电化学发光体、电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用

1.本发明属于电化学发光检测领域，涉及电化学发光体、电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.林可霉素(lincomycin，简称lin)，作为一种由链霉菌发酵产生的林可酰胺类抗生素，具有较强的抑菌活性和广泛的抗菌谱，被广泛应用于禽畜养殖中，该兽药常常被添加到饲料或饮用水中，而未被动物体吸收的绝大部分都以本体或者代谢产物进入环境中，造成了自然环境中抗生素累积，破坏微生物的平衡，随后可能会通过食物链进入人体，导致人体产生细菌耐药性，最终危害人类健康。水环境中林可霉素残留问题已然成为公共卫生问题。我国农业部公告规定动物性食品中林可霉素最高残留限量为100ng/ml。
3.目前常见的检测林可霉素的方法有：光电法、酶联免疫吸附法、分子印迹、高效液相色谱法及荧光法等，这些方法存在着仪器设备昂贵，或样品前处理复杂，或灵敏度低，或稳定性差等缺点。因此，开发一种便捷、高效的分析方法检测水体中林可霉素的含量具有非常重要的意义。
4.电化学发光(ecl)也称为电致化学发光，结合了电化学的检测范围宽、仪器简单与化学发光的高灵敏度、重现性好、试剂稳定、控制容易。并且，还可以通过引入价格低廉且特异性强的核酸适配体链来增强传感器的抗干扰能力。ecl是在光电倍增管等光学仪器的辅助下采集发光强度图谱，建立其与待测物关系从而实现痕量分析的一种方法。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术中对林可霉素检测的不足，提供一种电化学发光体、电化学发光适配体传感器及其制备方法和应用。电化学发光体，为ucnps@au/ptca-patp纳米复合材料，是由金纳米颗粒修饰上转化纳米粒子ucnps并和巯基化苝四羧酸ptca-patp之间以金硫键结合的物质。ucnps@au与ptca-patp通过金硫键紧密结合，苝类物质具有很好的电化学活性以及很好的成膜性，金纳米粒子具有优越的导电性，可以降低发光材料与电极之间的继电势垒，上转换纳米粒子(ucnps)具有稳定的阴极信号和优异的电学光学特性，三者的结合具有较好的协同作用，可以有效提高灵敏度和强的抗干扰能力。
6.用作电化学发光适配体传感器的电化学发光体时，使得电化学发光的灵敏度和稳定性显著提高，再通过静电作用负载与待检测目标分子相适应的适配体进而获得电化学发光适配体传感器(简称apt/ucnps@au/ptca-patp/gce传感器)，可特异性识别目标分子，提高对目标分子(例如林可霉素等抗生素的检测)的选择性。
7.进一步的，金纳米颗粒修饰的上转化纳米粒子ucnps(ucnps@au)通过如下方法获得：均匀分散有上转换纳米颗粒ucnps和haucl4的乙二醇溶液，在氩气保护下于160-180℃下搅拌反应至少30min，然后在搅拌中逐渐降至室温。
8.更具体的，将y2o3、yb2o3、tm2o3分别溶于三氟乙酸中，通过密封搅拌、过滤、干燥得到白色固体(y(cf3coo)3、yb(cf3coo)3、tm(cf3coo)3)。将上述固体以一定质量比分散在油酸和1-十八烯中，真空搅拌，随后再加入含有nh4f和naoh的甲醇溶液，继续搅拌，通过离心、洗涤、干燥，制得白色固体，即ucnps。最后将ucnps与haucl4混合超声、搅拌，通过离心、洗涤、干燥，制得暗紫色固体，即ucnps@au。
9.进一步的，将金纳米颗粒修饰的上转化纳米粒子ucnps和ptca-patp分别分散在dmf中，再以质量比为1：2混合，冰水浴超声充分混合后，室温搅拌至充分结合，收集沉淀并真空干燥，得到ucnps@au/ptca-patp。
10.更具体的，将ucnps@au和ptca-patp分别分散在dmf中，形成1mg/ml的ucnps@au-dmf溶液和ptca-patp-dmf溶液，将两种溶液超声混合(m(ucnps@au)/m(ptca-patp)＝1：2)，搅拌(时间一般16h)，使两者充分反应后，通过离心、洗涤、干燥，得到产物，即ucnps@au/ptca-patp。
11.进一步的，ptca-patp的制备方法包括：将苝-3,4,9,10-四羧酸二酐、咪唑以及4-氨基苯硫酚混合，氩气保护下加热搅拌(优选100℃，3h)，冷却后分散在乙醇中，并加入一定量盐酸，继续搅拌(优选16h)，通过过滤洗涤干燥，制得ptca-patp。
12.本发明还提供了用于特异性检测林可霉素的电化学发光适配体传感器，是由含有5
′‑
cgcg tgat gtgg tcga tgcg atac ggtg agtc gcgc cacg gcta caca cgtc tcag cga-3
′
碱基序列的适配体负载于ucnps@au/ptca-patp纳米复合材料修饰的玻碳电极表面而成。
13.本发明还提供了上述用于特异性检测林可霉素的电化学发光适配体传感器的制备方法，包括如下步骤：
14.apt/ucnps@au/ptca-patp/gce传感器的制备：
15.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，移取ucnps@au/ptca-patp的超纯水分散液(1mg/ml)滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，即得到ucnps@au/ptca-patp修饰的玻碳电极；接着，将适配体滴加到ucnps@au/ptca-patp/gce的表面，适配体和ucnps@au/ptca-patp通过静电结合，再将apt/ucnps@au/ptca-patp/gce修饰电极的冰箱中放置6h-8h，即得到ecl适配体传感器。
16.最后，本发明提供了用于特异性检测林可霉素的电化学发光适配体传感器的应用方法，包括如下步骤：
17.首先配置一系列不同浓度的林可霉素标准溶液，将林可霉素用水配制成溶液，再加入含k2s2o8的pbs缓冲溶液中，得到一系列不同浓度的林可霉素标准溶液，浓度范围为1.0
×
10-15
mol/l～1.0
×
10-7
mol/l。
18.然后建立线性回归方程，将apt/ucnps@au/ptca-patp/gce传感器作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于上述一系列不同浓度的林可霉素标准溶液和所述的含k2s2o8的pbs缓冲溶液溶液中浸泡，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压700v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(e-ecl)，建立加入林可霉素前后的发光强度差值与林可霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
19.最后进行样品检测：待检样品先经过前处理(前处理主要为过滤杂质，例如取池塘水水样200ml，自然静置一段时间后，6000rpm离心10min，吸取上层清液，将其通过0.22μm滤
膜过滤)，按照上述同样的电化学发光测试条件进行测试(将滤液配制成含有0.05mol/l k2s2o8的0.1mol/l的pbs缓冲溶液(ph7.4)，取25ml所得溶液于检测池中)，记录发光强度，所得发光强度，用所得标准曲线所对应的线性回归方程计算出待检样品中林可霉素的浓度。
20.进一步的，含k2s2o8的pbs缓冲溶液的配置方法为：用ph 7.4的0.1mol/l pbs缓冲溶液配制含0.05mol/l k2s2o8的pbs缓冲溶液。
21.进一步的，电化学发光测试中光电倍增管高压700v，扫速0.1v/s，浸泡时间为35min(35min时检测值稳定)。
22.与现有技术相比，本发明取得了如下有益效果：本发明设计了一种基于上转换纳米粒子的苝类衍生物的电化学发光适配体传感器，以金硫键将ucnps@au和ptca-patp相结合，可以获得强度较大且性能稳定的电化学发光体，该发明充分利用了适配体和电化学发光传感器的优势，通过林可霉素对该体系ecl信号强度的增强的机理，实现对林可霉素的灵敏检测，本发明的检测范围为1.0
×
10-15
～1.0
×
10-7
mol/l，最低检测限为2.4
×
10-16
mol/l。本发明检测林可霉素的操作简单、选择性好、检测成本低、灵敏度高、稳定性好。
附图说明
23.图1是ptca-patp(a)、ucnps@au(b)、ucnps@au/ptca-patp(c)的扫描电镜图，ucnps@au/ptca-patp(d)的eds图。
24.图2是不同浓度林可霉素的ecl-电位曲线图。
25.其中林可霉素的浓度按曲线峰值高低从前到后依次为：1.0
×
10-15
mol/l、1.0
×
10-14
mol/l、1.0
×
10-13
mol/l、1.0
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10-12
mol/l、1.0
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10-11
mol/l、1.0
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10-10
mol/l、1.0
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10-9
mol/l、1.0
×
10-8
mol/l、1.0
×
10-7
mol/l。
26.图3是加入林可霉素前后发光强度的差值和林可霉素浓度对数的标准曲线。
27.图4是实施例1传感器对林可霉素的特异性检测。
28.图5为本发明中gce、ucnps@au/gce、ptca-patp/gce、au/ptca-patp/gce、ucnps/ptca-patp/gce及ucnps@au/ptca-patp/gce几种修饰电极的ecl-电压图。
具体实施方式
29.本发明不局限于下列具体实施方式，本领域一般技术人员根据本发明公开的内容，可以采用其他多种具体实施方式实施本发明的，或者凡是采用本发明的设计结构和思路，做简单变化或更改的，都落入本发明的保护范围。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
30.本发明下面结合实施例作进一步详述：
31.实施例中提供了一种用于特异性检测林可霉素的电化学发光适配体传感器，是由含有5
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cgcg tgat gtgg tcga tgcg atac ggtg agtc gcgc cacg gcta caca cgtc tcag cga-3
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碱基序列的适配体负载于ucnps@au/ptca-patp纳米复合材料修饰的玻碳电极表面而成，所述ucnps@au/ptca-patp纳米复合材料为上转化纳米粒子(ucnps@au)和巯基化苝四羧酸(ptca-patp)之间以金硫键结合的产物，其可以通过实施例1中记载的方法获得，具体如下：
32.实施例1：
33.(1)ucnps@au的制备：
34.首先称取0.3388g y2o3，0.2758g yb2o3，0.1158g tm2o3分别溶于14ml/8ml/4ml 50％的三氟乙酸的水溶液中，85℃条件下密封搅拌，至溶液变为澄清，滤去除不溶物，所得清液在100～120℃下，慢慢蒸干，得到白色固体，即为y(cf3coo)3、yb(cf3coo)3、tm(cf3coo)3。随后，在含有12ml油酸和15ml 1-十八烯的烧瓶中加入0.5950g y(cf3coo)3、0.3072g yb(cf3coo)3、0.0052g tm(cf3coo)3在真空条件下剧烈搅拌，将混合物在120℃下加热以除去水和氧，直至不产生气泡，并由此形成含有镧系元素-油酸盐络合物的透明溶液。然后在氩气环境下将溶液自然冷却至室温。之后，加入12ml含有nh4f(0.2963g)和naoh(0.2100g)的甲醇溶液，在50℃搅拌20min后，蒸发甲醇，然后在氩气环境下将溶液加热至300℃持续1h，然后将溶液迅速冷却至室温。通过向反应溶液中加入乙醇进行沉淀所获得的上转换纳米颗粒，最后通过9000rmp离心10min，用乙醇/环己烷(v:v＝1：1)洗涤三次，真空60℃干燥12h，得到白色固体，即ucpns。将50mg ucnps分散在10ml乙二醇中，再将含有20μm haucl4的10ml乙二醇(混合300mg pvp)与上述溶液混合，在氩气保护下加热至180℃保温搅拌30min，继续搅拌16h并逐渐降至室温，通过丙酮洗涤、离心、真空干燥，得到暗紫色固体，即ucnps@au。
35.(2)ptca-patp的制备：
36.将0.3209g苝-3,4,9,10-四羧酸二酐(ptcda)、6.1566g咪唑以及0.7850g 4-氨基苯硫酚在氩气保护下加热至100℃，搅拌3h。待反应物冷却至室温，加入100ml乙醇和300ml盐酸(2m)，继续搅拌16h，随后通过0.45μm的膜过滤器真空过滤，用超纯水洗涤至ph为中性，将固体置于真空干燥箱中，60℃干燥12h，制得酒红色固体，即ptca-patp。
37.(3)ucnps@au/ptca-patp的制备：
38.将步骤(1)和步骤(2)所制备的ucnps@au和ptca-patp分别分散在dmf中，形成1mg/ml的ucnps@au-dmf溶液和ptca-patp-dmf溶液，将两种溶液(m(ucnps@au)/m(ptca-patp)＝1：2)超声混合均匀，搅拌16h，待两者充分反应后，通过离心、洗涤、干燥，得到产物，即ucnps@au/ptca-patp。
39.(4)修饰电极apt/ucnps@au/ptca-patp/gce的制备：
40.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用，用移液枪移取5μl ucnps@au/ptca-patp的溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，即得到ucnps@au/ptca-patp修饰的玻碳电极。接着，将5μl 3μmol/l的适配体滴加到ucnps@au/ptca-patp/gce的表面，适配体和ucnps@au/ptca-patp通过静电结合，得到apt/ucnps@au/ptca-patp/gce。最后，将apt/ucnps@au/ptca-patp/gce修饰电极在4℃的冰箱中放置6-8h，即得到ecl适配体传感器。
41.识别分子apt序列为：apt:5
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cgcg tgat gtgg tcga tgcg atac ggtg agtc gcgc cacg gcta caca cgtc tcag cga-3
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(厂家为生工生物工程(上海)股份有限公司)
42.(5)标准曲线的绘制
43.将修饰电极apt/ucnps@au/ptca-patp/gce作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，将三电极体系置于一系列林可霉素浓度(1.0
×
10-15
mol/l、1.0
×
10-14
mol/l、1.0
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10-13
mol/l、1.0
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10-12
mol/l、1.0
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10-11
mol/l、1.0
×
10-10
mol/l、1.0
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10-9
mol/l、1.0
×
10-8
mol/l和1.0
×
10-7
mol/l)含有0.05mol/l的k2s2o8的
ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，浸泡35min，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压700v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录电位-发光强度曲线(e-ecl)，建立加入林可霉素前后的发光强度差值与林可霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程为：
△iecl
＝6240.1245+1243.3891lgc(mol/l)，相关系数(r)为0.9993。线性回归方程的检测范围为1.0
×
10-15
～1.0
×
10-7
mol/l，最低检测限为2.4
×
10-16
mol/l。
44.(6)样品的检测
45.取某池塘水水样，自然静置一段时间后，离心分离吸取上层溶液，通过0.22μm滤膜过滤收集滤液，加入含有0.05mol/lk2s2o8的0.1mol/l的pbs缓冲溶液调ph至7.4，取25ml所得溶液用于电化学发光分析，按照步骤(4)同样的电化学发光测试条件进行测试，记录发光强度，按步骤(5)所得的线性回归方程计算出待检测样品中林可霉素的浓度，其结果列于表1中。
46.本发明的显著优点是开发了一种检测林可霉素的电化学发光传感器及其制备方法，与普通的电化学发光传感器相比，具有以下两方面的显著优点：一是，ucnps@au与ptca-patp通过金硫键紧密结合，并在ecl中体现了两者的协同作用；二是，苝类物质具有很好的电化学活性以及很好的成膜性，金纳米粒子具有优越的导电性，可以降低发光材料与电极之间的继电势垒，上转换纳米粒子(ucnps)具有稳定的阴极信号和优异的电学光学特性。本发明充分利用了适配体和电化学发光传感器的优势，通过林可霉素对该体系ecl信号强度的增强的机理，成功实现对林可霉素的灵敏检测，该传感平台可特异性识别检测物林可霉素，具有高选择性。本发明对推广适配体传感器在水环境监测等方面的实际应用具有重要的意义。
47.并将实施例1制备的用于检测林可霉素的电化学发光传感器进步抗干扰检测，其中将适配体孵育后的工作电极分别在10-6
m环丙沙星(cip)、氯霉素(cap)、卡那霉素(kan)、金霉素(ctc)、链霉素(stp)干扰物，以及在10-8
m的林可霉素(enr)标准液中测试，并再将工作电极在上述物质的混合液中检测，检测结果见图4。
48.从图4可知，具有优异电化学性能的修饰电极上孵育适配体后对林可霉素起到选择性识别效果，混合后100倍浓度的干扰物对林可霉素的检测影响也很微小。因此该工作电极可以实现林可霉素抗干扰的选择性检测。
49.比较例1：
50.(1)ucnps@au/ptca-patp/gce修饰电极的制备
51.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用移液枪移取5.0μl 1.0mg/ml ucnps@au/ptca-patp材料的水溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到ucnps@au/ptca-patp/gce修饰电极作为电化学发光测试的工作电极。
52.(2)标准曲线的绘制
53.以ucnps@au/ptca-patp/gce修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列林可霉素浓度(1.0
×
10-15
mol/l、1.0
×
10-14
mol/l、1.0
×
10-13
mol/l、1.0
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10-12
mol/l、1.0
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10-11
mol/l、1.0
×
10-10
mol/l、1.0
×
10-9
mol/l、1.0
×
10-8
mol/l和1.0
×
10-7
mol/l)含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压
700v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录e-ecl曲线，建立加入林可霉素前后的发光强度差值与林可霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
54.(3)样品的检测
55.取25ml经处理后的池塘水加入到含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中林可霉素的浓度，其结果列于表1中。
56.比较例2：
57.(1)apt/ucnps@au/gce修饰电极的制备
58.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用移液枪移取5.0μl 1.0mg/ml ucnps@au材料的水溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到ucnps@au/gce修饰电极；在ucnps@au/gce修饰电极表面再滴涂5.0μl 3.0μm适配体(同实施例1)，在4℃的冰箱中放置6h，得到apt/ucnps@au/gce传感器，作为电化学发光测试的工作电极。
59.(2)标准曲线的绘制
60.以apt/ucnps@au/gce修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列林可霉素浓度(1.0
×
10-15
mol/l、1.0
×
10-14
mol/l、1.0
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10-13
mol/l、1.0
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10-12
mol/l、1.0
×
10-11
mol/l、1.0
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10-10
mol/l、1.0
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10-9
mol/l、1.0
×
10-8
mol/l和1.0
×
10-7
mol/l)含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压700v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录e-ecl曲线，建立加入林可霉素前后的发光强度差值与林可霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
61.(3)样品的检测
62.取25ml经处理后的池塘水加入到含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中林可霉素的浓度，其结果列于表1中。
63.比较例3：
64.(1)apt/ptca-patp/gce修饰电极的制备
65.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用移液枪移取5.0μl ptca-patp水溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到ptca-patp/gce修饰电极；在ptca-patp/gce修饰电极表面再滴涂5.0μl 3.0μm适配体(同实施例1)，在4℃的冰箱中放置6h，得到apt/ptca-patp/gce传感器，作为电化学发光测试的工作电极。
66.(2)标准曲线的绘制
67.以apt/ptca-patp/gce修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph＝7.4的0.1mol/l pbs缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列林可霉素浓度(1.0
×
10-15
mol/l、1.0
×
10-14
mol/l、1.0
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mol/l、1.0
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10-9
mol/l、1.0
×
10-8
mol/l和1.0
×
10-7
mol/l)的标准液中浸泡35min，取出后淋洗，作为工作电极，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压700v，扫速0.1v/s,进行循
环伏安扫描，记录e-ecl曲线，建立加入林可霉素前后的发光强度差值与林可霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
68.(3)样品的检测
69.取25ml的处理后的池塘水加入到含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中林可霉素的浓度，其结果列于表1中。
70.比较例4：
71.(1)au/ptca-patp/gce修饰电极的制备
72.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用移液枪移取5.0μl 1.0mg/ml au/ptca-patp材料的水溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到au/ptca-patp/gce修饰电极作为电化学发光测试的工作电极。
73.(2)标准曲线的绘制
74.以au/ptca-patp/gce修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列林可霉素浓度(1.0
×
10-15
mol/l、1.0
×
10-14
mol/l、1.0
×
10-13
mol/l、1.0
×
10-12
mol/l、1.0
×
10-11
mol/l、1.0
×
10-10
mol/l、1.0
×
10-9
mol/l、1.0
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10-8
mol/l和1.0
×
10-7
mol/l)含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压700v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录e-ecl曲线，建立加入林可霉素前后的发光强度差值与林可霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
75.(3)样品的检测
76.取25ml经处理后的池塘水加入到含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中林可霉素的浓度，其结果列于表1中。
77.比较例5：
78.(1)ucnps/ptca-patp/gce修饰电极的制备
79.将玻碳电极抛光，依次用硝酸和无水乙醇、去离子水分别超声，自然晾干待用。用移液枪移取5.0μl 1.0mg/ml ucnps/ptca-patp材料的水溶液滴于洁净的玻碳电极表面，室温干燥，得到ucnps/ptca-patp/gce修饰电极作为电化学发光测试的工作电极。
80.(2)标准曲线的绘制
81.以ucnps/ptca-patp/gce修饰电极作为工作电极，铂电极作为辅助电极，ag/agcl作为参比电极，组成三电极体系，并以含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs缓冲液为空白溶液检测发光强度，将三电极体系置于一系列林可霉素浓度(1.0
×
10-15
mol/l、1.0
×
10-14
mol/l、1.0
×
10-13
mol/l、1.0
×
10-12
mol/l、1.0
×
10-11
mol/l、1.0
×
10-10
mol/l、1.0
×
10-9
mol/l、1.0
×
10-8
mol/l和1.0
×
10-7
mol/l)含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，在-1.8～0v的电化学窗口范围内，光电倍增管高压700v，扫速0.1v/s，进行循环伏安扫描，记录e-ecl曲线，建立加入林可霉素前后的发光强度差值与林可霉素浓度对数值的线性关系，得到相应的线性回归方程。
82.(3)样品的检测
83.取25ml经处理后的池塘水加入到含有0.05mol/l的k2s2o8的ph 7.4的0.1mol/l pbs的缓冲溶液中，用于电化学发光检测，按上述步骤(2)所对应的线性回归方程计算出待检测样品中林可霉素的浓度，其结果列于表1中。
84.表1池塘水中林可霉素的测定结果
85.[0086][0087]
备注：a为三次测定的平均值
[0088]
如表1所示，样品平行检测3次，相对标准偏差小于5％，加标回收率范围为95％～101％。以上结果表明，不用ucnps@au/ptca-patp复合材料修饰而单独用ucnps@au或是ptca-patp修饰的玻碳电极后进一步组装传感元件难以检测出林可霉素，本发明的复合电极材料用于检测池塘水中的林可霉素是可行的。
[0089]
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。