一种用于无标签DNA检测的表面增强拉曼散射基底及其制备方法与应用

一种用于无标签dna检测的表面增强拉曼散射基底及其制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及生物分子检测技术领域，具体涉及一种用于无标签dna检测的表面增强拉曼散射基底及其制备方法与应用。


背景技术：

2.表面增强拉曼散射(surface-enhanced raman scattering,sers)作为一种能够提供化学和生物分子结构指纹信息的光谱分析技术，已被广泛应用于生物分子识别和医学诊断等领域。sers增强机理主要源于局域表面等离子体共振(localized surface plasmon resonance,lspr)的物理增强以及粗糙表面和探测分子之间电荷转移产生类共振拉曼现象的化学增强，前者起主要作用。贵金属纳米粒子和纳米结构通过金属表面电子的振荡产生lspr并诱导共振光吸收，这就放大了表面周围的电磁场，使目标分子处于等离子体纳米聚集体之间的间隙(“热点”)时增强电场，拉曼散射信号增强10
8-10
10
倍。与单金属sers基底相比，au/ag双金属衬底由于spr波段可调且较宽，可以产生更多的“热点”，增强能力与“热点”的数量以及底物与分析物的吸附能力密切相关。通过不同的方法可以制备出具有足够“热点”的三维sers衬底，如电化学沉积法、磁控溅射法、模板法和倾斜角沉积法(oblique angle deposition,oad)等均可以被用来制备不同的纳米材料。此外，通过适当有效的方法用某种化学物质修饰基底表面，可以增强基底对分析物的捕获能力，通过调节化学增强机制即基底表面与被分析分子之间的相互作用来提高sers基底的活性。
3.二维纳米材料具有许多独特的特性和性能，为sers研究提供了新的可能性。二维材料和金属纳米结构形成的三维纳米结构由于其高的表面体积比、对有机分子的有效吸附以及建立的可调谐的表面等离子体共振在波长范围内与激发激光相匹配，是sers的优良基底。此外，二维材料在化学机制中表现出优异的sers效应，其可以有效抑制分析物的背景荧光，有利于收集清晰、真实的拉曼信号。二硫化钼(molybdenum disulfide,mos2)作为一种具有代表性的二维材料，其独特的物理化学性质可以促进与纳米结构的静电相互作用。根据电子和光学特性，可以实现可调谐的等离子体色散，是理想的候选等离子体传感器。人们已广泛研究mos2，以开发其在场效应晶体管、光学探测器、电容和传感器等方面的应用潜力。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一是提供一种用于无标签dna检测的表面增强拉曼散射基底。
5.本发明的目的之二是提供上述用于无标签dna检测的表面增强拉曼散射基底的制备方法。
6.本发明的目的之三是提供上述用于无标签dna检测的表面增强拉曼散射基底的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
8.第一方面，本发明提供一种用于无标签dna检测的表面增强拉曼散射基底，所述基底是金银纳米颗粒双金属衬底，银纳米颗粒表面包覆mos2层，金纳米颗粒位于mos2层的上方，其中，银纳米颗粒直径为80-100nm，金纳米颗粒直径为100nm，mos2层的厚度为0.65nm。
9.第二方面，本发明提供上述用于无标签dna检测的表面增强拉曼散射基底的制备方法，包括如下步骤：
10.s1：将切割成方形基板的玻璃片或者硅片洗净，吹干，固定在沉积室中的样品台上，当沉积室压力达到5
×
10-8
torr时，通过高压和电子束蒸发，在玻璃片上先后沉积一层10nm的钛薄膜和一层10nm的银薄膜，得到厚度均匀的银纳米薄膜agnf；
11.s2：将银纳米薄膜agnf放置管式炉中进行500℃，30min的退火热处理，得到直径为80-100nm的银纳米颗粒agnp；
12.s3：配制前驱体(nh4)2mos4溶液并将其旋涂至银纳米颗粒agnp表面，真空干燥，然后放置管式炉中进行500℃，90min的退火热处理，制备mos2层修饰银纳米颗粒双层mos2@agnp；
13.s4：利用种子生长法制备直径为100nm的金纳米颗粒溶液，将其稀释并滴加在mos2@agnps双层结构上，获得aunp@mos2@agnp三维结构。
14.优选的，步骤s1中，所述钛薄膜和银薄膜的沉积步骤：设置蒸汽源相对于样品台法线的入射角为0
°
，以的速率沉积10nm的钛靶材，得到钛薄膜；然后设置样品台处于自转状态，以的速率沉积10nm的银靶材，得到银薄膜。
15.优选的，步骤s3中，所述前驱体(nh4)2mos4溶液的配制过程如下：(nh4)2mos4固体粉末溶于二甲基甲酰胺中，并超声30min形成1wt％的前驱体溶液。
16.优选的，步骤s3中，所述旋涂过程为先以先以转速为600rpm旋转30s再以转速为2000rpm旋转1min，形成均匀的膜层。
17.优选的，步骤s3中，所述真空干燥的温度为80℃。
18.优选的，步骤s2和步骤s3中，所述退火的升温速率为2℃/min。
19.第三方面，本发明提供上述用于无标签dna检测的表面增强拉曼散射基底在dna序列检测方面的应用。
20.dna序列如下，腺嘌呤(a):5'-aaa aaa aaa-3'；胞嘧啶(c):5'-ccc ccc ccc-3'；dna探针:5'-ggc att cag cat-3'；互补dna探针：5'-atg ctg aat gcc-3'；非互补dna探针：5'-atc cat gcc atg-3'。拉曼光谱仪的检测参数如下：激发波长为785nm，积分时间设置为10s，激光功率设置为30mw，光谱探测范围350-1800cm-1
，检测结果为样品点九个随机位置处的平均光谱。
21.与现有技术相比，本发明的sers基底结合了双金属纳米材料和二维材料的优点，具有更加密集的“热点”，增强效果显著、重复性好、可大规模生产，可用于无标签dna的快速、高灵敏度检测，促进了单分子水平的dna鉴别。
附图说明
22.图1是本发明制备的aunp@mos2@agnp基底的扫描电子显微镜图片；
23.图2是aunp@mos2@agnp基底对碱基进行检测的sers光谱图；
24.图3是aunp@mos2@agnp基底对特定dna序列进行检测的sers光谱图。
具体实施方式
25.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
26.实施例1：aunp@mos2@agnp基底的制备
27.一种用于无标签dna检测的表面增强拉曼散射基底的制备方法及其应用，包括以下步骤：
28.(1)使用基于oad技术的电子束沉积系统制备银纳米膜(silver nanofilm,agnf)结构。首先将玻璃片切割成0.8cm
×
0.8cm方形基板，三次超声洗净后用氮气吹干，将其固定在沉积室样品台的表面上，当沉积室的压力达到5
×
10-8
torr时，开始蒸镀。首先，将蒸汽源相对于样品台法线的入射角设置为0
°
，然后以的速率沉积10nm的钛靶材作为银结构和玻璃基板的连接剂，最后设置样品台不停地自转，以的速率沉积10nm的银靶材，形成agnf。
29.(2)将agnf放置于管式炉中，设置退火程序：以每分钟升高2℃的速率将炉内温度从室温缓慢升至500℃，恒温保持30min。最后关闭程序，使管式炉自然冷却至室温。热退火使得agnf重结晶形成银纳米颗粒(silver nanoparticle,agnp)，直径为80-100nm。
30.(3)将(nh4)2mos4固体粉末(纯度99.99％，0.01g)加入1ml的二甲基甲酰胺(dmf)溶剂中，并超声30min以确保完全溶解，形成1wt％的(nh4)2mos4溶液。将(nh4)2mos4溶液旋涂在agnp上先以转速为600rpm旋转30s再以转速为2000rpm旋转1min，形成均匀的膜层之后，然后置于80℃的真空干燥箱中烘干；再次放置于管式炉中进行退火处理，设置退火程序：以每分钟升高2℃的速率将炉内温度从室温缓慢升至500℃，恒温保持90min。最后关闭程序，使管式炉自然冷却至室温。热退火使得(nh4)2mos4溶液重结晶形成mos2，获得mos2@agnp双层结构。
31.(4)利用种子生长法形成的直径为100nm左右的金纳米颗粒(gold nanoparticle,aunp)，将其稀释并滴加在mos2@agnps双层结构上，获得aunp@mos2@agnp三维结构。
32.图1为aunp@mos2@agnp三维结构的sem图，从图上可以看出，agnp与aunp呈现“肩并肩”结构，mos2薄层覆在agnp表面，这有利于检测物掉入结构的缝隙中，实现高灵敏度sers检测。
33.实施例2：碱基及dna探针的sers检测
34.设置激光波长为785nm，积分时间为10s，激光功率为30mw，每次滴加体积为2μl的aunp和dna的混合溶液在aunp@mos2@agnp基底上，任意扫描九个点取平均值。(dna序列如下，腺嘌呤(a):5'-aaa aaa aaa-3'；胞嘧啶(c):5'-ccc ccc ccc-3'；dna探针:5'-ggc att cag cat-3'；互补dna探针：5'-atg ctg aat gcc-3'；非互补dna探针：5'-atc cat gcc atg-3'。底物与dna结合的方法如下：首先，将体积为50μl，浓度为200nm的dna与aunp混合过夜孵育，然后，将aunp和dna的混合溶液先以转速为600rpm旋转30s再以转速为2000rpm旋转1min旋涂在aunp@mos2@agnp基底表面，待其自然风干。
35.图2为aunp@mos2@agnp基底对碱基进行检测的sers光谱图，结果可以清晰识别出腺嘌呤和胞嘧啶的特征峰。
36.图3为aunp@mos2@agnp基底对特定dna序列进行检测的sers光谱图，结果表明目标dna探针分子与其互补以及错配dna结合之后的特征峰不同，实现了单分子水平的dna鉴别。
37.本发明的sers基底具有更密集的“热点”，增强效果显著、重复性好、可大规模生产，可用于无标签dna的快速、高灵敏度检测，促进了单分子水平的dna鉴别。