自身免疫性肝病相关抗体的检测试剂盒及检测方法与流程

1.本发明涉及试剂盒领域，尤其涉及一种自身免疫性肝病相关抗体的检测试剂盒及其检测方法。


背景技术：

2.目前，随着医疗技术越来越发达，关于肝病的治疗和检测也有了很大的进步。其中，检测多种肝特异和系统性抗原的自身抗体对于诊断自身免疫性肝病(aild)非常重要。已经建立多种检测方法用于检测，比如间接免疫荧光法、免疫印迹和酶联免疫吸附法。特别推荐间接免疫荧光马赛克和免疫印迹法用于多指标筛选。
3.为了准确诊断自身免疫性肝病，必须排除以下病症：病毒性肝炎(甲乙丙丁戊型)、合并其他感染的肝炎、中毒性肝炎(比如由药物或酒精导致的)、代谢性肝病和遗传性肝病。
4.自身免疫性肝病(aild)是一类病因尚不明确，具有自身免疫基础的非化脓性炎症性肝病。根据主要受累的肝细胞类型不同，分为两大类，即肝细胞受累的自身免疫性肝炎、胆管细胞受累的自身免疫性胆管病。自身免疫性肝脏疾病(aild)包括自身免疫性肝炎(aih)、原发性胆汁性肝硬化(pbc)、原发性硬化性胆管炎(psc)。aih相关自身抗体主要包括抗核抗体(ana)、抗平滑肌抗体(sma)、抗肝肾微粒体-1(lkm-1)抗体、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原(sla/lp)抗体、抗肝细胞溶质抗原-1(lc-1)抗体等。pbc相关自身抗体主要包括抗线粒体抗体(ama)、pbc特异性ana[间接免疫荧光法检测ana主要为核点型(nuclear dots)或核膜型(perinuclear rims)，ana特异性自身抗体主要为抗可溶性酸性磷酸化核蛋白100(sp100)抗体或抗跨膜糖蛋白210(gp210)抗体]等。psc相关自身抗体主要包括核周型抗中性粒细胞胞质抗体(panca)等。此外，还有可能发生重叠综合征，如两种不同的自身免疫性肝病同时出现或者一种自身免疫性肝病合并另一种自身免疫性疾病，如系统性硬化症。因此，一种方便快速的自身免疫性肝病抗体的检测诊断与分类很有必要。


技术实现要素：

[0005]
发明目的：本发明提供了一种自身免疫性肝病相关抗体的检测试剂盒及其检测方法，该检测试剂盒能够快速通过免疫印迹法进行体外半定量检测人血清或血浆中自身免疫性肝病相关抗体的检测问题。主要用于自身免疫性肝病的诊断与分类，亦有助于重叠综合征的诊断。
[0006]
技术方案：本发明的自身免疫性肝病相关抗体的检测试剂盒，包括平行包被有抗原的检测膜条、酶结合物、样本缓冲液及底物液。
[0007]
其中，所述检测膜条抗原带上平行包被的抗原包括ama-m2(丙酮酸脱氢酶复合物)、m2-3e(bpo)(线粒体内膜a-2-酮酸脱氢酶e2亚基的融合蛋白)、lkm-1(肝肾微粒体；细胞色素p450
ꢀⅱ
d6)、lc-1(细胞浆肝抗原1；亚胺[代]甲基转移酶-环化脱氨酶)、sla/lp(可溶性肝抗原-肝胰抗原)、sp100(核颗粒蛋白，核点)、gp210(核膜整合蛋白，核孔复合物)、核周型抗中性粒细胞胞质抗体(panca)、抗平滑肌抗体(sma)和ro-52中的至少两种。
[0008]
所述检测膜条上抗原带平行包被的抗原还包括pml(早幼粒细胞白血病蛋白，核点)，但是，pml的检测结果仅供研究，不用于临床诊断。
[0009]
m2抗原是从牛心中提取的天然抗原，主要组分是丙酮酸脱氢酶复合物e2亚基(74kda)。
[0010]
m2-3e(bpo)抗原是在e.coli中表达的重组融合蛋白，包含了下列3种酶的e2亚基的抗原位点：支链2-酮酸脱氢酶(bcoadh)、丙酮酸脱氢酶(pdh)和2-酮戊二酸脱氢酶(ogdh)共同组成，故而称为m2-3e(bpo)。
[0011]
sp100和pml抗原是早幼粒细胞白血病核质体(pml-nb)的组份。在e.coli中表达的sp100和pml抗原的人cdna。
[0012]
gp210抗原是核孔复合物(npc)的整合蛋白。在e.coli中表达了gp210抗原的人cdna。
[0013]
lkm-1抗原位于肝脏和肾脏的微粒体部分，靶抗原是细胞色素p450 ii d6。以杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达的lkm-1抗原的人cdna。
[0014]
以杆状病毒为载体，在昆虫细胞中表达了lc-1抗原(亚胺[代]甲基转移酶-环化脱氨酶)的人cdna。
[0015]
重组sla/lp(uga-抑制子-trna相关蛋白)抗原来源于人cdna在大肠杆菌中表达。
[0016]
ro-52为重组ro-52(52kda)，以杆状病毒为载体在昆虫细胞中表达的ro-52抗原。
[0017]
其检测膜条抗原带上包被的抗原优选组合方式有以下两种：
[0018]
(1)ama-m2、m2-3e(bpo)、lkm-1、lc-1、sla/lp、sp100、gp210、pml、panca、sma和ro-52；
[0019]
(2)ama-m2、m2-3e(bpo)、lkm-1、lc-1、panca、sma和sla/lp。
[0020]
所述酶结合物包括碱性磷酸酶标记的羊抗人igg、igm及iga中的一种或几种。
[0021]
其中，酶结合物的ph值为7-7.1，还包括三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、氯化钠、bsa(牛血清白蛋白)、蔗糖、防腐剂(proclin 300)、brij 35(月桂醇聚氧乙烯醚)、对乙酰氨基酚、硫酸庆大霉素、吐温20。
[0022]
每升酶结合物中各成分的含量为：三(羟甲基)氨基甲烷(tris)5.451-6.663g、氯化钠8.1-9.9g、bsa(牛血清白蛋白)22.5-27.5g、蔗糖13.5-16.5g、防腐剂(proclin 300)0.9-1.1ml、brij 35(月桂醇聚氧乙烯醚)0.9-1.1g、对乙酰氨基酚0.45-0.55g、硫酸庆大霉素0.036-0.044g、吐温20 0.45-0.55ml、ap酶羊抗人0.72-0.88mg/l。
[0023]
酶结合物的ph值优选7.05，每升酶结合物中各成分含量优选：三(羟甲基)氨基甲烷(tris)6.057g、氯化钠9g、bsa(牛血清白蛋白)25g、蔗糖15g、防腐剂(proclin 300)1ml、brij 35(月桂醇聚氧乙烯醚)1g、对乙酰氨基酚0.5g、硫酸庆大霉素0.04g、吐温20 0.5ml、ap酶羊抗人0.8mg/l。
[0024]
所述酶结合物进行了10倍浓缩，使用时需用样本缓冲液稀释，且稀释后需在一日内使用。
[0025]
该检测试剂盒还包括清洗缓冲液。
[0026]
所述清洗缓冲液包括tbst缓冲液(tris-氯化钠-吐温20)。其中，清洗缓冲液的ph值为7-8，还包括proclin 300。
[0027]
每升清洗缓冲液中各成分的含量为：tris 54.513-66.627g、氯化钠81-99g、
proclin 3000.45-0.55ml、吐温2018-22ml。
[0028]
清洗缓冲液的ph值优选7.4，每升清洗缓冲液中各成分的含量优选为：tris 60.57g、氯化钠90g、proclin 300 0.5ml、吐温20 20ml。
[0029]
而且，清洗缓冲液进行了10倍浓缩，且使用时需用蒸馏水稀释，稀释后需在一日内使用。
[0030]
所述样本缓冲液包括tbst缓冲液/脱脂奶粉(tris-氯化钠-吐温20/脱脂奶粉)，可直接使用。
[0031]
其中，样本缓冲液的ph值为7-8，还包括edta、proclin 300。
[0032]
每升样本缓冲液中各成分的含量为：tris 5.451-6.663g、氯化钠7.893-9.647g、edta 0.9-1.1g、proclin 3000.9-1.1ml、吐温204.5-5.5ml、脱脂奶粉9-11g。
[0033]
样本缓冲液的ph值优选7.4，每升样本缓冲液中各成分的含量优选为：tris 6.057g、氯化钠8.77g、edta 1g、proclin 300 1ml、吐温20 5ml、脱脂奶粉10g。
[0034]
所述底物液包括四唑硝基苯胺兰/5-溴-4-氯啶-3-吲哚-磷酸盐(nbt/bcip)。
[0035]
其中，底物液ph值为9-10，还包括tris、nacl、proclin 300、n，n-二甲基甲酰胺、mgcl2。
[0036]
每升底物液中各成分的含量为：tris 10.903-13.325g、nacl 5.256-6.424g、proclin 300 0.45-0.55ml、nbt 0.149-0.182g、bcip 0.0747-0.0913g、n，n-二甲基甲酰胺4.95-6.05ml、mgcl
2 0.086-0.105g。
[0037]
底物液ph值优选9.6，每升底物液中各成分的含量优选为：tris 12.114g、nacl 5.84g、proclin 3000.5ml、nbt 0.165g、bcip 0.083g、n，n-二甲基甲酰胺5.5ml、mgcl20.095g。
[0038]
底物液可直接使用，但由于其对光敏感、使用后应立即盖紧瓶盖。
[0039]
所述检测膜条质控带设有能够检验检测实验操作是否正确、包括用于半定量对比判读的强阳质控带、中阳质控带、弱阳质控带三个条带。膜条宽度不小于2mm。
[0040]
利用本发明的试剂盒进行抗体检测的检测方法和原理为：
[0041]
采用免疫印迹法进行体外诊断，试剂盒膜条上平行包被有经亲和层析纯化的抗原。在第一步温育时，已稀释的患者样本与检测膜条温育。如果样本阳性，特异性的igg抗体(包括iga和igm)与相应的抗原位点结合。
[0042]
为检测已结合的抗体，加入酶标记的抗人igg(酶结合物)进行第二步温育；然后加入酶底物，进行第三步温育，以产生可观察的颜色反应。
[0043]
有益效果：1、本发明提供的检测试剂盒能够方便快速地进行体外检测，操作简单，灵敏度高；2、对自身免疫性肝病相关抗体的检测研究领域提供更多的诊断手段；3、其中，抗原pml的检测结果可用于研究，为自身免疫性肝病相关抗体的研究提供了新思路；4、抗原m2-3e(bpo)、sla/lp及重组蛋白ro-52的增加能够更全面的对自身免疫性肝病的抗体进行检测诊断。抗原panca、sma的增加能够更全面的对自身免疫性肝病的抗体进行检测诊断，用于疾病的诊断与分类；亦有助于重叠综合征的诊断。抗sla/lp和抗lc-1抗体诊断aih的特异性高达100％，抗sla/lp可单独或与其他自身抗体同时出现，检出率为15％-30％，预测疾病的效度接近100％，出现相应临床症状时每次抗sla/lp抗体阳性结果都支持aih诊断；抗lkm-1抗体对于2型aih而言是可以确定其诊断的，高达50％抗lkm-1抗体阳性病人也表达抗
lc-1抗体；抗lc-1抗体滴度与aih活动性相关；成功的免疫抑制治疗后抗lc-1滴度可降低50％以上，甚至能完全转阴，2型aih的病程可以通过elisa检测抗lc-1来监测；5、ama(抗线粒体抗体)是诊断pbc的特异性抗体，敏感性达90％，但仍有10％的pbc患者ama抗体阴性，即ama对pbc的诊断有一定的局限性，抗gp210抗体却可出现在ama抗体阴性的pbc患者中，抗着丝点蛋白自身抗体一般出现在部分合并系统性硬化症的重叠综合征病人，pbc患者中，m2-3e(bpo)自身抗体的检出率高达90％-95％，pbc患者血清组(n＝170)检测结果显示：抗ama m2、m2-3e(bpo)、sp100、pml、gp210抗体总临床灵敏度为94％，特异性为99％；6、检测膜条上设有用于半定量的对比判读的强阳质控带、中阳质控带、弱阳质控带三个条带，从而实现对自身免疫性肝病相关抗体的半定量检测。
附图说明
[0044]
图1是本发明的检测试剂盒中其中两种检测膜条的结构示意图；
[0045]
图2是使用本发明的检测试剂盒时的检测流程示意图。
具体实施方式
[0046]
参见图1，本发明一实施例所述的自身免疫性肝病相关抗体的检测试剂盒包括抗原平行包被的检测膜条、酶结合物、样本缓冲液、清洗缓冲液及底物液。
[0047]
其中，检测膜条上平行包被的抗原包括ama-m2、m2-3e(bpo)、lkm-1、lc-1、sla/lp、sp100、gp210、pml、panca、sma和ro-52中的至少两种。其抗原的组合方式有以下两种：
[0048]
(1)ama-m2、m2-3e(bpo)、lkm-1、lc-1、sla/lp、sp100、gp210、pml、panca、sma和ro-52；
[0049]
(2)ama-m2、m2-3e(bpo)、lkm-1、lc-1、panca、sma和sla/lp。
[0050]
检测膜条设有能够检验检测实验操作是否正确、包括用于半定量对比判读的强阳质控带、中阳质控带、弱阳质控带三个条带质控带。膜条宽度为2.5mm。
[0051]
酶结合物的ph值为7.05，每升酶结合物中各成分及含量为：tris 6.057g、氯化钠9g、bsa 25g、蔗糖15g、proclin 300 1ml、brij 35 1g、对乙酰氨基酚0.5g、硫酸庆大霉素0.04g、吐温20 0.5ml、ap酶羊抗人0.8mg/l。
[0052]
酶结合物进行了10倍浓缩，使用时需用样本缓冲液稀释，且稀释后需在一日内使用。
[0053]
样本缓冲液的ph值为7.4，每升样本缓冲液中各成分及含量为：tris 6.057g、氯化钠8.77g、edta 1g、proclin 300 1ml、吐温20 5ml、脱脂奶粉10g。样本缓冲液可直接使用。
[0054]
清洗缓冲液的ph值为7.4，每升清洗缓冲液中各成分及含量为：tris 60.57g、氯化钠90g、proclin 300 0.5ml、吐温20 20ml。
[0055]
而且，清洗缓冲液进行了10倍浓缩，且使用时需用蒸馏水稀释，稀释后需在一日内使用。
[0056]
底物液ph值为9.6，每升底物液中各成分及含量为：tris 12.114g、nacl 5.84g、proclin 300 0.5ml、nbt 0.165g、bcip 0.083g、n，n-二甲基甲酰胺5.5ml、mgcl20.095g。
[0057]
底物液可直接使用，但由于其对光敏感、使用后应立即盖紧瓶盖。
[0058]
完成本发明的检测试验需要有温育盘。同时该检测试剂盒也适用于全自动免疫印
迹仪。
[0059]
参见图2，使用本发明的检测试剂盒通过免疫印迹法进行相关抗体检测，其原理和具体步骤流程如下：
[0060]
一、样本要求
[0061]
样本：人血清或edta、肝素或柠檬酸盐抗凝的血浆。
[0062]
稳定性：待检患者样本于2-8℃可稳定14天，已稀释的样本必须当天检测。
[0063]
样本稀释：患者样本用样本缓冲液1:101稀释，如可取15μl血清用1.5ml样本缓冲液稀释并用漩涡混匀器充分混匀。不可用加样器混匀。
[0064]
二、检验方法
[0065]
1、试剂的准备和稳定性
[0066]
注意：所有试剂在使用前均应在室温(18-25℃)平衡约30分钟。除非特别说明，从第一次使用起，在2-8℃，并且在没有污染的情况下，试剂盒中各成分可稳定保存12个月或保存至有效期截止。
[0067]
(1)包被抗原的检测膜条：直接使用。为防止膜条发生冷凝，只有当膜条平衡到室温后才可打开包装。取出膜条后应立即密封好原包装并将其保存于2-8℃。
[0068]
(2)酶结合物：10倍浓缩。使用时用干净的吸管从瓶中吸取所需酶结合物，并用样本缓冲液1:10稀释。如需温育一条检测膜条，用1.35ml样本缓冲液稀释0.15ml酶结合物。稀释后的可直接使用的酶结合物应在同一个工作日用完。
[0069]
(3)样本缓冲液：直接使用。
[0070]
(4)清洗缓冲液：10倍浓缩。使用时用干净的吸管从瓶中吸取需要量用蒸馏水1:10稀释。
[0071]
如需温育一条膜条，用9ml蒸馏水稀释1ml浓缩缓冲液。稀释后的缓冲液应在同一个工作日用完。
[0072]
(5)底物液：直接使用；因对光敏感，使用后应立即盖紧瓶盖。
[0073]
2、免疫印迹法操作流程
[0074]
(1)预处理：取出所需的检测膜条，将其放入温育盘的温育槽内。检测膜条上有编号的一面朝上。在温育槽中分别加入1.5ml样本缓冲液，于室温在摇摆摇床上温育5分钟后，吸去温育槽中的液体。
[0075]
(2)血清温育
[0076]
s1：在温育槽中分别加入1.5ml已稀释的血清样本，在摇摆摇床上室温
[0077]
(18-25℃)温育30分钟。
[0078]
清洗：吸去液体，在摇摆摇床上用1.5ml已稀释的清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5分钟。
[0079]
(3)酶结合物温育
[0080]
s2：在温育槽中加入1.5ml已稀释的酶结合物(碱性磷酸酶标记的抗人igg)，于摇摆摇床上室温温育30分钟。
[0081]
清洗：吸去液体，在摇摆摇床上用1.5ml已稀释的清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5分钟。
[0082]
(4)底物温育
[0083]
s3：在温育槽中分别加入1.5ml底物液，于摇摆摇床上室温(18-25℃)温育10分钟。
[0084]
终止：吸去槽内液体，用蒸馏水清洗膜条3次，每次1分钟。
[0085]
(5)结果判断：将检测膜条放置在结果判定模板中，风干后判断结果。
[0086]
三、检验结果的解释
[0087]
检测膜条上的质控带含有用于半定量对比判读的强阳质控带、中阳质控带、弱阳质控带三个条带，如果质控带出现颜色反应说明实验操作正确。根据表1中的对比判断标准，根据抗原带着色的深浅与质控带内的三个梯度条带进行显色深度对比，可将结果分为阴性、弱阳性、中阳性和强阳性性。从而实现对自身免疫性肝病相关抗体的半定量检测。
[0088]
表1检测结果判断标准
[0089]