一种驱球止痢合剂中环丙沙星和恩诺沙星的检测方法与流程

1.本发明属于药物分析领域，具体涉及一种驱球止痢合剂中环丙沙星和恩诺沙星的检测方法。


背景技术：

2.驱球止痢合剂具有抑杀球虫、清热解毒、消炎止痢、收敛止血的功效。能有效控制由球虫引起的血便、西红柿样粪便，肠炎腹泻，鸡冠苍白，采食量下降，机体消瘦；小肠壁白色结节或针尖样出血，肠道内有血液或混有血液的分泌物，肠壁增厚；盲肠肿胀，肠粘膜有出血点，内容物坚实混有血液等症状。
3.具体的，还可防治畜、兔肝球虫和肠球虫病引起的精神不振，食欲差，腹围增大，排便带血，头颈后仰，尖叫等症状，还可用于鸡、鸭、鹅、鸽及各种珍禽盲肠球虫，小肠球虫，坏死性肠炎等引起的排出烂西红柿样、红褐色乃至黑褐色、煤焦油样下痢状粪便，病死禽小肠后段黏膜坏死等，清除机体内毒素，对霉菌毒素有中和解毒功能。
4.恩诺沙星是畜牧业常用的兽药之一，属于喹诺酮类抗生素，是一类广谱高效的抗菌药，具有很强的渗透性，血药浓度高，毒性低，不易产生耐药性，并能很快分布至其它各器官。环丙沙星对革兰阴性杆菌有高度抗菌活性，还对葡萄球菌属、肺炎球菌、链球菌属及部分分枝杆菌、沙眼衣原体、溶脲脲原体、人型支原体等都有抑制作用，环丙沙星也是恩诺沙星的代谢产物，
5.因此，在驱球止痢合剂中加入一定剂量的恩诺沙星和环丙沙星使其联合用药，能够提高抑制禽兽体内细菌的繁殖，增强驱虫、止痢的效果。但是驱球止痢合剂是由常山、白头翁、仙鹤草、马齿苋、地锦草这5味中药进行制备的，成分复杂，难以将其中的环丙沙星和恩诺沙星分离、检测，如何准确的对驱球止痢合剂的环丙沙星和恩诺沙星进行质量控制是一个难题。


技术实现要素：

6.由于驱球止痢合剂的主要成分为常山、白头翁、仙鹤草、马齿苋、地锦草，成分复杂，从驱球止痢合剂中对环丙沙星和恩诺沙星进行分离、检测，对其进行质量控制困难，本发明克服现有技术的不足，提供了一种驱球止痢合剂中环丙沙星和恩诺沙星的检测方法。
7.具体而言，本发明的技术方案如下：
8.本发明提供了一种驱球止痢合剂中环丙沙星和恩诺沙星的检测方法，采用高效液相色谱-质谱联用技术，以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。
9.质谱条件的选择：
10.电离源的选择：
11.取恩诺沙星和环丙沙星药物混合标准中间液，在不接色谱柱的情况下，分别在正
负两种离子模式下进行全扫描质荷比(scan)扫描，对各药物的质荷比进行优化，并对质谱的雾化气温度、雾化气流速、雾化气压力、雾化电压等质谱电喷雾源参数进行调节和优化，使恩诺沙星和环丙沙星在仪器上具有较高的灵敏度。经过对比，恩诺沙星和环丙沙星在电喷雾离子源正模式[esi]+加氢电离的方式响应值和灵敏度较高。
[0012]
其他质谱电喷雾源参数的选择：
[0013]
雾化电压：3.0-4.0kv；
[0014]
雾化气温度：410-480℃；
[0015]
雾化气压力240-280kpa；
[0016]
雾化气流速7.0-12.0l/min；
[0017]
扫描模式：多反应监测(mrm)。
[0018]
恩诺沙星的沸点为560.5℃，环丙沙星的沸点为581.8℃，通常，雾化气温度赢高于待分析物的沸点20℃左右，也就是常规选择雾化气温度为600℃左右，还要考虑流动相的组成，有机溶剂比例高时可采用适当低的温度。但是在本方案中，发明人发现雾化气流速、温度对流出液形成喷雾有很大影响，干燥气会影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生，选用550℃-600℃的情况下，溶剂反而不易挥发，所以在接口去溶剂过程中严重干扰待测物的出峰，因此发明人尝试降低温度，最终探究出410-480℃效果好，优选为440℃。
[0019]
进一步优选的质谱条件为，
[0020]
电离源：电喷雾离子源正离子模式[esi]+；
[0021]
雾化电压：3.8kv；
[0022]
雾化气温度：440℃；
[0023]
雾化气压力265kpa；
[0024]
雾化气流速10.0l/min；
[0025]
扫描模式：多反应监测(mrm)。
[0026]
液相色谱条件的选择：
[0027]
为提高色谱柱对恩诺沙星和环丙沙星的分离效率和提高化合物灵敏度，发明人选用更适合uplc液相色谱小粒径色谱柱，节省分析时间。发明人尝试对比了碳十八柱(ods/c18)、碳八柱(mos/c8)、碳六柱(hexyl/c6)、碳四柱(butyl/c4)、碳一柱(methyl/c1)，发现碳十八柱更适合用于驱球止痢合剂中环丙沙星和恩诺沙星的分离，优选的agilent zorbax eclipse plus c18(3.0
×
100mm，1.8μm)、waters beh c18(2.1mm
×
100mm，1.7μm)两种色谱柱都可以使样品出色的分离，综合比较了分离效率、灵敏度等，最终确认agilent zorbax eclipse plus c18(3.0
×
100mm，1.8μm)分离效果更佳。
[0028]
在流动相选择方面：
[0029]
由于驱球止痢合剂是由常山、白头翁、仙鹤草、马齿苋、地锦草5味中药制备的，其成分非常复杂，例如，常山中含有生物碱、4-喹唑酮、伞形花内酯等成分，白头翁中含有皂甙，皂甙则易水解成三萜甙元、葡萄糖、鼠李糖和一些未知的糖，仙鹤草中含有豆甾-5-烯-3β,7β-二醇、豆甾-5-烯-3β7,α-二醇、豆甾-3β6,α-二醇和β-谷甾醇、胡萝卜素、维生素c、蛋白质、碳水化合物、矿物质等成分；马齿苋中含有二羟乙胺、苹果酸、葡萄糖、钙、磷、铁以及各类维生素、ω-3脂肪酸等成分，地锦草含有黄酮类(槲皮紊等)、没食子酸、内消旋肌醇、叶含鞣质等成分。由此可见，驱球止痢合剂成分复杂，从驱球止痢合剂中同时分离检测恩诺沙
星和环丙沙星是存在很多干扰因素的，因此，在流动相a的选择方面，发明人进行了深入探究，通过单因素试验发现流动相a仅用乙腈很难对复杂的驱球止痢合剂中的未知成分和恩诺沙星、环丙沙星进行分离，于是发明人通过添加极性强的溶剂进行进一步的有效分离，在强极性溶剂中，n,n-二甲基酰胺的效果较好，于是优选了乙腈和n,n-二甲基酰胺的体积比后，探究得到流动相a为乙腈、n,n-二甲基酰胺(体积比8:2)实验效果最佳。
[0030]
进一步通过对比流动相b中甲酸的加入量，发现甲酸的加入能够改善峰形，使待测物与内源性物质充分分离，但是现甲酸的加入也会抑制其信号，尤其是甲酸体积分数越高抑制信号越严重，这一问题确为一大困扰，为了解决这一问题，发明人通过尝试探究发现甲酸溶液的ph是影响峰形、分离度的关键点，于是发明人通过调节甲酸溶液的ph可以很好的避免此问题，因此发明人在流动相b中加入缓冲溶液对ph进行调节，通常认为，缓冲液一般选择甲酸铵和乙酸铵等，这是由于他们具有：1.显著地质子自递作用，有利于离子在流动相中预先形成；2.适中的介电常数，避免喷口放电；3.强挥发性，易脱去，不易形成溶剂加成物等优点，而强的有机缓冲盐，它不仅会腐蚀系统，而且它们也会离子化，和待测样品产生竞争效应。于是发明人选择甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液、磷酸缓冲液、醋酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、酒石酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲液、盐酸缓冲液等进行试验分析。
[0031]
实验证明甲酸铵缓冲液、乙酸铵缓冲液并不适合用于本发明中，出峰峰形宽，分离效果不佳，由于中药成分复杂，该色谱条件对于皂苷类、生物碱类、黄酮类化合物不能很好的分离；最终发明人发现酒石酸缓冲液的加入分离效果更好，峰形好，分离度高，易洗脱。同时发明人的目的在于降低甲酸对信号的抑制，于是对流动相b中的甲酸浓度进行了调整，发现加入甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液后，降低甲酸浓度为0.01％-0.1％，即可实现都对待测物的较好分离，为了进一步的降低甲酸对信号的抑制和干扰，发明人也尽量采用浓度低的甲酸溶液，从而，流动相b中优选为0.02％甲酸溶液。
[0032]
综上，流动相b选择为0.01％-0.1％甲酸和甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液，甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液的ph为4.0-5.5；进一步的，流动相b为0.02％甲酸、甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液，ph＝4.9。因此，发明人探索出的流动相条件为：
[0033]
流动相a：乙腈、n,n-二甲基酰胺(体积比8:2)
[0034]
流动相b：0.02％甲酸、甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液(ph＝4.9)(体积比10：1)
[0035]
发明人在流动相b中加入甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液，调节ph，同时降低了甲酸的浓度，解决了甲酸抑制干扰信号的问题，同时还能使待测物与内源性物质充分分离，峰形保持良好，质谱的离子化效率以及灵敏度优于其它流动相试剂，另外使得恩诺沙星和环丙沙星出峰时间较晚，降低了样品中基质效应影响。
[0036]
洗脱方式：梯度洗脱。
[0037]
梯度洗脱程序为：
[0038][0039]
柱温：28℃-35℃，优选为32℃。
[0040]
流速：0.1-0.5ml
·
min-1
，优选为0.2ml
·
min-1
。
[0041]
优选的，液相色谱条件为：
[0042]
色谱柱：agilent zorbax eclipse plus c18(3.0
×
100mm，1.8μm)
[0043]
柱温：32℃
[0044]
流动相a：乙腈、n,n-二甲基酰胺(体积比8:2)
[0045]
流动相b：0.02％甲酸、甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液(ph＝4.9)
[0046]
流速：0.2ml
·
min-1
[0047]
洗脱方式：梯度洗脱
[0048][0049]
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
[0050]
(1)本发明通过优化色谱条件，解决了甲酸抑制干扰信号的问题，使待测物与内源性物质充分分离，质谱的离子化效率以及灵敏度优，同时，改变了内源性物质与恩诺沙星、环丙沙星在色谱柱上的保留时间，使其流出的速度不同，从而进入质谱的时间不同使内源性物质和待测得化合物分开，降低了样品中基质效应影响。
[0051]
(2)本发明通过对质谱条件的优化，解决了干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞气影响二级质谱的产生，以及溶剂不易挥发导致在接口去溶剂过程中严重干扰待测物的出峰的问题。
[0052]
(3)本发明通过高效液相色谱-质谱联用技术，实现对驱球止痢合剂中环丙沙星和恩诺沙星的检测分析，去除了基质影响，检测速度快、灵敏度高、精密度高、重现性好。
附图说明
[0053]
图1：恩诺沙星子离子扫描
[0054]
图2：环丙沙星子离子扫描
[0055]
图3：驱球止痢合剂空白样品谱图
[0056]
图4：添加浓度为0.2mg/l的混合标准工作溶液驱球止痢合剂样品谱图
[0057]
图5：添加浓度为0.4mg/l的混合标准工作溶液驱球止痢合剂样品谱图
[0058]
图6：添加浓度为1.0mg/l的混合标准工作溶液驱球止痢合剂样品谱图
具体实施方式
[0059]
为了使本发明的目的、技术方案更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明做进一步的说明，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例，实施例仅用于解释本发明。本领域技术人员应该理解的是，凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。
[0060]
一、质谱条件的探究
[0061]
取恩诺沙星和环丙沙星药物混合标准中间液，在不接色谱柱的情况下，在正离子模式下进行全扫描质荷比(scan)扫描，对各药物的质荷比进行优化，并对质谱的雾化气温度、雾化气流速、雾化气压力、雾化电压等质谱电喷雾源参数进行调节和优化，使恩诺沙星和环丙沙星在仪器上具有较高的灵敏度。
[0062]
实施例1雾化气温度的探究
[0063][0064]
经实验探究，雾化气温度对流出液形成喷雾有很大影响，340℃-400℃的温度条件下，由于温度过低，流出液形成喷雾不均匀，干燥气影响喷雾去溶剂效果，碰撞影响二级质谱的产生，选用500℃-600℃的情况下，溶剂反而不易挥发，所以在接口去溶剂过程中严重干扰待测物的出峰，因此，由于中药成分的复杂性，发明人经过大量尝试实验最终探究出410-480℃的温度情况下效果好，优选为440℃。
[0065]
实施例2
[0066]
电离源：电喷雾离子源正离子模式[esi]+；
[0067]
雾化电压：3.8kv；
[0068]
雾化气温度：440℃；
[0069]
雾化气压力：265kpa；
[0070]
雾化气流速：10.0l/min；
[0071]
扫描模式：多反应监测(mrm)。
[0072]
表1恩诺沙星和环丙沙星的质谱检测参数
[0073][0074]
实施例3
[0075]
电离源：电喷雾离子源正离子模式[esi]+；
[0076]
雾化电压：3.0kv；
[0077]
雾化气温度：410℃；
[0078]
雾化气压力：240kpa；
[0079]
雾化气流速：7.0l/min；
[0080]
扫描模式：多反应监测(mrm)。
[0081]
实施例4
[0082]
电离源：电喷雾离子源正离子模式[esi]+；
[0083]
雾化电压：4.0kv；
[0084]
雾化气温度：480℃；
[0085]
雾化气压力：280kpa；
[0086]
雾化气流速：12.0l/min；
[0087]
扫描模式：多反应监测(mrm)。
[0088]
实施例2-4获得的质谱图均可以为下一步的检测提供良好的基础，以实施例2质谱条件为后续的探索作为基础。
[0089]
实施例2质谱图中，恩诺沙星保留时间3.2min，母离子质荷比360.0，子离子质荷比是341.9和315.9；环丙沙星保留时间是3.9min，母离子质荷比331.9，子离子质荷比为313.9和231.0。
[0090]
二、色谱条件的探究
[0091]
实施例5
[0092]
色谱柱：agilent zorbax eclipse plus c18(3.0
×
100mm，1.8μm)
[0093]
柱温：32℃
[0094]
流动相a：乙腈、n,n-二甲基酰胺(体积比8:2)
[0095]
流动相b：0.02％甲酸、甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液(ph＝4.9)，体积比为10：1
[0096]
流速：0.2ml
·
min-1
[0097]
洗脱方式：梯度洗脱
[0098][0099]
采用液相色谱-质谱联用技术，在实施例5和实施例2的条件下，对驱球止痢合剂中环丙沙星和恩诺沙星进行检测，经检测器得到质谱图恩诺沙星和环丙沙星空白样品和添加样品谱图见图3-6。
[0100]
实施例6
[0101]
色谱柱：waters beh c18(2.1mm
×
100mm，1.7μm)
[0102]
柱温：28℃
[0103]
流动相a：乙腈、n,n-二甲基酰胺(体积比8:4)
[0104]
流动相b：0.08％甲酸、甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液(ph＝4.0)，体积比为10：2
[0105]
流速：0.1ml
·
min-1
[0106]
洗脱方式：梯度洗脱
[0107][0108][0109]
实施例7
[0110]
色谱柱：agilent zorbax eclipse plus c18(3.0
×
100mm，1.8μm)
[0111]
柱温：35℃
[0112]
流动相a：乙腈、n,n-二甲基酰胺(体积比8:1)
[0113]
流动相b：0.01％甲酸、甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液(ph＝5.5)，体积比为10：0.5
[0114]
流速：0.5ml
·
min-1
[0115]
洗脱方式：梯度洗脱
[0116][0117]
实施例8
[0118]
色谱柱：agilent zorbax eclipse plus c18(3.0
×
100mm，1.8μm)
[0119]
柱温：32℃
[0120]
流动相a：乙腈、n,n-二甲基酰胺(体积比8:2)
[0121]
流动相b：0.02％甲酸、酒石酸盐缓冲溶液(ph＝4.9)，体积比为10：1
[0122]
流速：0.2ml
·
min-1
[0123]
洗脱方式：梯度洗脱
[0124][0125][0126]
对比实施例1
[0127]
色谱柱：agilent zorbax eclipse plus c18(3.0
×
100mm，1.8μm)
[0128]
柱温：32℃
[0129]
流动相a：乙腈
[0130]
流动相b：0.02％甲酸
[0131]
流速：0.2ml
·
min-1
[0132]
洗脱方式：梯度洗脱
[0133][0134]
对比实施例2
[0135]
色谱柱：agilent zorbax eclipse plus c18(3.0
×
100mm，1.8μm)
[0136]
柱温：32℃
[0137]
流动相a：乙腈、n,n-二甲基酰胺(体积比8:2)
[0138]
流动相b：0.02％甲酸
[0139]
流速：0.2ml
·
min-1
[0140]
洗脱方式：梯度洗脱
[0141][0142][0143]
对比实施例3
[0144]
色谱柱：agilent zorbax eclipse plus c18(3.0
×
100mm，1.8μm)
[0145]
柱温：32℃
[0146]
流动相a：乙腈
[0147]
流动相b：0.02％甲酸、甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液(ph＝4.9)，体积比为10：1
[0148]
流速：0.2ml
·
min-1
[0149]
洗脱方式：梯度洗脱
[0150][0151]
对比实施例1中甲酸的加入能够改善峰形，使待测物与内源性物质充分分离，但是现甲酸的加入也会抑制其信号，尤其是甲酸体积分数越高抑制信号越严重；对比实施例2流动相a为乙腈、n,n-二甲基酰胺(体积比8:2)，分离度相对对比实施例1较好，但是依然存在抑制信号问题；对比实施例3流动相b为0.02％甲酸、甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液(ph＝4.9)，体积比为10：1，虽然相对解决了甲酸体积分数越高抑制信号的问题，但是由于中药成分过于复杂，出现杂峰，分离度差。
[0152]
在此说明的是，所有参数的设置，尤其是梯度洗脱程序、缓冲溶液ph的设置也是准确分离、测定驱球止痢合剂中恩诺沙星和环丙沙星的关键，是发明人经过大量单因素实验筛选得到的最优选择，在此不一一罗列实验过程。
[0153]
三、驱球止痢合剂中恩诺沙星和环丙沙星的测定
[0154]
质谱条件：
[0155]
电离源：电喷雾离子源正离子模式[esi]+；
[0156]
雾化电压：3.8kv；
[0157]
雾化气温度：440℃；
[0158]
雾化气压力：265kpa；
[0159]
雾化气流速：10.0l/min；
[0160]
扫描模式：多反应监测(mrm)。
[0161]
高效液相色谱条件：
[0162]
色谱柱：agilent zorbax eclipse plus c18(3.0
×
100mm，1.8μm)
[0163]
柱温：32℃
[0164]
流动相a：乙腈
[0165]
流动相b：0.02％甲酸、甘氨酸-酒石酸盐缓冲溶液(ph＝4.9)，体积比为10：1
[0166]
流速：0.2ml
·
min-1
[0167]
洗脱方式：梯度洗脱
[0168][0169]
标准储备溶液：1.0mg/ml，分别准确称取恩诺沙星、环丙沙星标准品10mg于各自10ml容量瓶中，用0.02mol/l氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度，避光2-8℃下保存；
[0170]
混合标准中间液：准确吸取恩诺沙星、环丙沙星标准储备液各1ml，用0.02mol/l氢氧化钠溶液溶解并稀释至100ml稀释配成10mg/l，避光4℃下保存；
[0171]
混合标准工作液：准确吸恩诺沙星、环丙沙星混合标准中间液，配制成浓度为0.02mg/l、0.05mg/l、0.1mg/l、0.4mg/l、1.0mg/l、2.0mg/l、5.0mg/l的标准工作液，进行高效液相色谱-质谱分析；以浓度对峰面积进行回归分析，得标准曲线，计算回归方程(r2＞0.99，n≥6)；
[0172]
恩诺沙星：y＝-1951.14+12771.36x r2＝0.9994
[0173]
环丙沙星：y＝-5466.56+3917.21x r2＝0.9991
[0174]
精密吸取驱球止痢合剂样品待测液利用液相色谱仪检测，测得各组分的峰面积，经上述标准曲线，计算得出该样品中恩诺沙星、环丙沙星含量。
[0175]
四、回收率和精密度考察
[0176]
对驱球止痢合剂进行加标回收试验按照样品处理方法及相同的色谱条件下，进行回收率的测定，每个样品重复3次，计算出每个添加水平的回收率和相对标准偏差(表2)。
[0177]
表2驱球止痢合剂中恩诺沙星和环丙沙星的回收率和精密度
[0178][0179]
五、基质效应考察
[0180]
取驱球止痢合剂空白组织，经过前处理后，分别加入1.0μg/ml的混合标准工作溶液40μl、100μl、200μl，并用初始流动相定容至1.0ml，复溶残渣，分别配制成浓度分别为20、50和100μg/kg的样品，过0.22μm有机系滤膜，滤液供hplc-ms/ms检测。每个浓度制备6个平行样品，比较相同浓度的驱球止痢合剂中恩诺沙星和环丙沙星药物溶液，在不同条件下峰面积比值，即纯的标准品溶液set1和样品基质提取后添加的set2，依据以下公式计算基质效应(matrix effects,me)。
[0181]
me＝(set2/set1)
×
100％
[0182]
若me＜1，说明基质对目标物响应产生抑制作用；me＞1，说明基质会对目标物的响应为增强作用；me＝1表示无基质效应。
[0183]
结果显示，按照对比实施例1的色谱条件进行检测，经过计算，恩诺沙星和环丙沙星me在0.15～0.3之间，说明基质会抑制对目标物的响应，驱球止痢合剂确实成分复杂，部分内源性物质与恩诺沙星和环丙沙星的保留时间相近。本发明技术方案测定样品，计算基质效应，得到恩诺沙星和环丙沙星me在0.85～0.95之间，基质抑制效应较小，基本不存在基质效应，这都得益于本发明中质谱条件和色谱条件的选择，一般情况下，负离子的背景噪音要低于正离子的，但是负离子并不适用与本方案中，因此为了解决这个问题，本发明优化了色谱条件，将洗脱程序变缓，使得恩诺沙星和环丙沙星出峰时间较晚，改变内源性物质与恩诺沙星、环丙沙星在色谱柱上的保留时间，使其流出的速度不同，从而进入质谱的时间不同使内源性物质和待测得化合物分开，减小了样品中基质效应影响。