一种主要的心力衰竭检测标志物。
4.目前检测nt-pro bnp的方法注意包括胶体金免疫层析法(cn204188626u，2014年)、酶联免疫吸附实验(elisa)(cn106916225a，2017年)、微流控荧光免疫芯片(cn109211867a，2018年)和化学发光elisa(cn 111912838 a，2020年)、电化学检测方法(cn 110967491a，2020年)等等。虽然胶体金免疫层析法检测快速，操作简便，但是仅能实现半定量的检测，且胶体金与抗体偶联需要更多抗体，同时胶体金试纸条检测线和质控线需要高浓度的nt-pro bnp和相对应的抗体。在灵敏度方面，微流控荧光免疫芯片、化学发光elisa和电化学检测方法，这些方法虽然具有高灵敏的特性，但是它们需要昂贵的仪器，专业的技术人员、价格昂贵的试剂及操作复杂等缺点。微流控的研发成本更高，需要定制独特的微流控芯片等等，同时其涉及多门学科，如化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程等等限制因素。这些高灵敏的检测方法限制其在偏移和落后地区的推广和使用。因此，建立一种简单易操作、快速nt-pro bnp的检测方法具有一定现实意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种基于磁性纳米探针和金纳米棒快速裸眼检测人n端脑钠肽前体(nt-pro bnp)检测试剂盒，解决现有技术中检测成本高，依赖大型仪器及专业人员，无法裸眼对人nt-pro bnp浓度检测的技术问题。
6.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
7.一种基于磁性纳米探针和金纳米棒快速裸眼检测人n端脑钠肽前体检测试剂盒，所述检测试剂盒包括磁性纳米探针、人n端脑钠肽前体(nt-pro bnp)检测抗体、elisa反应液以及金纳米棒溶液；
8.所述磁性纳米探针由人nt-pro bnp包被抗体偶联磁珠制备而得；
9.所述人n端脑钠肽前体(nt-pro bnp)检测抗体偶联有辣根过氧化物酶；
10.所述检测试剂盒对待检测抗原样品进行检测时首先由磁性纳米探针、人n端脑钠肽前体(nt-pro bnp)检测抗体以及elisa反应液对待检测抗原样品进行双抗体夹心免疫反应得到夹心免疫反应液，最后通过金纳米棒溶液对夹心免疫反应液进行aunrs蚀刻完成检测。
11.进一步，所述人nt-pro bnp包被抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
12.进一步，所述elisa反应液包括elisa洗涤液、elisa底物显示液以及elisa终止液；
13.所述elisa洗涤液为含0.1％的tween20，0.01m，ph为7.4的pbs缓冲液(pbst)；
14.所述elisa底物显示液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)底物溶液；
15.所述elisa终止液为2m硫酸溶液。
16.进一步，所述检测试剂盒对待检测抗原样品进行检测时在elisa酶标板或ep管内进行。
17.进一步，所述检测试剂盒对待检测抗原样品进行检测的检测步骤包括以下步骤：
18.s1：对磁性纳米探针进行洗涤；
19.s2：向磁性纳米探针中加入待检测抗原样品并在1200rpm振荡下室温均相反应20分钟得到第一反应液；
20.s3：对第一反应液进行洗涤；
21.s4：向第一反应液中加入人n端脑钠肽前体(nt-pro bnp)检测抗体并在1200rpm振荡下室温均相反应20分钟；
22.s5：通过elisa洗涤液进行洗涤；
23.s6：通过elisa底物显示液进行底物显色；
24.s7：通过elisa终止液终止双抗体夹心免疫反应得到夹心免疫反应液；
25.s8：通过金纳米棒溶液对夹心免疫反应液进行aunrs蚀刻。
26.进一步，所述金纳米棒溶液的制备过程包括以下步骤：
27.(1)制备种子液；
28.(2)制备种子生长液；
29.(3)将种子液加入到种子生长液中搅拌均匀并经孵育得到金纳米棒溶液。
30.进一步，所述种子液是通过向十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中依次加入氯金酸(haucl4)溶液以及硼氢化钠溶液制得的。
31.进一步，所述种子生长液是通过向十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中依次加入
5-溴水杨酸溶液、硝酸银(agno3)溶液、氯金酸(haucl4)溶液以及抗坏血酸(aa)溶液制得的。
32.本发明的有益效果是：
33.检测低成本，无需大型仪器及专业人员，可实现裸眼对人nt-pro bnp浓度检测；本检测试剂盒使用操作简便，反应时间短、特异性高。
附图说明
34.图1是本发明的检测原理示意图；
35.图2是采用本发明进行灵敏度测试的裸眼检测结果图：酶标孔从左到右依次分别代表样品溶液nt-pro bnp(菲鹏生物股份有限公司)的浓度为50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.125ng/ml、1.50ng/ml、0.75ng/ml和0ng/ml。
36.图3是采用本发明进行检测的特异性结果图：酶标孔从左到右依次分别代表肺炎支原体p1粘附蛋白(p1)、c反应蛋白(crp)、肝素结合蛋白(hbp)、血清淀粉样蛋白a(saa)和阴性(加入等体积1％tween 20的ph7.4 pbs缓冲液)。
具体实施方式
37.以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。
38.需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。
39.下述所涉及的实施方案如若无特殊指明，均为常规方法。
40.下述实施方案所涉及的材料、试剂等，若无特殊说明，可从商业途径获取。
41.实施例一：
42.如图1至图3所示，一种基于磁性纳米探针和金纳米棒快速裸眼检测人n端脑钠肽前体检测试剂盒，所述检测试剂盒包括磁性纳米探针、人n端脑钠肽前体(nt-pro bnp)检测抗体、elisa反应液以及金纳米棒(aunrs)溶液；
43.所述磁性纳米探针由人nt-pro bnp包被抗体偶联磁珠(mbs)制备而得；
44.所述人nt-pro bnp包被抗体的氨基与磁性磁珠表面的nhs基团反应得到磁性纳米探针；从而实现人nt-pro bnp包被抗体负载纳米磁珠。
45.所述人nt-pro bnp包被抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，优选单克隆抗体。
46.所述人n端脑钠肽前体(nt-pro bnp)检测抗体偶联有辣根过氧化物酶(hrp)；
47.所述elisa反应液包括elisa洗涤液、elisa底物显示液以及elisa终止液；
48.所述elisa洗涤液为含0.1％的tween20，0.01m，ph为7.4的pbs缓冲液(pbst)；
49.所述elisa底物显示液为3,3',5,5'-四甲基联苯胺(tmb)底物溶液；
50.所述elisa终止液为2m硫酸溶液。
51.所述检测试剂盒对待检测抗原样品进行检测时首先由磁性纳米探针、人n端脑钠肽前体(nt-pro bnp)检测抗体以及elisa反应液对待检测抗原样品进行双抗体夹心免疫反应得到夹心免疫反应液，最后通过金纳米棒溶液对夹心免疫反应液进行aunrs蚀刻完成检测。
52.所述检测试剂盒对待检测抗原样品进行检测时在elisa酶标板或ep管内进行。
53.酶标板的材质为聚苯乙烯微孔板，酶标板或ep管用作后续的双抗体夹心免疫反应容器。
54.所述检测试剂盒利用hrp催化tmb产生tmb
2+
蚀刻aunrs和双抗体夹心elisa检测原理裸眼测定人血清nt-pro bnp含量。
55.所述检测试剂盒对待检测抗原样品进行检测的检测步骤包括以下步骤：
56.s1：对磁性纳米探针进行洗涤；
57.用含0.1％的tween20，0.01m ph7.4的pbs缓冲液(pbst)，基于外界磁力架，洗涤酶标板或ep管3次。
58.s2：向磁性纳米探针中加入待检测抗原样品并在1200rpm振荡下室温均相反应20分钟得到第一反应液；
59.向所述酶标板中或ep管加入待检测抗原样品，100μl/每孔，放于振荡器调制1200rpm，室温均相反应20min。
60.s3：对第一反应液进行洗涤；
61.基于外界磁力架甩干酶标板内液体或吸出ep管内的上清液，200μl/每孔或200μl/每管进行洗涤，洗涤3次。
62.s4：向第一反应液中加入人n端脑钠肽前体(nt-pro bnp)检测抗体并在1200rpm振荡下室温均相反应20分钟；
63.向所述酶标板或ep管内中加入人n端脑钠肽前体(nt-pro bnp)检测抗体(采用济南星宝生物技术有限公司辣根过氧化物酶标记检测方法)，2000倍稀释，100μl/每孔，置于振荡器上调制1200rpm，室温均相反应20min。
64.s5：通过elisa洗涤液进行洗涤；
65.基于外界磁力架甩干酶标板内液体或吸出ep管内的上清液，200μl/每孔或200μl/每管进行洗涤，采用pbst洗涤3次。
66.s6：通过elisa底物显示液进行底物显色；
67.向酶标板或ep管内加入底物显色液(tmb浓度为250μg/ml)，100μl/每孔，37℃孵育10min；
68.s7：通过elisa终止液终止双抗体夹心免疫反应得到夹心免疫反应液；
69.向所述酶标板或ep管内中加入2m浓硫酸终止液，50μl/每孔或50μl/每管；
70.s8：通过金纳米棒溶液对夹心免疫反应液进行aunrs蚀刻；
71.向所述酶标板或ep管中加入金纳米棒溶液，80μl/每孔或80μl/每管，37℃孵育10min，裸眼观察和手机拍照记录实验结果。
72.所述金纳米棒溶液为种子液介导法制备的aunrs溶液(横向吸收峰510nm左右，纵向吸收峰750nm左右)。
73.所述金纳米棒溶液的制备过程包括以下步骤：
74.(1)制备种子液；
75.所述种子液是通过向十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中依次加入氯金酸(haucl4)溶液以及硼氢化钠溶液制得的。
76.在锥形瓶中，加入十六烷基三甲基溴化铵(ctab)加热充分溶解后得到十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液，加入适量氯金酸(haucl4)溶液，搅拌混匀，将量取的硼氢化钠溶液混入，溶液逐渐变成金黄色，再继续搅拌5min，37℃水浴中静置30min，待种子液变为茶褐色即可；其中，氯金酸(haucl4)溶液中的氯金酸与十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中的ctab的摩尔比为1:500；氯金酸(haucl4)溶液中氯金酸与硼氢化钠溶液中的硼氢化钠的摩尔比为1:20。
77.在种子液制备中，氯金酸溶液的摩尔浓度为0.5mmol/l，所述ctab溶液的摩尔浓度为0.2mol/l，所述硼氢化钠溶液的摩尔浓度为0.01mol/l。
78.步骤(1)中，加入的硼氢化钠溶液为冰水新鲜配置的硼氢化钠溶液，温度不可过高。
79.(2)制备种子生长液；
80.所述种子生长液是通过向十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中依次加入5-溴水杨酸溶液、硝酸银(agno3)溶液、氯金酸(haucl4)溶液以及抗坏血酸(aa)溶液制得的。
81.在烧杯中，加入十六烷基三甲基溴化铵(ctab)加热充分溶解后得到十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液，混入5-溴水杨酸溶液，充分搅拌混匀，加入量取的硝酸银(agno3)溶液混匀后，加入配备好的氯金酸(haucl4)溶液混匀，颜色逐渐变为金黄色后，加入新鲜配制的抗坏血酸(aa)溶液，混匀60s溶液颜色由橘红色变成无色。
82.在种子生长液配制中，氯金酸(haucl4)溶液的摩尔浓度为1mmol/l。十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液的摩尔浓度为0.09mol/l。5-溴水杨酸溶液的摩尔浓度为0.02mol/l。抗坏血酸(aa)溶液的摩尔浓度为0.060mol/l。所述硝酸银(agno3)溶液的摩尔浓度为0.004mol/l。
83.(3)将种子液加入到种子生长液中搅拌均匀并经孵育得到金纳米棒溶液；
84.将种子液加入到种子生长液中继续搅拌1min～2min，再放入37℃文温箱中静置12h，得到酒红色溶液，即为金纳米棒溶液。
85.其中，种子生长液中氯金酸(haucl4)溶液中的氯金酸与十六烷基三甲基溴化铵(ctab)溶液中的ctab、硝酸银(agno3)溶液中的硝酸银、抗坏血酸(aa)溶液中的抗坏血酸、5-溴水杨酸溶液中的5-溴水杨酸的摩尔比分别为1:90、1:4、1:60、1:20。
86.对金纳米棒溶液通过高速离心纯化得到aunrs。
87.离心纯化为在转速为12000rpm/min、温度为25℃下离心15min。离心纯化后用纯水定容至50ml备用。
88.检测试剂盒采用一种酶联免疫吸附分析检测方法，具体检测原理是：纳米磁珠应用于elisa体系，可借助其大的比表面积和生物相容性、制备磁性纳米探针，用于后续的elisa的均相反应，加速反应和反应更充分，缩短洗涤时间；aunrs具备特有的光学性质，当无色的tmb底物在遇到hrp以后被氧化成蓝色tmb
2+
，加入终止液后，颜色变为黄色，在br-、酸性环境和ctab存在的情况下，tmb
2+
可以使aunrs发生快速蚀刻，在ctab充足的条件下，这种氧化过程能够有选择地发生在aunrs的两末端，而直径几乎不变，这就使得容液颜色发生肉
眼可见的变化。
89.实施例二：
90.nt-probnp裸眼检测标准曲线的建立
91.采用5％bsa的0.01m ph7.4 pbs缓冲液配制不同浓度的nt-probnp抗原溶液作为待检测抗原样品进行实施例一的检测试剂盒的检测，其中，nt-probnp抗原的用量分别为:50ng/ml、25ng/ml、12.5ng/ml、6.25ng/ml、3.12ng/ml、1.50ng/ml、750pg/ml和阴性，
92.从图2结果可以看出，不同nt-probnp浓度反应产生不同颜色，由抗原含量高至低颜色变化分别为依次分别为黄色
→
淡黄色
→
淡蓝色
→
蓝色
→
橘红色
→
酒红色，其中阴性对照未发蚀刻反应，颜色无变化，由此可得裸眼检测效果可达到1.5ng/ml，检测范围为1.5ng/ml-50ng/ml。
93.实施例三：
94.nt-probnp裸眼检测检测方法特异性实验
95.取4支1.5ml的离心管，每管分别加入用5％bsa稀释，浓度为100ng/ml的蛋白saa、hbp、crp、p1和阴性对照(1％tween 20的ph7.4 pbs缓冲液)各取100μl作为待检测抗原样品进行实施例一的检测试剂盒的检测。
96.其它步骤同实施例二的标准曲线检测，加入nt-probnp抗原溶液时更换为上述1.5ml的离心管的蛋白溶液和阴性对照溶液，其余步骤相同。
97.结果见图3所示，这些蛋白都没有引起金纳米棒的发生蚀刻现象。因此可以证明本检测试剂盒对nt-probnp具有很好特异性。
98.本检测试剂盒构建基于磁性纳米探针和金纳米棒蚀刻elisa体系裸眼检测人n端脑钠肽前体检测检测方法，所有反应时间总共1h，大大缩短elisa检测时间，且结果呈现多色和裸眼检测。
99.本检测试剂盒利用纳米磁珠(mbs)和金纳米棒(aunrs)用于检测人n端脑钠肽前体均相多色裸眼检测，主要是基于纳米磁珠的超顺磁性、大的比表面积和均相反应和金纳米棒(aunrs)被蚀刻后多色显色的特性和elisa双抗体夹心原理，属于分析测试领域。
100.本检测试剂盒使用操作简便，反应时间短(总反应时间1h)、特异性高、无需昂贵仪器和裸眼比色检测的优点，为人血清中nt-pro bnp的检测提供一种新的检测手段，易于在非实验室及条件落后的户外地区推广和使用。
101.本检测试剂盒解决检测过程中存在依赖大型仪器、高成本、需专业人员检测等问题，提供一种检测低成本，无需大型仪器及专业人员，可实现裸眼对人nt-pro bnp浓度检测，可用于心力衰竭标志物。与传统的elisa相比，本检测试剂盒将纳米磁珠和金纳米棒引入elisa检测体系，采取均相反应体系，大大缩短反应时间；同时借助外界磁力架，达到快速洗涤目的；另外，我们将elisa体系的封闭一步与抗原加入融为一步，即比传统的elisa方法减少1h封闭时间，大大缩短检测时间，所有反应时间总计为1h，远低于传统elisa的常规4h10min(包被抗体37℃1h，抗原反应37℃1h，封闭37℃1h，辣根过氧化物酶(hrp)标记抗体37℃1h，底物作用时间37℃10min)。且传统elisa最后显色为单个黄色，而本检测试剂盒实现多色检测，在制备好标准色卡后，可以进行裸眼检测，如ph试纸一样，通过颜色即可知道nt-pro bnp含量，体现快速、简单和实用。
102.本检测试剂盒检测nt-pro bnp具有均相反应、快速、特异性高及裸眼检测，适用于
实时检测，实现对nt-pro bnp浓度在1.5ng/ml-50ng/ml进行半定量检测，且不需要大型昂贵的仪和专业的技术人员，整体反应时间仅仅只需1h，大大缩短检测时间和反应时间。其可用心力衰竭标志物nt-pro bnp浓度的测定，易于在非实验室及条件落后的户外地区推广和使用。
103.以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。