检测风湿细胞外泌体源lncRNANEAT1的光电化学传感器及其制备方法和应用

检测风湿细胞外泌体源lncrna neat1的光电化学传感器及其制备方法和应用
技术领域
1.本发明属于光电化学分析技术领域，具体涉及一种检测风湿细胞外泌体源lncrna neat1的光电化学传感器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，ra)是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病。其特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，经常伴有关节外器官受累及血清类风湿因子阳性，可以导致关节畸形及功能丧失。其发病机制可能与遗传、感染、性激素等有关。 ra关节炎的病理主要有滑膜衬里细胞增生、间质大量炎性细胞浸润，以及微血管的新生、血管翳的形成及软骨和骨组织的破坏等，对患者的生活产生严重影响。因此，针对ra的研究具有重要意义。
4.外泌体(exosome)是细胞主动向胞外分泌的大小均一的囊泡样小体。不同类型的细胞可以释放出外泌体，正常生理状态下血液、尿液、乳汁和支气管灌洗液中也能分离到外泌体。其可以携带蛋白，运送rna，在细胞间物质和信息转导中起重要作用。外泌体可能通过调控免疫功能，影响疾病的进展。此外，外泌体可应用于疾病的诊断。长链非编码rna(long non-coding rna，lncrna)作为近年来研究热点，在调控细胞水平方面发挥关键作用，具有重要生物学功能，大量研究表明lncrna参与细胞分化、凋亡过程，在人类多种疾病发生发展过程中起重要作用，且与自身免疫性疾病密切相关。现有报道中指出，ra疾病活动相关的血清外泌体lncrna 风湿细胞外泌体源长链非编码lncrna neat1参与了类风湿性关节炎的病情发展，因此开展对该lncrna的检测对类风湿性关节炎的研究具有重要意义。然而，发明人发现，目前lncrna neat1标志物的检测方法还在建立中，并且目前仅局限于纯生物领域的弊端。


技术实现要素：

5.针对上述现有技术中存在的问题，本发明目的在于提供一种检测风湿细胞外泌体源lncrna neat1的光电化学传感器及其制备方法和应用。本发明成功制备出一种znco2o4nns@zn/co-zif纳米复合材料，将其作为工作电极，能够有效增强最终制备得到光电化学传感器的光电性能，从而有利于对风湿细胞外泌体源lncrna neat1的检测。基于上述研究成果，从而完成本发明。
6.为了实现上述技术目的，本发明的技术方案为：
7.本发明的第一个方面，提供一种znco2o
4 nns@zn/co-zif纳米复合材料，所述纳米复合材料采用如下方法制备得到：
8.s1、将锌盐、钴盐、氟化铵、尿素和水混合搅拌，浸入碳布，进行水热反应，洗涤干燥后冷却至室温后退火处理，制得znco2o4纳米针。
9.s2、将步骤s1制得的碳布@znco2o
4 nns浸入含有2-甲基咪唑的乙醇水溶液中，然后将混合物老化处理，将制得产物纯化后即得。
10.本发明的第二个方面，提供一种电极，所述电极为上述znco2o
4 nns@zn/co-zif纳米复合材料。所述电极其基底电极为碳布，其上负载 znco2o
4 nns@zn/co-zif复合物。
11.本发明的第三个方面，提供一种光电化学传感器，所述光电化学传感器包含上述电极。本发明的传感器具有较高的检测灵敏度、特异性、重现性和贮存稳定性。
12.本发明第四个方面，提供检测lncrna neat1浓度或存在的方法，所述方法包括：将上述电极和/或上述传感器与具有或怀疑具有待测lncrnaneat1的液体样品接触，测量lncrna neat1的响应电流强度，分析其浓度或有无。
13.上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
14.上述技术方案提出了一种检测风湿细胞外泌体源lncrna neat1的光电化学传感器及其制备方法和应用。所述znco2o4nns@zn/co-zif复合物作为光电信标物质，能够增强传感器的光电性能。所述传感器的电极选择性、灵敏度和重现性较好，电极响应快，测得线性范围5.0
×
10-1
～5.0
×
10-6
μmol/l，检测限为8.5
×
10-6
μmol/l，解决了风湿细胞外泌体源长链非编码lncrnaneat1的检测方法的策略建设问题，因此具有良好的实际应用之价值。
15.说明书附图
16.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
17.图1为本发明实施例中光电流与lncrna neat1的线性拟合曲线。
18.图2为本发明实施例中光电化学传感器的贮存稳定性结果图。
19.图3为本发明实施例中光电化学传感器的选择性结果图，其中，1为neat1， 2为sfs-exo，3为has-mir-1915-3p，4为hottip，5为neat1、sfs-exo、 has-mir-1915-3p、hottip的混合物。
具体实施方式
20.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
21.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
22.本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种znco2o
4 nns@zn/co-zif 纳米复合材料，所述纳米复合材料采用如下方法制备得到：
23.s1、将锌盐、钴盐、氟化铵、尿素和水混合搅拌，浸入碳布，进行水热反应，洗涤干燥
后冷却至室温后退火处理，制得znco2o4纳米针。
24.s2、将步骤s1制得的碳布@znco2o
4 nns浸入含有2-甲基咪唑的乙醇水溶液中，然后将混合物老化处理，将制得产物纯化后即得。
25.本发明的又一具体实施方式中，所述步骤s1中，所述锌盐、钴盐、氟化铵、尿素和水的摩尔体积比为0.5-1.0：1-2:1-2:2.5-5.0:35-70 (mol/mol/mol/mol/l)；
26.所述锌盐可以为硝酸锌，所述钴盐为硝酸钴；
27.所述混合搅拌可在室温(如25℃)条件下搅拌18-26小时；
28.所述水热反应具体条件为在110-130℃(如120℃)加热处理5-8小时；
29.所述洗涤可采用超纯水洗涤3-5次，所述干燥可选用真空干燥方式，如在50-80℃(优选60℃)干燥12-18小时，然后冷却至室温后进行退火；
30.所述退火在惰性氛围(如氩气)下进行，具体的，在300-400℃(如350℃) 条件下退火处理2-4小时。
31.所述步骤s2中，所述2-甲基咪唑在乙醇水溶液中的浓度为0.1-0.7g/ml，所述乙醇水溶液中乙醇和水的体积比为0.5-2:1，优选为1:1。
32.所述老化处理可在室温(如25℃)条件下进行。
33.所述纯化包括洗涤、干燥的步骤。具体的，所述洗涤步骤可以为使用乙醇洗涤5-8次，所述干燥步骤包括在80-90℃(如85℃)干燥20-28小时。
34.本发明的又一具体实施方式中，提供一种电极，所述电极为上述 znco2o
4 nns@zn/co-zif纳米复合材料。所述电极其基底电极为碳布，其上负载znco2o
4 nns@zn/co-zif复合物。
35.本发明的又一具体实施方式中，提供一种光电化学传感器，所述光电化学传感器包含上述电极。本发明的传感器具有较高的检测灵敏度、特异性、重现性和贮存稳定性。
36.本发明的又一具体实施方式中，上述传感器中，所述传感器包括两个或三个电极组成，相应的，所述传感器为双电极或三电极传感器。
37.本发明的又一具体实施方式中，由两个电极组成的传感器(即双电极传感器)中，所述电极为工作电极和对电极；其中，所述工作电极为上述电极。
38.本发明的又一具体实施方式中，由三个电极组成的传感器(即三电极传感器)中，所述电极为工作电极、对电极和参比电极；其中，所述工作电极为上述电极。其中，所述对电极可以为铂电极，所述参比电极可以为甘汞电极。
39.本发明的又一具体实施方式中，提供检测lncrna neat1浓度或存在的方法，所述方法包括：将上述电极和/或上述传感器与检测探针偶联，然后与具有或怀疑具有待测lncrna neat1的液体样品接触，测量lncrnaneat1的响应电流强度，分析其浓度或有无。
40.本发明中，通过edc/nhs实现探针与电极的连接，通过检测探针实现对lncrna neat1的捕获，lncrna neat1被捕获的量会影响znco2o4nns@ zn/co-zif的光致电流的强度，捕获的越多，电流下降越多，呈现函数关系。
41.在检测的过程中，进行光源照射的作用为模拟外界环境的能量光源。
42.本发明的又一具体实施方式中，光源的波长为420-440nm；进一步为 430nm；
43.所述检测探针的序列可以为5
’‑
tcccagcgtttagcacaaca-3’(seqid no.1)。
44.为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具
体的实施例详细说明本发明的技术方案。
45.实施例
46.znco2o4纳米针的制备
47.将0.5mmol zn(no3)2·
6h2o、1mmol co(no3)2·
6h2o、1mmol nh4f和 2.5mmol co(nh2)2加入35ml超纯水中，25℃下搅拌20小时，然后将混合溶液加入到衬有特氟隆的不锈钢高压釜中，浸入碳布(5cm
×
0.5cm)，然后将高压釜在120℃下加热5-8小时，取出，超纯水洗涤4次，真空中在60℃下干燥16小时，冷却至25℃，再在氩气中350℃下退火3h。
48.znco2o4nns@zn/co-zif的制备
49.将3.28g 2-甲基咪唑溶于5ml超纯水和5ml无水乙醇中，将上述得到的碳布@znco2o
4 nns浸入刚刚制备的溶液中，然后将混合物在室温下老化14h。收集的样品用乙醇洗涤数5次，85℃下干燥24h，得到碳布 @znco2o
4 nns@zn/co-zif。
50.传感器的制备与检测：
51.将znco2o4nns@zn/co-zif于0.5ml 0.1mol
·
l-1
的pbs缓冲液中在 37℃下浸泡2-4小时，取出，浸入检测探针(5
’‑
tcccagcgtttagcacaaca-3’,seq id no.1)与edc/nhs的混合物在37℃下1小时，取出，用pbs缓冲溶液和去离子水冲洗3次，后与不同浓度的lncrna neat1(5
’‑
gccttcttgtgcgtttctcg-3’,seq idno.2)在4℃下孵育2小时，后依次用pbs缓冲溶液和去离子水冲洗2-4 次，最后，将其作为工作电极与铂丝对电极、甘汞电极构成三电极体系，进行检测。在检测的过程中，进行光源照射的作用为模拟外界环境的能量光源，光源的波长为430nm。
52.基于上述光电化学传感器，通过电化学工作站记录工作电极的光电流。其对lncrna neat1具有灵敏响应，线性方程为：y＝6.86874x+56.90291，线性相关系数为0.99396，线性范围5.0
×
10-1
～5.0
×
10-6
μmol/l，检测限为 8.5
×
10-6
μmol/l。
53.如图2所示，将znco2o4nns@zn/co-zif电极在室温避光保存2-4月，在0.05mol/l葡萄糖的pbs溶液中测量，所检测的光电流响应为稳定信号，其信号为原始信号的93.5％，相对标准偏差为3.12％，结果表明，基于 znco2o4nns@zn/co-zif复合材料所制备的lncrna光电化学传感器具有良好的长期储存稳定性。
54.传感器的选择性测试是衡量传感器在复杂环境中应用潜能的重要指标。将基于znco2o4nns@zn/co-zif复合材料所制备的lncrna光电化学传感器分别与和干扰物质后，进行光电流响应测试，来检测传感器的选择性能力，其中目标检测物为neat1、干扰物质sfs-exo、has-mir-1915-3p、hottip 为与风湿疾病相关的基因片段，如图3所示，所构建的lncrna光电化学传感器检测干扰物质前后的光电流没有出现明显的衰减变化，而检测目标物 neat1和干扰物质时光电流明显衰减。因此表明，该lncrna光电化学传感器具有良好的选择性。
55.应注意的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实施例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。