酰胺类农业杀菌剂的限量检测方法与流程

1.本发明涉及食品农药残留检测技术领域，具体涉及一种酰胺类农业杀菌剂的限量检测方法。


背景技术：

2.酰胺类农业杀菌剂是近年来农作物种植过程中常用的一类高效农药，例如氟吡菌胺、环酰菌胺和氟唑菌酰胺等，以及在2019年获得正式登记农药包括氟唑菌酰羟胺、苯并烯氟菌唑、环氟菌胺等，这类杀菌剂可有效防治农作物霜霉病、菌核病和叶斑病等病害，广泛应用于蔬菜、果树和大田作物等病害的防治。然而随着杀菌剂使用量和使用作物范围的不断扩大，尤其在一些生长周期较短、农药用量较多的蔬菜水果中，这些新型杀菌剂的残留问题逐渐受到人们的广泛关注。
3.最新版的国标gb2763-2021《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中未对这些新型酰胺类杀菌剂农药规定其检测方法，虽然现有专利中存在某些酰胺类杀菌剂的检测方法，如专利cn104713977b所公开的葡萄酒中多种吡唑类杀菌剂的固相萃取-液相色谱-串联质谱检测方法，但是该方法仅适用于带有吡唑基团的杀菌剂检测，并不适用于其他新型酰胺类杀菌剂的检测，因此亟需开发一种快速准确的多种酰胺类杀菌剂残留检测的方法。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种检测效率高，且适用于13种酰胺类农业杀菌剂的限量检测方法。
5.为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：酰胺类农业杀菌剂的限量检测方法，包括如下步骤：
6.s1、获取各酰胺类农业杀菌剂的标准曲线；
7.s2、将样品经乙腈和quechers萃取盐包提取后进行离心，将离心后的上清液加入净化填料中进行净化，并通过gc-ms/ms获得样品数据；
8.s3、根据所述样品数据和所述标准曲线，以外标定法定量样品中酰胺类农业杀菌剂的限量。
9.本发明的有益效果在于：本发明所提供的酰胺类农业杀菌剂的限量检测方法检测对象为蔬菜水果，样品前处理简单快速，能够准确测定样品中酰胺类农业杀菌剂的残留浓度，方法定量限可达到0.005mg/kg或0.01mg/kg，在不同样品中13种酰胺类农业杀菌剂在三种加标水平下的平均回收率在71.6％～112.1％，相对标准偏差均在15％以下，适合于标准化，同时也可实现对13种酰胺类农业杀菌剂进行同时检测。
附图说明
10.图1所示为本发明在实施例1中氟吡菌酰胺标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应
检测(mrm)色谱图；
11.图2所示为本发明在实施例1中苯氧菌胺标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图；
12.图3所示为本发明在实施例1中环氟菌胺标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图；
13.图4所示为本发明在实施例1中环酰菌胺标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图；
14.图5所示为本发明在实施例1中pyriofenone标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图；
15.图6所示为本发明在实施例1中氟唑菌酰胺标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图；
16.图7所示为本发明在实施例1中氟唑环菌胺标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图；
17.图8所示为本发明在实施例1中异丙噻菌胺标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图；
18.图9所示为本发明在实施例1中吡唑萘菌胺标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图；
19.图10所示为本发明在实施例1中氟唑菌酰羟胺标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图；
20.图11所示为本发明在实施例1中联苯吡菌胺标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图；
21.图12所示为本发明在实施例1中氟噻唑菌腈标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图；
22.图13所示为本发明在实施例1中苯并烯氟菌唑标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图。
23.图14为本发明在对比例5中采用不同净化填料净化后的样品待测液颜色对比图。
具体实施方式
24.为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
25.由于蔬菜水果基质中主要的干扰物为有机酸、色素、碳水化合物、甾醇等，因此在农残检测前需要对蔬菜水果基质进行净化，常用的净化材料包括c18、psa、无水硫酸镁和gcb等。其中，c18用于吸附样品中的脂类物质和一些非极性干扰物；psa用于吸附提取液中的极性成分，如脂肪酸、有机酸、酚类以及色素等；gcb主要用于去除基质中的色素，由于其具有强吸附性，导致部分待测物回收率低。
26.因此，本发明基于不同的蔬菜水果(蔬果)基质种类，在提取液中所加入的psa和无水硫酸镁用量不变的前提下，选择不同的gcb用量去除色素等杂质的同时，提高净化效果以及提高待测物的回收率。
27.具体而言，用于检测酰胺类杀菌剂限量的蔬菜水果基质样品在本发明中可分为三
类，即无色或浅色蔬果样品、一般颜色蔬果样品和深色蔬果样品。其中，所述无色或浅色蔬果样品包括马铃薯、大白菜等，此时选用净化填料为100mgpsa和600mg无水硫酸镁对样品进行净化处理。所述一般颜色蔬果样品包括上海青、芹菜、葡萄、草莓等，此时选用净化填料为100mgpsa、600mg无水硫酸镁和30mggcb对样品进行净化处理。所述深色蔬果样品包括油麦菜、菠菜等，此时选用净化填料为100mgpsa、600mg无水硫酸镁和60mggcb对样品进行净化处理。通过此种分类净化的方式，可有效提高杂质去除率，即提高净化效果的同时，提高待测物的回收率。
28.在一种实施方式中，酰胺类农业杀菌剂的限量检测方法，包括如下步骤：
29.s1、获取各酰胺类农业杀菌剂的标准曲线；
30.s2、将样品加入乙腈和quechers萃取盐包经涡旋振荡5min和超声5min提取后进行离心，将离心后的上清液加入净化填料进行净化，并过滤膜后通过gc-ms/ms获得样品数据；
31.s3、根据所述样品数据和所述标准曲线，以外标定法定量样品中酰胺类农业杀菌剂的限量。
32.其中，所述酰胺类农业杀菌剂包括fluopyram(氟吡菌酰胺)、metominostrobin(苯氧菌胺)、cyflufenamid(环氟菌胺)、fenhexamid(环酰菌胺)、pyriofenone、fluxapyroxad(氟唑菌酰胺)、sedaxane(氟唑环菌胺)、isofetamid(异丙噻菌胺)、isopyrazam(吡唑萘菌胺)、pydiflumetofen(氟唑菌酰羟胺)、bixafen(联苯吡菌胺)、flutianil(氟噻唑菌腈)、benzovindi-flupyr(苯并烯氟菌唑)。
33.在一种实施方式中，所述s2具体为：将样品剪碎后研磨成匀浆，将样品称取在50ml离心管中，加入乙腈和quechers萃取盐包，涡旋震荡并超声提取后离心，取上清液于装有净化填料的15ml离心管中，涡旋震荡后离心，取上清液过滤膜后，进行gc-ms/ms检测，获得样品数据。
34.其中，所述quechers萃取盐包具体由4g无水硫酸镁、1g氯化钠、1g柠檬酸钠和0.5g柠檬酸氢二钠所组成。
35.所述涡旋震荡的条件为：转速1500～3000rpm，运行时间5min；所述超声提取的条件为：提取时间5～10min；所述离心的条件为：转速6000～10000rpm，离心时间3～8min。
36.优选地，所述滤膜为有机相滤膜。更优选地，所述滤膜为0.22μm有机相滤膜。
37.在一种优选的实施方式中，其中gc的检测条件为：色谱柱：tg-5silms色谱柱，30m
×
250μm
×
0.25μm；
38.升温程序：100℃保持5min，以15℃/min升温至130℃，再以10℃/min升温至220℃，最后以5℃/min升温至300℃保持5min，运行时间36.5min；
39.载气：纯度≥99.999％氦气，流速1.2ml/min；
40.进样方式：不分流进样，进样体积1μl，进样口温度250℃，接口温度280℃。
41.所述ms/ms的检测条件为：
42.电子轰击离子源，离子源温度30℃，电离能量70ev，溶剂延迟时间5.0min，多反应监测模式。
43.其中，13种前述酰胺类农用杀菌剂的定性离子对和定量离子对如下表1所示：
44.表1
[0045][0046][0047]
在一种实施方式中，所述获取各酰胺类农业杀菌剂的标准曲线具体为：准确称取适量标准物质，用乙腈稀释成1000mg/l的标准储备液，-20℃下保存，有效期为一年；将单一标准溶液用乙腈配制成10mg/l的标准混合中间液，测试时加入到空白基质提取液(即为不含待测物的阴性样品按照前述s2的具体步骤所提取净化后的溶液)中配制成浓度为0.005～0.5mg/l的标准混合工作溶液，标准混合工作溶液应临用现配。将不同浓度的标准混合工作溶液以前述色谱(gc)和质谱(ms/ms)的具体检测条件获得标准工作液色谱峰，以标准混合工作溶液中的待测物的质量浓度x为横坐标、上述标准混合工作溶液色谱峰的面积y为纵坐标，绘制标准混合工作溶液的回归曲线，其中x的单位为mg/l，根据标准曲线用外标法定量待测物浓度。
[0048]
实施例1
[0049]
图1至图13显示13种酰胺类农业杀菌剂标准混合工作溶液(0.5mg/l)的多反应检测(mrm)色谱图。
[0050]
其中，所采用的气相色谱的检测条件为：tg-5silms色谱柱(30m
×
250μm
×
0.25μm)；升温程序：100℃保持5min，以15℃/min升温至130℃，再以10℃/min升温至220℃，最后以5℃/min升温至300℃保持5min，运行时间36.5min；载气：氦气(纯度≥99.999％)，流速1.2ml/min；不分流进样，进样体积1μl，进样口温度250℃，接口温度280℃。
[0051]
所采用的质谱的具体条件为：电子轰击离子源(ei)，离子源温度300℃，电离能量
70ev，溶剂延迟时间5.0min，多反应监测(mrm)模式。13种酰胺类杀菌剂的定性离子对和定量离子对如表1所示。
[0052]
具体的，以不含上述13种酰胺类杀菌剂的大白菜作为阴性样品，将样品剪碎后研磨成匀浆，将样品加入乙腈和quechers萃取盐包中，涡旋震荡并超声提取后离心，取上清液于净化填料中，涡旋震荡后离心，取上清液过滤膜后获得空白基质提取液，并按前述方法获得标准混合工作溶液(浓度为0.5mg/l)。其中，所述涡旋震荡的条件为：转速3000rpm，运行时间5min；所述超声提取的条件为：提取时间5min；所述离心的条件为：转速6000rpm，离心时间3min。通过产物离子模式对标准混合工作溶液进行检测，在不同的碰撞能量(5～40v)下对多反应监测(mrm)方法进行优化，确定各组分的产物离子信息和最佳的碰撞能量，具体参见表1。优化后的各组分多反应监测色谱图如图1至13所示。
[0053]
实施例2
[0054]
在实施例1的基础上，将空白基质提取液配制质量浓度为0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5mg/l的标准混合工作溶液，在前述色谱和质谱条件下进行检测，并以目标物(酰胺类农用杀菌剂)的定量离子对的峰面积和对应的质量浓度绘制标准曲线和线性方程，以回收率为60～120％的最低添加水平确定为本方法的定量限(loq)。具体数据参见表2所示。其中，13种酰胺类农业杀菌剂在各自的质量浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.997，定量限根据不同目标物响应分别为0.1和0.005mg/kg。
[0055]
表2
[0056][0057]
[0058]
实施例3
[0059]
在实施例1和实施例2的基础上，以不含上述13种酰胺类杀菌剂的大白菜、上海青和菠菜作为阴性样品分别进行0.01、0.05和0.5mg/kg三个浓度水平的加标实验，每个浓度的样品做两个平行试验。实验结果表明：当添加水平为0.01mg/kg时，平均加标回收率为71.6～112.1％；当添加水平为0.05mg/kg和0.5mg/kg时，平均加标回收率为77.1～102.4％和80.2～108.4％。三种加标水平的回收率相对标准偏差均在15％以下，即表明本发明所提供的酰胺类农业杀菌剂的限量检测方法的准确度和精密度较好。
[0060]
实施例4
[0061]
从农贸市场、超市等随机采集120批次蔬果样品，其中大白菜、菠菜、芹菜、上海青、油麦菜和土豆各20批次，葡萄20批次和草莓10批次。在实施例1和实施例2的基础上分别进行酰胺类农业杀菌剂的限量检测。结果显示，150批蔬菜水果中有47批次有检出杀菌剂残留。其中油麦菜为检出率最高的样品，20批次中检出12批次杀菌剂残留，检出值为0.01～0.89mg/kg不等；芹菜的杀菌剂检出项目最多，20批次样品中有8批次检出，检测到34项次杀菌剂残留，检出值为0.01～1.44mg/kg不等，其中2批次芹菜分别检出了12种和13种酰胺类杀菌剂残留。
[0062]
对比例5：quechers-gc-ms/ms法测定蔬菜水果中的13种杀菌剂残留——样品净化条件的比较。
[0063]
由于蔬菜水果基质中主要的干扰物为有机酸、色素、碳水化合物、甾醇等，这些物质难以气化，容易污染仪器进样系统和离子源而降低仪器灵敏度，因此在上机检测前需要对蔬菜水果基质的提取液进行净化。在现行的蔬菜水果农药残留检测的国家标准gb 23200.8-2016、gb 23200.116-2019中，样品的净化通过液液萃取或者固相萃取的方式，需要浓缩、淋洗、洗脱等步骤，操作繁琐且溶剂用量大。本法采用quechers法对提取液进行净化，高效简便。本发明基于不同的蔬菜水果基质种类，在提取液中所加入的psa和无水硫酸镁用量不变的前提下，选择不同的gcb用量。去除色素等杂质的同时，提高净化效果并保证目标物的回收率。本实验分别比较了一般颜色蔬果样品(上海青)和深色蔬果样品(菠菜)的四种净化条件，探究其去除样品提取液中色素等杂质的能力，两种样品的净化条件见表3所示。
[0064]
表3
[0065][0066]
经过不同净化填料净化后的样品待测液，溶液颜色对比见图14，可以看出添加gcb越多，去除色素效果越好，溶液颜色越浅。在上述实验基础上，考察了两种样品在四个净化条件下的回收率情况。分别在四个阴性上海青样品和四个阴性菠菜样品中添加浓度为0.10mg/kg的13种杀菌剂，利用不同条件净化上机检测后计算得到回收率结果如表4所示，上海青样品在四种净化条件(gcb添加量分别为10mg、20mg、30mg和40mg)的回收率分别在89.4％～105.4％、85.0％～106.1％、84.1％～100.2％和69.5％～86.0％之间，菠菜样品在四种净化条件(gcb添加量分别为20mg、40mg、60mg和80mg)的回收率分别在80.2％～106.7％、86.4％～100.1％、82.5％～96.2％和68.2％～86.4之间。综合考虑色素去除效果和加标回收率，本方法选择3号(100mgpsa、600mg无水硫酸镁、30mggcb)和7号(100mgpsa、600mg无水硫酸镁、60mggcb)待测液的净化条件分别作为一般颜色蔬菜水果和深色蔬菜水果的净化条件。通过分类净化的方式，可有效提高杂质去除率，保证回收率的同时提高净化效果，减少仪器污染。
[0067]
表4
[0068][0069]
综上所述，本发明所提供的酰胺类农业杀菌剂的限量检测方法检测对象为蔬菜水果，样品前处理简单快速，能够准确测定样品中酰胺类农业杀菌剂的残留浓度，方法定量限可达到0.005mg/kg或0.01mg/kg，在不同样品中13种酰胺类农业杀菌剂在三种加标水平下的平均回收率在71.6％～112.1％，相对标准偏差均在15％以下，适合于标准化。
[0070]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。