一种快速检测二甲双胍的电化学传感器的制备方法及其应用

1.本发明属于电化学传感器和分析化学技术领域，涉及一种快速检测二甲双胍的电化学传感器的制备方法及其应用。


背景技术：

2.二甲双胍(met)是一种治疗ⅱ型糖尿病的首选药物，随着糖尿病发病率的逐年升高，二甲双胍的使用量也急剧上升。国际糖尿病联盟(international diabetes federation,idf)最新数据显示，2021年全球已有5.37亿成年人患有糖尿病，预计到2045年全球糖尿病人数将增至7.84亿，并且90％的糖尿病患者患有ⅱ型糖尿病(idf atlas 10
th edition,2021)。二甲双胍作为ⅱ型糖尿病的首选治疗药物，已在2020年被列为第四大处方药，全球有上亿人正在服用此药物。然而，二甲双胍不能被人体所代谢，摄入体内的二甲双胍几乎100％未经修饰地随尿液和粪便排出体外，经污水设施处理后，进入地表水(河流、湖泊)，并最终广泛分布于世界各地的水环境中。同时，环境中的二甲双胍还是一种新污染物。有研究发现，在水厂加氯消毒过程中，二甲双胍会与次氯酸消毒剂反应，产生两种新的有毒消毒副产物y(c4h6cln5)和c(c4h6cln3)；且在相同氯含量的情况下，y和c的量随着二甲双胍浓度的增加而增加。目前，二甲双胍及其消毒副产物在中国、美国、日本和韩国等多个国家和地区的城市饮用水中均有检出，其最高浓度分别为1.2μg/l和9.7ng/l。已有研究表明，毫摩尔剂量的消毒副产物y和c便对线虫和人类肝癌细胞系(hepg2)具有明显的致死毒性和细胞毒性，其毒性与砷相似甚至更高；还能破坏小鼠小肠的完整性，甚至致其死亡。二甲双胍及其氯化消毒副产物广泛存在于世界饮用水系统中，尽管目前饮用水中的剂量不会对人体健康造成危害，但随着时间的推移，其对全球饮用水安全和生命健康可造成不容忽视的潜在威胁，但目前这些都还未引起广泛关注。因此，针对环境水体中二甲双胍的分布之广、含量之高、危害之大的现状及检测需求，亟需发展高灵敏、低成本的快检新方法，实时监测环境水体中二甲双胍的含量，这对水污染的有效评估和防治、饮用水安全保障等具有重要意义。
3.为满足二甲双胍的检测需求，迫切需要发展可靠、高效、灵敏、快速、价格低廉的分析检测方法。目前使用最广泛的二甲双胍检测技术主要包括高效液相色谱法、色谱-质谱联用法等，这些方法具有较高的灵敏度和准确度，但其局限性也很明显，如仪器设备体积庞大且昂贵、样品前处理复杂且耗时、有机溶剂消耗量大且检测成本高等，这在很大程度上使其无法在快速分析和应急检测时发挥作用；而且大部分的检测方法主要是针对盐酸二甲双胍缓释片含量的测定，尚未发展适用于实际水体环境中二甲双胍快速检测和筛查的新方法。因此需要开发高灵敏、低成本的二甲双胍选择性快检新平台，以满足实验室和现场快速检测需求，实时了解环境污染状况，及时采取应对措施。
4.电化学传感器因成本低、响应速度快、样品前处理简单、易于微型化等优势而备受关注，在环境污染物快速筛查和检测领域应用最为广泛。通过在电极表面修饰特定的化学功能团，可使化学修饰电极集分离、富集和检测于一体，在提高灵敏度和选择性等方面具有
独特优越性，因此，电极修饰材料的选择是关键。近年来，碳纳米材料具有独特的理化性能，一直是材料领域的研究热点。氮掺杂的碳纳米管，具有比表面积大、导电性好、丰富的大π键、生物相容性好、催化活性和稳定性高以及表面易于功能化修饰和吸附等特性，并在催化、储能和化学传感器等领域具有广阔的应用前景。迄今为止，国内外还没有基于氮掺杂碳纳米管的电化学传感器应用于二甲双胍快检的报道。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术中存在的不足，本发明提出了一种快速检测二甲双胍的电化学传感器的制备方法及其应用，该方法利用纳米材料信号放大效应、表面修饰技术和电化学传感技术，构建一种成本低、灵敏度高、响应速度快、特异性好、操作简单的二甲双胍电化学传感器。引入的过渡金属离子，不仅能与二甲双胍配位形成电活性配合物，还可以通过阳离子-π相互作用与碳纳米材料中的共轭π键作用，自发地吸附到氮掺杂碳纳米管表面，增加电极表面参与反应的二甲双胍局部浓度，进而显著提高电化学响应信号。
6.本发明的具体技术方案为：
7.一种快速检测二甲双胍的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
8.步骤1，将氮掺杂碳纳米管与n,n-二甲基甲酰胺混合，经超声预处理，得分散体系a，所述分散体系a中氮掺杂碳纳米管的浓度为1～5mg/ml；
9.步骤2，将成膜材料加入到步骤1制得的分散体系a中充分混匀，得混合溶液b；所述混合溶液b中：氮掺杂碳纳米管的浓度为0.5～3mg/ml，成膜材料浓度为0.01～2mg/ml；
10.步骤3，取步骤2制得的混合溶液b滴涂到抛光预处理后的玻碳电极表面，在室温下静置、晾干，得到电化学传感器。
11.进一步地，步骤2所述的成膜材料为壳聚糖溶液，壳聚糖溶液是将壳聚糖溶于1％的乙酸溶液所得。
12.优选地，所述壳聚糖是从蟹壳和/或虾壳中所获得的直链高分子聚合物，其壳聚糖脱乙酰度为75％～85％。
13.进一步地，步骤3所述玻碳电极表面进行抛光预处理过程为：用三氧化二铝粉末将玻碳电极表面抛光，然后依次在无水乙醇和去离子水中反复超声清洗，之后用高纯氮气将电极表面吹干待用；所述三氧化二铝粉末粒径为0.05μm。
14.优选地，所述三氧化二铝粉末粒径在具有0.05μm的基础上，还包括1μm、0.3μm中的一种或两种，按照粒径由大到小的顺序依次使用对玻碳电极表面进行抛光预处理。
15.采用上述方法制备的快速检测二甲双胍的电化学传感器，该电化学传感器为氮掺杂碳纳米管修饰的玻碳电极。
16.上述快速检测二甲双胍的电化学传感器的应用，包括步骤如下：
17.步骤1，将所述氮掺杂碳纳米管修饰的玻碳电极、ag/agcl参比电极、pt电极组成的三电极系统浸入含二甲双胍、过渡金属离子及缓冲盐溶液的电解质溶液中；
18.步骤2，对二甲双胍进行富集处理；
19.步骤3，采用差分脉冲伏安法检测二甲双胍的电化学信号，得到差分脉冲伏安曲线。
20.进一步地，所述过渡金属离子为铜离子，浓度为0.01～1mmol/l。
21.进一步地，所述缓冲盐溶液为磷酸缓冲盐溶液、tris缓冲盐溶液、硼砂缓冲盐溶液中的一种。
22.进一步地，所述缓冲盐溶液ph值为9～12。
23.进一步地，所述缓冲盐溶液优选磷酸缓冲盐溶液，为na2hpo4和nah2po4的20～100mmol/l等摩尔浓度混合水溶液。
24.进一步地，通过所述电化学传感器扫描得到的差分脉冲伏安曲线中峰电位的位置，对样品中的二甲双胍进行定性；并通过检测到的峰电流强度与对应已知二甲双胍的浓度关系而得到标准曲线，对二甲双胍浓度进行定量检测。
25.优选地，步骤2富集参数为：富集电位为-0.2～0.1v、富集时间为60～120s。
26.优选地，步骤3中差分脉冲伏安法的检测电位为0～1.0v，电位增量5mv，脉冲幅度50mv，脉冲宽度50ms，进行扫描，记录响应电流信号。
27.优选地，所述电化学传感器可应用于检测水体环境样品、面粉及面粉制品中二甲双胍的检测。
28.优选所述检测包括以下步骤：将所述电化学传感器放入空白检测溶液中，将已知浓度的二甲双胍作为目标分析物加入到上述检测溶液中，同时进行差分脉冲伏安扫描并记录响应的伏安曲线，通过曲线中的电流响应信号i和二甲双胍浓度c组成校正曲线，来计算分析样品中二甲双胍的浓度含量。
29.本发明的有益效果为：
30.(1)氮掺杂碳纳米管具有优异的导电性，极大地提高了修饰电极的电子转移速率；较大的比表面积，为催化底物的附着提供大量的活性位点；其与过渡金属离子间的阳离子-π相互作用，可吸附过渡金属离子-二甲双胍配合物，可增加电极表面参与反应的二甲双胍的浓度；氮掺杂碳纳米管还具有较高的电催化活性，极大提高了传感器的检测灵敏度和检测限。
31.(2)过渡金属离子不仅能与二甲双胍键合形成电活性配合物，还能催化二甲双胍的电化学氧化，进一步提高传感器的检测灵敏度。
32.(3)壳聚糖是一种线性匀聚物，具有良好的成膜能力和生物相容性。
33.(4)所制备的电化学传感器价格低廉，对实际样品中二甲双胍的检测不需要复杂的样品前处理，操作简单，响应速度快，灵敏度高，选择性好，适用范围广，易于微型化，设备便携，适合现场检测。
34.(5)本发明制备的电化学传感器对环境水体样品、面粉及面粉制品中二甲双胍的检测，具有较高的灵敏度，且能够实现同时、快速、准确、高效地评价实际样品中二甲双胍的浓度水平，与常规的色谱-质谱联用法相比，具有样品前处理简单、检测速度快、成本低、设备可靠便携等优势，可用于现场筛查和检测环境污染物。
附图说明
35.图1为本发明实施例1氮掺杂碳纳米管的透射电子显微镜(tem)图；
36.图2为本发明实施例1氮掺杂碳纳米管的扫描电子显微镜(sem)图；
37.图3为本发明实施例1氮掺杂碳纳米管的x射线衍射(xrd)图；
38.图4为本发明实施例3中不同浓度的cu
2+
对响应信号的影响；
39.图5为本发明实施例4中不同ph对传感器检测性能的影响曲线图；
40.图6为本发明实施例5中的裸电极与氮掺杂碳纳米管修饰电极检测二甲双胍的差分脉冲伏安曲线图；
41.图7和图8分别为实施例6中富集时间和富集电位对响应信号的影响；
42.图9和图10为本发明实施例7中的二甲双胍检测的伏安图及电流-浓度线性相关曲线图。
具体实施方式
43.以下实施例用于说明本发明，但不限制本发明的范围。
44.电化学传感器的制备与样品的检测过程具体步骤如下：
45.(a)将氮掺杂碳纳米管与n,n-二甲基甲酰胺混合，经超声预处理，得分散体系a；所述分散体系a中氮掺杂碳纳米管的浓度为1～5mg/ml；
46.(b)将壳聚糖溶于1％的乙酸溶液中，得壳聚糖溶液；
47.(c)将壳聚糖溶液与氮掺杂碳纳米管分散液混合，取2μl上述含有氮掺杂碳纳米管-壳聚糖(ncnt-chi)的复合溶液滴加到已经进行抛光处理的玻碳电极表面，在室温下静置晾干，得到所述电化学传感器。
48.(d)以所述电化学传感器为工作电极，以银/氯化银电极作为参比电极，铂电极作为辅助电极，构建电化学检测三电极体系，以磷酸缓冲溶液为电解质溶液，以差分脉冲伏安法为检测手段检测二甲双胍。
49.以下是部分本发明实施例中所用到的仪器和设备，其它未具体注明的实验条件，按照常规或仪器制造厂建议的条件。
50.实施例1
51.氮掺杂碳纳米管的表征
52.通过透射电镜(tem)、扫描电镜(sem)和x-射线衍射(xrd)对氮掺杂碳纳米管的形貌和结构进行表征。图1、图2和图3给出了氮掺杂碳纳米管的tem、sem和xrd图谱。从图1中的tem图和图2中的sem图中可以看出，氮掺杂碳纳米管具有一维束状管结构，表面光滑；直径在10-45nm之间，内径在5-20nm之间。图3的xrd图谱显示，n-cnt在26.0处有一个明显的衍射峰，对应着石墨碳的(002)晶面，而42.9处还存在一个弱峰，此处对应(111)晶面。
53.实施例2
54.电化学传感器制备
55.玻碳电极组装步骤：
56.(a)依次用粒径分别为1μm，0.3μm，0.05μm的三氧化二铝粉末将玻碳电极表面抛光，然后在无水乙醇和去离子水中反复超声清洗，用高纯氮气将电极表面吹干待用。随后在1mmol/l的铁氰化钾/亚铁氰化钾溶液(摩尔比1:1)中，扫描循环伏安曲线。该曲线氧化还原峰电位差小于70mv，说明玻碳电极表面的氧化还原反应属于完全可逆反应，电极抛光情况良好，可进行下一步实验。
57.(b)电化学传感器的构建：将壳聚糖溶液与氮掺杂碳纳米管分散液以1:3的体积比混合，得到最终混合液的组成：氮掺杂碳纳米管浓度为2mg/ml；壳聚糖浓度为0.05mg/ml，取2ul最终复合液滴到新抛光的玻碳电极表面，在室温下静置，缓慢晾干得到均匀薄膜的氮掺
杂碳纳米管-壳聚糖电极(ncnt-chi/gce)。
58.实施例3
59.过渡金属离子cu
2+
浓度的优化
60.以ncnt-chi/gce为工作电极、ag/agcl电极为参比电极，pt电极为辅助电极，组成三电极系统，检测液为含不同浓度cu
2+
的磷酸缓冲盐溶液(50mm，ph12)中，并采用差分脉冲伏安法检测5μm二甲双胍的电化学响应信号，如图4所示。在cu
2+
浓度为0.75mmol l-1
时，响应电流值最大。
61.实施例4
62.电化学传感器适用的ph范围
63.以ncnt-chi/gce为工作电极，以检测液为含0.75mmol l-1
cu
2+
的磷酸缓冲盐溶液(50mm)，ph分别为8～12。将5μm的二甲双胍加入上述检测液中，进行差分脉冲伏安扫描，分别记录峰电流和峰电势与ph的关系曲线，如图5所示。从该图可知，电化学响应信号随着ph的升高而增大，表明二甲双胍的电化学氧化有质子参与，且本发明所研制的电化学传感器在适用于碱性条件下检测二甲双胍。
64.实施例5
65.ncnt-chi电极与裸电极检测性能比较
66.分别以氮掺杂碳纳米管修饰后的玻碳电极和裸玻碳电极为工作电极，以含0.75mmol l-1
cu
2+
、ph为12的磷酸缓冲盐溶液为检测液，以差分脉冲伏安法检测5μm二甲双胍，并记录电化学响应信号。如图6所示，在0.0～1.0v电位范围内，单独的cu
2+
和二甲双胍均无响应，而两者同时存在时，其响应信号明显增强，且远高于裸电极的，表明本发明的电化学传感器具有显著增强的响应灵敏度，能够满足二甲双胍高灵敏快速检测的需求。
67.实施例6
68.电化学传感器富集条件的优化
69.以ncnt-chi/gce为工作电极，以含0.75mmol l-1
cu
2+
、ph为12的磷酸缓冲盐溶液为检测液，以差分脉冲伏安法扫描检测5μm二甲双胍，检测之前先对二甲双胍进行富集，并考察富集时间和富集电位对电化学响应信号的影响。结果如图7和图8所示，电化学响应信号分别在富集时间80s和富集电位-0.1v处达到最大值。
70.实施例7
71.电化学传感器检测二甲双胍的标准溶液及实际应用
72.以ncnt-chi/gce为工作电极，以含0.75mmol l-1
cu
2+
、ph为12的磷酸缓冲盐溶液为检测液，富集时间为80s，富集电位-0.1v，在最优的检测条件下，采用差分脉冲伏安法检测一定浓度(0.25～12μm)的二甲双胍标准溶液，得到差分脉冲伏安曲线图(图9)，根据每条伏安曲线上双酚类化合物的响应电流与已知浓度，得到电流强度与二甲双胍浓度之间的相关曲线(图10)。该传感器检测二甲双胍的线性范围为0.3～10μmol/l，响应灵敏度为4.5921μa/(μmol/l)，检出限低至13.96nmol/l。其检测性能优于已报道的γ-fe2o3@hap/cu(ⅱ)(sensors and actuators b:chemical,2018,270,405-416)、石墨烯-cu(microchemical journal,2022,172,106877)和普鲁士蓝-碳纳米球(international journal of nanomedicine:2018,13,117-120)等传感器。
73.实施例8
74.基于氮掺杂碳纳米管的电化学传感器的选择性的评价
75.在二甲双胍浓度为5μm的情况下，向检测溶液中分别加入50μm的溴酸钾、氯乙酸、溴乙酸等消毒副产物及四环素和金霉素等抗生素作为干扰物于检测溶液中，进行差分脉冲伏安扫描，得到含上述五种干扰物的电化学响应信号。10倍消毒副产物的存在对二甲双胍响应信号无影响；而抗生素的存在会使二甲双胍的响应信号有少许的降低，但仍保留了原有信号的90％。结果显示，本发明的电化学传感器具有良好的选择性。
76.本发明的优点是：1对二甲双胍的灵敏度高；2检出限低；3选择性好；4本发明的传感器具有制备简单，无需复杂耗时的样品前处理，成本低，易于微型化等优势。